JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לניתוח שיפוץ. עצם בתוך פלטפורמת מעבדה על שבב 3D מודפס התקן טעינה מכני יכול להיות מזווג עם פלטפורמת כדי לגרום אוסטאופציט המכונה מנגנון על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לכמת העצם שיפוצים שיפוץ התוצאות הפונקציונליות של אוסטאוקלנמשך ו אוסטאופאוטור/היווצרות.

Abstract

שיפוץ עצם הוא תהליך מוסדר היטב הנדרש עבור צמיחת השלד ותיקון, כמו גם הסתגלות לשינויים בסביבה המכנית. במהלך תהליך זה, מכונאי האוסטאופא רגיש לווסת את התגובות הנגדיות בין הcatabolic אוסטאוקלנמשך ו אנבוליים האוסטאופה. כדי להבין טוב יותר את מסלולים איתות מסובכים ביותר המסדירים את תהליך זה, המעבדה שלנו פיתחה מעבדה על-ידי שבב-על-a-chip (LOC) פלטפורמה לניתוח התוצאות פונקציונלי (היווצרות וריפורמציה) של שיפוץ העצם בתוך מערכת בקנה מידה קטן. כמו שיפוץ העצם הוא תהליך ממושך המתרחש בסדר של שבועות עד חודשים, פיתחנו לטווח ארוך פרוטוקולים תא culturing בתוך המערכת. אוסטאוקיים ו osteoclasts גדלו על מצעים פונקציונליים בתוך LOC ונשמר עד שבעה שבועות. לאחר מכן, השבבים היו מפורקים כדי לאפשר את כימות העצם של היווצרות וספיגת העצמות. בנוסף, עיצבנו 3D מודפס טעינת מכשיר מכני כי זוגות עם פלטפורמת LOC והוא יכול לשמש כדי לגרום התמרה מכניזציה על ידי ביטול היווצרות מטריצה הסלולר. יש לנו אופטימיזציה תא culturing פרוטוקולים עבור אוסטאופציטים, האוסטאופתיים, ו osteoclasts חזיקה בתוך פלטפורמת LOC והתייחסו חששות של עקרות ו ציטורעילות. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור בדיית ועיקור של LOC, זריעת תאים על מצעים פונקציונליים, גרימת עומס מכני, ופירוק LOC כדי לכמת תוצאות נקודת הקצה. אנו מאמינים כי טכניקות אלה מניחים את היסודות לפיתוח איבר אמיתי על שבב על שיפוץ העצם.

Introduction

עצם היא רקמה דינמית מאוד הדורשת תיאום מורכב בין שלושת סוגי התאים העיקריים: אוסטאופציטים, אוסטאופה ומחזיק מכשולים. אינטראקציות רב-תאיים בין תאים אלה אחראיות לאובדן העצם המתרחש במהלך שיתוק ובלתי ניידות ארוכת טווח ולהיווצרות העצם המתרחשת בתגובה לצמיחה ולהתעמלות. אוסטאופציטים, הסוג השופע ביותר תא העצם, הם רגישים מאוד גירוי מכני להחיל את העצם. גירוי מכני משנה את הפעילות המטבולית האוסטאופתית ומוביל לעלייה במולקולות איתות מפתח1,2. באמצעות תהליך זה, הידוע בשם מכניזציה, אוסטאופציטים יכול לתאם ישירות את הפעילויות של האוסטאופתית (תאים ויוצרים העצם) ו osteoclasts עצם ספיגת תאים). תחזוקת עצם הומאוסטזיס דורש רגולציה הדוקה בין היווצרות העצם לבין שיעורי ספיגת העצם; עם זאת, שיבושים בתהליך זה יכול לגרום למצבי מחלה כגון אוסטאופורוזיס או אוסטאופאואטזיס.

המורכבות של אינטראקציות בין שלושת סוגי התאים האלה משאיל את עצמה היטב לחקירה באמצעות microfluidic ומעבדה-על-שבב (LOC) טכנולוגיות. לשם כך, המעבדה שלנו הקימה לאחרונה הוכחת המושג של פלטפורמת LOC לניתוח ספיגת עצם והיווצרות (תוצאות פונקציונליות) בתהליך שיפוץ העצם. הפלטפורמה יכולה לשמש לחקר אינטראקציות סלולריות, שינוי סביבות טעינה, והקרנת תרופות למחקר. בשנים האחרונות, התקנים מיקרופלואידיג שונים פותחו לחקירת מסלולים איתות מולקולרי המסדירים שיפוץ העצם; עם זאת, רבים של מערכות אלה לכמת שיפוץ באמצעות סמנים עקיפים הרומז על פעילות תפקודית3,4,5,6,7. יתרון של המערכת שלנו היא כי הוא יכול לשמש לכימות ישיר של תוצאות פונקציונליות. שיפוץ עצם הוא תהליך ארוך טווח. ככזה, כימות ישיר של ספיגת עצם והיווצרות דורש מערכת culturing שניתן לשמור למינימום של מספר שבועות עד חודשים8,9,10,11. כך, בעת פיתוח פלטפורמת LOC, הקמנו פרוטוקולים לטווח ארוך culturing הדרושים להיווצרות וספיגת התאים ושמרו על תאי המערכת במשך עד שבעה שבועות11. בנוסף, אנו שולבו מצעים culturing המתאים לשני סוגי תאים לתוך הפלטפורמה; האוסטאופיויום היו מתורבתים ישירות על העצם, והאוסטאופאוקות, אשר ידועים כחסיד מפלסטיק, היו מתורבתים בדיסקים פוליסטירן. יתרה מזאת, הגענו לסוגיות הנוגעות לעקרות, רעילות לטווח ארוך ופירוק השבב לניתוח שיפוץ11,12.

פלטפורמת LOC יכול לשמש גם כדי לגרום להאצלת מכניציט באמצעות דפורמציה מטריצה. 3D מודפס התקן טעינה מכני פותחה לזוג עם LOC ולהחיל סטטי מתוך distention המטוס כדי למתוח את התאים13. כדי להכיל עומס מכני זה, העומק של הבאר בתוך LOC היה גדל. זה בקנה מידה קטן, מכשיר פשוט טעינה מכני יכול להיות מיוצר בקלות על ידי מעבדות עם ניסיון הנדסי מוגבל, ויש לנו שיתוף בעבר ציורים של רכיבים תלת-ממדיים מודפסים13. בעבודה הנוכחית, אנו מדגימים כמה טכניקות הרומן הדרוש לשימוש מוצלח של LOC. באופן ספציפי, אנו מדגימים הייצור שבב, התאים זריעת על מצעים פונקציונליים, העמסה טעינה מכני שבב עבור שיפוץ כימות. אנו מאמינים שההסבר לטכניקות אלה מפיקים תועלת מתבנית חזותית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מסיכת שבב

הערה: שלבים 1.1-1.3 יש לבצע רק פעם אחת על קבלת הקבלה הראשונית של מסיכת השבב. הם מבטיחים שהמסיכה אינה משתחווה במהלך השימוש. העיצוב של המסכות המיקרופלואידיג תיאר בעבר11,14. מסכות תוכננו בתוך הבית מסחרי מפוברק באמצעות סטריאואוליתוגרפיה ברזולוציה גבוהה (איור 1א).

  1. מכסים את המשטח העליון של המסכה עם ציפוי פלסטיק כדי להגן על פני השטח הזה מפני דבק. לאבטח את מסיכת השבב גיליון אקרילי במידה שווה באמצעות דבק ספריי. הצמד את החלקים יחד ללילה כדי לאפשר דבק כדי לרפא במלואו. לאחר ההדבקה יבש, הסירו את יריעות הפלסטיק מראש המסיכה.
  2. הצמד את החלק התחתון של גיליון אקרילי לתיבת החלקה מודפסת תלת-ממדית (איור משלים 1, קבצים משלימים 1-4) באמצעות קלטת דו-צידית. לחץ בחוזקה כדי להבטיח קשר הדוק.
  3. אטום את כל הפתחים הקטנים ליד הקיר ההסרה של תיבת ההחלקה עם איטום עמיד למים. הניחו לחומר האיטום להירפא 24 שעות ביממה.
  4. נקו את המשטח של המסכה עם 70% אתנול (אטוח). הצב את תיבת ההחלקה עם מסיכת השבב הרצויה בתנור. השתמש מד דיגיטלי כדי להבטיח את החלק העליון של המסיכה היא רמה. כוונן את בורגי ההחלקה במידת הצורך.

2. ייצור PDMS

הערה: עיצוב שבבים רדוד (1 מ"מ) משמש לפעילות פונקציונלית (היווצרות וספיגת מבנה), ועיצוב שבבי היטב (10 מ"מ) משמש ללימודי העמסה מכנית. החלק התחתון של הבאר הוא נוצר על ידי הצמדת קרום PDMS דק נפרד (איור 1B).

  1. שכבת מכסה (שכבה 1)
    1. לשלב 63 g של PDMS prepolymer ו 6.3 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) בגביע פלסטיק. מערבבים ביסודיות עם מרית תא חד פעמית ודגה desiccator ואקום עבור 30 דקות.
    2. יוצקים באיטיות את התערובת לתוך תיבת ההחלקה המוכנה. תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
    3. שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מעבדה מחודדות ולהסיר את הגיליון פולימר מתוך החלקה תיבת.
    4. חותכים את העפעפיים הבודדים לגודל (70 מ"מ x 34 מ"מ) באמצעות אזמל ותבנית מודפסת תלת-ממדית.
    5. פונץ ' הגישה חורים דרך כל מכסה עם אגרוף ביופסיה (קוטר 1 מ"מ).
    6. פני השטח מנקים את העפעפיים בנייר אריזה.
      הערה: אם לא נעשה שימוש בעפעפיים באופן מיידי, השתמש בנייר אריזה ואחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).
  2. ובכן ושכבת מיקרו-ערוצים (שכבה 2)
    1. לשלב את הסוכן הפרפולימר PDMS ו אשפרה (10:1 יחס) בספל פלסטיק. העיצוב רדוד היטב דורש 43 g של prepolymer ו 4.3 g של ריפוי הסוכן, ואת העיצוב עמוק-היטב דורש 227 g של prepolymer ו 22.7 g של ריפוי סוכן. מערבבים את הפולימר במרץ ודגה עבור 30 דקות.
      הערה: זה מניח ממד מסכה של 152.4 מ"מ x 152.4 מ"מ.
    2. יוצקים באיטיות את התערובת על-פני מסיכה מתאימה שלפני החלקה. תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
    3. שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מעבדה מחודדות ולקלף בזהירות את הפולימר הרחק מן המסכה. השתמש בתבנית מודפסת של אזמל ותלת-ממד כדי לגזור אסימונים בודדים.
      הערה: עבור מחקרים העמסה חשוב כי מידות שבב (70 x 34 מ"מ) הם מדויקים, כי הבאר ממוקם במרכז השבב.
    4. פני השטח לנקות את PDMS עם נייר אריזה.
      הערה: אם לא נעשה שימוש באסימונים באופן מיידי, עטוף כל שבב בנייר אריזה ומאחסן ב-RT.
  3. קרום PDMS דק (שכבה 3)
    הערה: שכבה זו משמשת רק לעיצוב העמוק.
    1. הוסף 12.7 g של PDMS prepolymer ו 1.3 g של ריפוי סוכן (10:1 יחס) לגביע פלסטיק. מערבבים במרץ ודגה עבור 30 דקות.
    2. לאט למזוג פולימר לתוך מוכן תיבת החלקה ולגרד ביסודיות גביע פלסטיק כדי להסיר את PDMS הרבה ככל האפשר.
    3. השתמש מרית התא כדי לפזר PDMS על פני השטח כולו.
      הערה: אם הפולימר אינו מתפשט באופן ידני, מתח פני השטח יהיה מספיק כדי למנוע את הפולימר להרכיב סדין אחיד.
    4. תן PDMS לשבת 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 45 ° c עבור 18 h.
    5. שחרר את הקצוות של PDMS עם מרית מחודדות ובזהירות להסיר את גיליון PDMS מתיבת ההחלקה. חותכים קרומים בודדים המתאימים לממדים של שכבה 2.
    6. מדוד את עובי הקרום במרכז הקרום באמצעות מחוגות. להיפטר כל הקרומים הנמצאים מחוץ לעובי הרצוי (0.5 מ"מ ± 0.1 מ"מ).
    7. ממברנות נקי בזהירות עם נייר אריזה ומקום על פיסת סרט פרפין.
      הערה: אם הקרומים אינם משמשים באופן מיידי, יש לכסות את החלק העליון של הקרום בנייר אריזה ולאחסן ב-RT.

3. מצעים לפעילות פונקציונלית

הערה: יש לצרף לחלק התחתון של הבארות דיסקים ומוצרי פוליסטירן שישמשו עבור מחוז אוסטאופא ובתרבויות האוסטאואחרונות, בהתאמה.

  1. פוליסטירן מוקצף (איור 1ג)
    1. מניחים קלטת מיסוך בצד האחורי של תרבית רקמה מטופלת שמיכות קלקר. חותכים דיסקים עגולים מתוך שמיכות באמצעות שעם מחודד-borer (קוטר 5.4 מ"מ). יש לטבול את הדיסקים ב-70% אטוח ולעזוב את הלילה.
    2. שפשפי בעדינות את המשטח העליון של הדיסק עם מחבר כותנה משופעת שספוגה ב 70% אטוח. ודא שהקצה החיצוני של הדיסק מתנקה ביסודיות.
    3. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להחזיק את הדיסק ולהסיר את הגיבוי קלטת המסיכה. מניחים את הדיסק מטופל בצד למטה ולנקות את הצד האחורי עם מחבר כותנה משופעת.
    4. טובלים את קצה העץ של המוליך כותנה משופעת לתוך תערובת מנטרול של PDMS לא נרפא והמקום כמות קטנה של פולימר בחלק התחתון של הטוב הרצוי.
      הערה: ניתן לאחסן את PDMS שנותר בלתי נרפא ב-20 ° c.
    5. מניחים את הקלקר, מטופלים כלפי מעלה, לתוך הבאר ומקישים בעדינות על הדיסק בעזרת ספוגית כותנה. ודא ש-PDMS שלא נרפא מגיע במגע עם הצד המטופל של הדיסק.
      הערה: אם PDMS מגיע במגע עם המשטח המטופל של הדיסק, הסר את הדיסק מ3.1.4 היטב וחזור על השלבים הבאים וה3.1.5 עם דיסק חדש.
    6. תן השבב לשבת על משטח רמה עבור 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 65 ° c עבור 4 h.
  2. מוצרי עצם
    1. השתמש מלקחיים למקום וופל העצם (6 מ"מ קוטר, 0.4 מ"מ עבה) בחלק התחתון של צלחת 100 מ"מ. להחזיק את וופל קבוע עם מלקחיים ולחרוט בעדינות ' X ' על גבו של וופל עם אזמל.
      הערה: במהלך תהליך הדימות, האיקס משמש להבחנה בין החלק האחורי של הפרוסת לבין המשטח שעליו הופרה התאים.
    2. השתמש בקצה העץ של המוליך כותנה משופעת כדי להוסיף כמות קטנה של PDMS לא נרפא לתחתית הבאר הרצויה. מניחים את העצם וופל, מסומן בצד למטה, לתוך הבאר ולהשתמש המוליך כותנה ללחוץ על הופל.
    3. תן השבב לשבת על משטח רמה עבור 30 דקות ולאחר מכן אופים ב 65 ° c עבור 4 h.

4. הרכבת שבב ועיקור

  1. הפעל את משטחי שכבה 1 ושכבה 2 עם מנקה פלזמה עבור 30 s באמצעות תדר רדיו בינוני (RF) הגדרת צריכת חשמל (שווה ערך ל-10.2 W).
  2. יישר את חורי הגישה בשכבה 1 עם המיקרו-ערוצים בשכבה 2 והחזק את שתי השכבות יחד בחוזקה.
  3. לעיצוב עמוק, חזור על שלב 4.1 עם שכבה 2 ושכבה 3. במהלך הטיפול בפלסמה, השתמש בקלטת דו צדדית כדי לחבר את סרט הפרפין של שכבה 3 למשטח שטוח.
  4. השתמש באזמל כדי לקצץ את החומר העודף מקרום PDMS. לקלף בזהירות את הסדין של סרט פרפין מהחלק התחתון של השבב
  5. אופים את השבב ב 65 ° c עבור 10 דקות כדי להגדיל את עוצמת הקשר בין שכבות PDMS.
  6. הוסף עצות לחילוק בזווית (18 מד, 0.5 בתוך, 90 °) לתוך חורים גישה במכסה. מאבטח את הטיפים מחלקים למכסה עם אפוקסי שני חלקים. השתמשו בעצת מיקרופיפטה כדי למרוח את האפוקסי סביב כל קצה.
  7. לאחר האפוקסי נרפא לחלוטין, פני השטח לנקות את השבב עם 70% אטוח ומקום בתוך הקבינט אבטחה טיחות. בצע את כל השלבים הבאים בתוך הקבינט אבטחה טיחות.
  8. לחבר מזרק 5 מ ל לטיפים לחילוק עם אבובים סיליקון סטרילי (1/32 ' ' ID, ~ 10 ס מ אורך) ולמלא את השבב כולו עם 70% אטוח עבור לפחות 30 s. לעיצוב רדוד, לנהל את כל הנוזלים עם משאבת מזרק להגדיר שיעור הזרימה של 4 מ ל/h. עבור העיצוב העמוק, יש לנהל את כל הנוזלים על ידי שליטה איטית של המזרק ביד.
  9. ולעקר את השבב עם אור UV בלילה.
  10. שטוף את השבב 3 פעמים עם dH2o. מלא את השבב עם dh2o, להסיר אבובים מן הטיפים לחילוק ו הדגירה עבור לפחות 48 h ב 37 ° c.

5. הרכבה מכנית של מכשיר העמסה

הערה: תהליכי העיצוב והייצור עבור מכשיר הטעינה המכני המודפס תלת-ממדי (איור 2א-ג) תוארו בעבר וכל קבצי העיצוב עבור רכיבים מודפסים סופקו בעבר13.

  1. התקן את כל הרכיבים של מכשיר הטעינה במשך 30 דקות ב-121 ° c.
    הערה: כדי למנוע עיוות של רכיבים מודפסים, עטוף כל חתיכה בנפרד בנייר כסף ומניחים על משטח שטוח וקשה במהלך תהליך האוטוקלינג. ניתן לעטוף את חומרת המתכת ביחד. השלם את כל השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגי.
  2. מניחים קפיץ דחיסה סביב הפיר של דיו ולהכניס את דיו לתוך החור המרכזי בתחתית הבסיס (איור 2ד).
  3. חבר את בלוק החיוג לתחתית הבסיס באמצעות ארבעה ברגים עם הקשה עצמית.
  4. מניחים מעיין דחיסה שנייה סביב הבורג המרכזי. הכנס את הבורג לתוך חור בצורת משושה בתחתית החיוג ובורג את ההרכבה לתוך החור המשורשרת במרכז בלוק החיוג.
  5. לעזאזל עם ארבעת הנשים. האלה בתחתית הבסיס
  6. הסר את המרווח מהמכשיר על ידי הפיכת החוגה לנגד כיוון השעון עד שראש הפלטאן נמצא מתחת לראש הבסיס. ואז לאט להפוך את החיוג בכיוון השעון עד החלק העליון של דיו הוא ברמה עם החלק העליון של הבסיס.

6. ניסויים

הערה: פרוטוקולים לניסויים בפעילות פונקציונלית סופקו בעבר11,12.

  1. מחקרי העמסה (איור 3)
    1. לאחר שלב 4.9, השתמש במזרק של 5 מ"ל כדי להסיר את dH2O משבב הבאר העמוק. לחלוק את החלק התחתון של הבאר עם 200 μL של 0.15 mg/mL סוג אני קולגן (CTI) ב 0.02 M חומצה אצטית עבור 1 h.
    2. שטפו את השבב שלוש פעמים עם תמיסת מלח מוזרמת פוספט באגירה עם סידן ומגנזיום (DPBS + +).
    3. שבב מקום למחזיק שבב וזרע עם MLO-Y4 אוסטאופציטים בצפיפות של 2 x 104 תאים/mL בינוני חיוני אלפא מינימלי (mlo) שיושלם עם 5% סרום עגל, 5% סרום העוברי העובר, ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    4. להסיר את הצינורות מתוך טיפים לחילוק ולמקם את השבב לתוך תבשיל תרבות עמוקה (150 מ"מ x 25 מ"מ). התאים הדגירה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h.
    5. לצרף צינורות סטרילי כדי לחילוק טיפים ולהשתמש מזרק 5 מ ל כדי להסיר את המדיום התרבות המושקע מן השבב. באיטיות לוותר בינוני בתרבות טרי כדי למלא את השבב.
    6. הנח את מחזיק השבב לתוך הכניסה המלבנית בחלק העליון של בסיס התקן הטעינה. להאכיל את אבובים דרך החריצים הממוקמים על מכסה ההתקן טעינת ולאבטח את המכסה לבסיס עם ארבעה ברגים ראש פאן ואגוזים hex.
      הערה: כדי לוודא שהמכסה נשאר ברמה, יש לאבטח תחילה שני ברגים הממוקמים באלכסון אחד מהשני לפני אבטחת שני הברגים הנותרים.
    7. החל טעינה על התאים על-ידי הפעלת החוגה בכיוון השעון עד להגעת הפלט הרצוי.
      הערה: המכשיר מתוכנן כך סיבוב אחד של החיוג משווה העקירה דיו של 1 מ"מ. שדה הנבג שנוצר בחלק העליון של קרום pdms היה מעוצב בעבר כפונקציה של הזחה דיו באמצעות ניתוח אלמנט סופי (שמציעות)13.
    8. מניחים את התקן הטעינה לתוך תיבת קצה מיקרופיפטה ריקה P1000. מודחלת את התאים עם טעינה שהוחלו עבור 15 דקות.
      הערה: תקופת זמן הטעינה שבשימוש כאן משמשת כדוגמה. ניתן להשתמש בזמני טעינה חלופיים.
    9. לאחר הדגירה, להסיר את העומס מהתאים על ידי הפעלת חיוג נגד כיוון השעון עד דיו חוזר לתנוחת ההתחלה המקורית. הסירו את המכסה מהמכשיר והניחו את מחזיק השבב לתוך לוחית התרבות העמוקה. מודיית את התאים עבור תקופה התאוששות העומס 90-min.
      הערה: שוב, תקופת זמן ההחלמה המשמשת כאן משמשת כדוגמה. ניתן להשתמש בזמני התאוששות חלופיים. עבור לימודים לטווח ארוך, להאכיל את התאים כל 72 h.
    10. השתמש במזרק של 5 מ"ל כדי להסיר את המדיום הממוזג מהשבב.
      הערה: ניתן לשמור ולאחסן במדיום זה ב-80 ° c.
    11. הסר את השבב ממחזיק השבב ולהשתמש מרית מחודדות לשבור את הקשר בין מכסה PDMS ושכבה היטב.
      הערה: ניתן לבצע כעת הסלולר בעקבות כל פרוטוקול שנקבע לצלחת תרבות התא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התצורה הרדודה-היטב ניתן להשתמש כדי לנתח את הפעילות הפונקציונלית של האוסטאופיואולים והאוסטאופה. היווצרות העצם דרך אוסטאופתיים וספיגת העצמות באמצעות osteoclasts דורש פעמים culturing על הסדר של מספר שבועות עד חודשים. היווצרות העצם מ MC3T3-E1 הטרום האוסטאופה היה ככמת באמצעות אליזרין אד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר זה מתאר את היסודות עבור בדיית העצם שיפוצים LOC פלטפורמה עבור culturing אוסטאופציטים, אוסטאופתיים ומחזיק מכשולים. על ידי שינוי עומק וגודל של הבאר בתוך השבב, תצורות מרובות פותחו עבור מגרה אוסטאופציטים עם עומס מכני ובדיקת תוצאות פונקציונליות של שיפוץ העצם (איור 1B).

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט Nos. (CBET 1060990 ו-EBMS 1700299). כמו כן, חומר זה מבוסס על העבודה הנתמכת על-ידי תוכנית המלגות למחקר בוגר קרן המדע הארצי תחת גרנט No. (2018250692). כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות המתבטאת בחומר זה הן של המחברים והן אינן משקפות בהכרח את השקפות הקרן הלאומית למדע.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylic sheetOptix--3.175 mm thick
Angled dispensing tipsJensen GlobalJG18-0.5X-90Remove plastic connector prior to use
Biopsy punchRobbins InstrumentsRBP-101 mm diameter
Bone wafersBoneslices.com0.4 mm thickBovine cortical bone
Bovine calf serumHycloneSH30072
CalipersGlobal IndustrialT9F534164
Cell spatulaTPP99010
Chip maskProtoLabsCustom-designedPrint material: Accura SL 5530
Cork borerFisher Scientific07-865-10B
Cotton tipped applicatorPuritan806-WCL
Culture dish (100 mm)Corning430591Sterile, Non-tissue culture treated
Culture dish (150 mm)Corning430597Sterile, Non-tissue culture treated
Double sided tape3M CompanyScotch 237
Fetal bovine serumHycloneSH30910
ForcepsFisher Scientific22-327379
Leveling boxCustom-made--3D printed
Masking tape3M CompanyScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
Mechanical loading deviceCustom-made--3D printed
Minimum essential alpha mediumGibco12571-063
MLO-Y4 osteocytes----Gift from Dr. Lynda Bonewald
Packaging tapeDuck Brand--Standard packaging tape
Paraffin filmBemis ParafilmPM999
Penicillin/streptomycinInvitrogenp4333
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-001Expanded plasma cleaner
Polydimethylsiloxane kitDow CorningSylgard 184
Polystyrene coverslipsNunc Thermanox174942Sterile, tissue culture treated
OvenQuincy Lab12-180
RAW264.7 preosteoclastsATCCTIB-71
ScalpelBD Medical372611
Silicone tubingSaint-Gobain TygonABW00001ID: 1/32" (0.79 mm), OD: 3/32" (2.38 mm)
SolidWorks softwareDassault Systèmes--Used to generate 3D printed models and perform FEA
Spray adhesiveLoctite2323879Multi-purpose adhesive
Syringe (5 ml)BD Medical309646Sterile
Syringe pumpHarvard Apparatus70-2213Pump 11 Pico Plus
Tapered laboratory spatulaFisher Scientific21-401-10
Two-part expoxyLoctite13953915 minute quick set
Type I collagenCorning354236Rat tail collagen
Vacuum desiccatorBel-ArtF42010-0000
Waterproof sealantGorilla8090001100% silicone sealant

References

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved