JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

השתמשנו בפרוטוקול דגימה גיאולוגי (coring) כדי להשיג דגימות עצם קליפת המוח בגודל אחיד לניסויי SRμCT מההיבט הקדמי של הפמורה האנושית. שיטה זו היא הרסנית מינימלית, יעילה, גורמת לדגימות גליליות הממזערות את ממצאי ההדמיה מצורות מדגם לא סדירות ומשפרות את ההדמיה והניתוח המיקרו-ארכי-ארכיאולוגיים.

Abstract

עצם היא רקמה דינמית ופעילה מכנית שמשתנה במבנה לאורך תוחלת החיים האנושית. המוצרים של תהליך שיפוץ העצם נחקרו באופן משמעותי באמצעות טכניקות דו מימדיות מסורתיות. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הדמיית רנטגן באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו-שולחנית (μCT) וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרינת סינכרוטרון (SRμCT) אפשרו רכישה של סריקות תלת מימדיות (3D) ברזולוציה גבוהה של שדה ראייה גדול יותר (FOV) מאשר טכניקות הדמיה תלת-ממדיות אחרות (למשל, SEM) המספקות תמונה מלאה יותר של מבנים מיקרוסקופיים בתוך עצם המוח האנושית. הדגימה צריכה להיות ממורכזת במדויק בתוך FOV, עם זאת, כדי להגביל את המראה של חפצי פס ידוע להשפיע על ניתוח נתונים. מחקרים קודמים דיווחו על רכש של בלוקי עצם מלבניים בצורה לא סדירה שתוצאתם היא ממצאי הדמיה עקב קצוות לא אחידים או חיתוך תמונה. יישמנו פרוטוקול דגימה גיאולוגי (coring) כדי להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי עבור ניסויים SRμCT מההיבט הקדמי של femora האנושי. שיטת coring זו יעילה והרסנית מינימלית לרקמות. היא יוצרת דגימות גליליות אחידות המקטינות את ממצאי ההדמיה מטבעם של איזומטריות במהלך הסיבוב ומספקות אורך נתיב אחיד לקרני רנטגן לאורך הסריקה. עיבוד תמונה של נתונים טומוגרפיים רנטגן של דגימות cored בצורה לא סדירה מאשר את הפוטנציאל של הטכניקה כדי לשפר את ההדמיה וניתוח של מיקרוארכיטקטורה עצם קליפת המוח. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה אמינה וחוזרת על עצמה להפקת ליבות עצם קליפת המוח הניתנת להתאמה לסוגים שונים של ניסויים בהדמיית עצם ברזולוציה גבוהה. מטרת העל של העבודה היא ליצור רכש עצם קליפת המוח סטנדרטי עבור SRμCT כי הוא סביר, עקבי, וישיר. הליך זה עשוי להיות מותאם עוד יותר על ידי חוקרים בתחומים קשורים אשר בדרך כלל להעריך חומרים מרוכבים קשים כגון אנתרופולוגיה ביולוגית, מדעי הרוח, או מדעי החומר.

Introduction

עם ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, כעת ניתן לרכוש נתוני הדמיית רנטגן ברזולוציה גבוהה מאוד. מערכות מיקרו-CT (μCT) שולחניות הן התקן הנוכחי להדמיה מבטלת עצם בשל אופין הבלתי הרסני1. עם זאת, בעת הדמיה של תכונות מיקרו-מבניות של עצם קליפת המוח, השימוש במיקרו-טקט היה מוגבל יותר. בשל אילוצי רזולוציה, מערכות שולחן עבודה אינן יכולות להשיג את הרזולוציה הנדרשת כדי לצלם תכונות מיקרו-מבניות קטנות יותר מנקבוביות קליפת המוח, כגון לקונה אוסטאוציט. עבור יישום זה, SRμCT הוא אידיאלי בשל הרזולוציה הגדולה יותר של מערכות אלה1. לדוגמה, ניסויים במקור האור הקנדי (CLS) על קווי ההדמיה והטיפול הביו-רפואי (BMIT)2 יצרו תמונות עם voxels קטן כמו 0.9 מיקרומטר. מחקריםקודמים 1,3,4,5 השתמשו ברזולוציה זו כדי להשיג תחזיות ולאחר מכן תלת מימדי (3D) עיבודים מדגימות עצם קליפת המוח מעצמות אדם ארוכות ( איור1) כדי לכמת צפיפות lacunar osteocyte4,6,7,8,9 וריאציה בצורת לקונה וגודל3 על פני תוחלת החיים האנושית ובין המינים. מחקרים נוספים הראו את נוכחותם של רצועות אוסטאון בבני אדם10, תופעה שהוכרה בעבר כמזוהה רק עם יונקים לא אנושיים בספרות האנתרופולוגית המשפטית.

על מנת להשיג רזולוציה יוצאת דופן, קרן הרנטגן חייבת להיות ממוקדת דק בתוך שדה הראייה (FOV), אשר לעתים קרובות מגביל את גודל הדגימה המרבי לכמה מילימטרים בקוטר. נכון לעכשיו, לא היו נהלים מקיפים ומתוקננים המתוארים בספרות המתארים רכש מדגם עצם העומדים במגבלות אלה. מרכוז דגימות בתוך FOV הוא קריטי כדי להבטיח כי 1) המדגם נשאר ממורכז כפי שהוא מסתובב 180 ° במהלך ההדמיה, ו 2) ממצאי סריקה מוגבלים מאז אין חיתוך תמונה. במילים אחרות, אין חלקים של המדגם מחוץ FOV להפריע הקרן הזנת המוקד שלה בתוך FOV. במקרה כזה, אלגוריתם השחזור נשלל מחלק מנתוני ההפחתה הדרושים לשחזור נכון לחלוטין. ראוי עוד לציין כי 360 ° (סיבוב מלא) סריקות למזער את ההשפעות של התקשות קרן אבל להגדיל חפצים שנגרמו על ידי אי התאמות ותנועה מדגם במהלך ההדמיה. לכן, בעוד שסריקה של 360° בדרך כלל תיצור נתונים נקיים יותר, זמן ההדמיה יוכפל ולכן יש לטפל בפשרה בין עלות הניסוי לאיכות הנתונים.

היבט חשוב ולעתים קרובות מתעלמים מניסויי הדמיית עצם הוא טכניקת הכנת הדגימה המדויקת והמשכפלת המבוצעת לפני הסריקה. מחקרים המשלבים שיטות SRμCT בניסויים שלהם מזכירים בקצרה את פרוטוקול הדגימה שלהם, אך המחברים מספקים מעט מאוד פרטים לגבי המתודולוגיה המסוימת המשמשת לאיסוף הדגימות שלהם. מחקרים רבים כאלה מזכירים חיתוך קוביות עצם מלבניות של ממדים שרירותיים, אך בדרך כלל אינם מספקים מידע נוסף על הכלים או חומרי ההטבעה המשמשים3,4,10,11,12,13,14. חוקרים מסוימים משתמשים בדרך כלל בכלים סיבוביים כף יד (למשל, דרמל) כדי להסיר בלוקים מליניאריים של עצם מאזור עניין (ROI)3,4,10,11,12,13,14. שיטה זו גורמת לדגימות בגודל לא אחיד שעשויות להיות גדולות יותר מה- FOV, מה שמגדיל את הסבירות של ממצאי סריקה וחיתוך תמונה. דגימות כאלה דורשות לעתים קרובות זיקוק נוסף באמצעות מסור מדויק של וופל יהלומים (למשל, Buehler Isomet). השגת דגימות עם ממדים עקביים (עד מאתיים/מ"מ) היא קריטית כדי להבטיח שערכות הנתונים הנרכשות הן באיכות הגבוהה ביותר והתוצאות הבאות ניתנות לשכפול.

הדיווח המוגבל על מתודולוגיית הרכש לדוגמה מוסיף שכבה נוספת של קושי בעת ניסיון להפעיל ו/או לאמת שיטות שבוצעו במחקר קודם. נכון לעכשיו, החוקרים חייבים ליצור קשר עם המחברים ישירות לקבלת פרטים נוספים על הליכי הדגימה שלהם. הפרוטוקול המפורט כאן מספק לחוקרים ביו-רפואיים טכניקת דגימה מתועדת ביסודיות, שכפול וחסכונית. המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק הדרכה מקיפה לגבי איך להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי באמצעות מכבש טחנה קידוח קצת coring יהלום עבור הדמיה מדויקת והפקת נתונים מיקרו ארכיאולוגיים. שיטה זו משתנה מהליכים המשמשים לאיסוף צילינדרים אחידים בקוטר קטן (1-5 מ"מ) מבלוקים של חומרים קשים במכניקת סלע בלחץ גבוה15,16,17,18,19.

Protocol

כל הדגימות הגיעו מתורמים קדמיים חנוטים באוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי החיים והאוניברסיטה הרפואית של צפון מזרח אוהיו (NEOMED), בהסכמה מדעת של התורם עצמם או קרובי המשפחה של התורם. ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת אקרון להגנה על נבדקים אנושיים (IRB) קבעה כי דגימות אלה פטורות מביקורת מלאה של IRB מכיוון שהן לא הושגו מאנשים חיים. מידע דמוגרפי כולל גיל, מין וסיבת מוות היה זמין לכל התורמים. האנשים שנבחרו לא תיעדו מצבים המשפיעים על העצמות ולא חשיפה למשטרי טיפול שאולי השפיעו על שיפוץ העצם בזמן המוות. דגימות עצם קליפת המוח התקבלו femora של זכרים ונקבות מודרניים cadaveric עם גילאים הנעים בין 19 ל 101 שנים של גיל (ממוצע = 73.9 שנים). מידשפט הירך נחקר בהרחבה כולל בדיקות של וריאציה נקבוביות קליפת המוח20,21,22,23,24 וצפיפות החומר של רקמתהעצם 25,26,27, ובכך הפך לאתר נפוץ לניתוחים מיקרו-מבניים.

1. רכש רקמות וקירור

  1. השתמש מסור מתנדנד מצויד להב קרביד חיתוך צלילה (עבור חומרים מרוכבים) כדי להשיג ~ 7.5 ס"מ בלוקים עצם מאמצע diaphyses של הפמורה השמאלית.
  2. משרים קוביות ירך בצלחת זכוכית בטוחה לתנור במילוי אנזים פרוטאז אבקת ותמיסת מי ברז למשך שעה באינקובטור שנקבע על 45 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר הדגירה, להסיר בזהירות את כל הרקמות הרכות שנותרו periosteum באמצעות ניתוח בוטה או כלי שיניים.
    הערה: הימנע משימוש בכלים חדים (למשל, אזמל) להסרת רקמות רכות. מכשירים כאלה עלולים לגרום נזק לעצם כי הוא לזיהוי בסריקות μCT, המשפיעים על שימור דגימה ואיכות נתונים סריקה.
  4. הסר פסולת או חסימות בחלל medullary על ידי הצבת בלוקים עצם מנקה קולי במשך 5-10 דקות עם 20:1 חלקים מי ברז לפתרון ניקוי (ראה טבלה של חומרים)או באמצעות חוט מים כף יד (למשל, Waterpik).
  5. לטבול את בלוק העצם ב דגימה ולמלא עם 70% אתנול. אפשר את העצם להשרות לפחות 24 שעות כדי להסיר שומנים.
    הערה: Xylenes עשוי לשמש גם להסרת שומנים. השרייה ממושכת בקסילנים, לעומת זאת, עלולה להפוך את העצם לשבירה או גירית מכיוון שהיא מתחלבת.
  6. לאחר 24 שעות, להסיר בלוקים עצם מאתנול ולאפשר אוויר יבש בטמפרטורת הסביבה במשך 24-48 שעות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. חתך רקמות

  1. מניחים שקופית מיקרוסקופ זכוכית 75 x 25 מ"מ על צלחת חמה להגדיר 140 מעלות צלזיוס. ממיסים כמות נדיבה של שאריות אפוקסי תרמיות (ראה טבלת חומרים)במרכז השקופית.
    1. אם מכינים חלקים דקים נוספים למיקרוסקופיה (<50 מיקרומטר), ייתכן שיהיה צורך להטמיע את בלוק העצם באפוקסי בשני חלקים כדי לשמר טרבקולה. כמו כן, בעת יישום פרוטוקול זה עבור דגימות שבירות (למשל, עצם דיאגנטית או דגימות trabecularized מאוד) הטמעת דגימות באפוקסי יש צורך.
      הערה: דגימות עצם המשמשות בפרוטוקול זה אוחזרו מדגימות קעורות חנוטות. אם דגימות טריות נאספות בנתיחה שלאחר המוות או ממקרה כירורגי כדי לבחון מבני רקמות רכות (למשל, כלי דם) באמצעות SRμCT, הפריה עם אפוקסי עלולה לגרום נזק לרקמות כאלה. במקרים אלה, מומלץ להשתמש במדיום דבק או הרכבה חלופי (למשל, סרט הדבקה דו-צדדי, חימר דוגמנות).
  2. לחץ על ההיבט הנחות של בלוק העצם לתוך שף אפוקסי תרמי על שקופית מיקרוסקופ, עם אורך העצם בניצב לשקופית. הסט את הדגימה הלוך ושוב כדי לצפות את החלק התחתון של העצם ולהבטיח הידבקות מאובטחת במגלשה.
  3. תן לדגימה המותקנת לנוח על הצלחת החמה במשך ~ 5 דקות כדי לאפשר לאפוקסי התרמי לפתיל לנקבוביות ו / או סדקים.
    הערה: האפוקסי בשקופית צריך להיות נקי מבועות להדבקה הטובה ביותר. כדי להסיר בועות, הסט את המדגם קדימה ואחורה בשקופית. בועות נוצרות לעתים קרובות עקב מים ו /או אתנול לכוד בתוך העצם לברוח ולהתאדות.
  4. הסר את השקופית עם הדגימה המותקנת מהצלחת החמה באמצעות מלקחיים קהים ולאפשר להתקרר בטמפרטורת החדר במשך ~ 10 דקות. הסר אפוקסי מקצה השקופית באמצעות סכין גילוח כדי להבטיח שהצ'אק יאחז כראוי בשקופית.
  5. חברו את השקופית עם הדגימה הדבקה למגלשת זכוכית והרכיבו את הצ'אק לזרוע המסתובבת של מסור חתך במהירות איטית (ראו טבלת חומרים, איור 2).
    הערה: בעוד מסור Buehler IsoMet הועסק בפרוטוקול זה, מסורים אחרים חיתוך דיוק זמינים כי ניתן להשתמש במקום IsoMet (למשל, לקו, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, חוט יהלום טוב).
  6. כוונן את הזרוע המסתובבת באמצעות חוגת המיקום כדי להבטיח שהלהב יקשר ויעביר את הדגימה. מקם את הדגימה כך שחתך רוחב של העצם ייחתך בניצב לאורכו.
  7. מוסיפים משקולות לצד הרחוק של זרוע החיתוך כדי להתמודד עם משקל הזרוע.
    הערה: אם נעשה שימוש לא מספיק במשקל נגד, הדגימה עלולה לשאת על הלהב ולגרום לשבר בלהב.
  8. מוסיפים נוזל חיתוך (20:1 חלקים מים לחיתוך נוזלים) לכלי הקיבול הנוזלי של המסור.
  9. יש לאבטח היטב את להב הוופל של היהלום ולהבטיח שרמת הנוזל תשקע בחלק החיתוך של הלהב. הגדר את המהירות ל- 200 סל"ד והורד באיטיות את הדגימה על הלהב (איור 3).
  10. ודא שהלהב וצ'אק אינם מתנדנדים ו/או קופצים. אם נרשמת תנועה מופרזת, יש לעצור מיד את המסור ולהדק את הלהב ו/או לצייד את מכלול הזרוע לפני חידוש החיתוך. הוסף משקל נגד נוסף אם הצ'אק נע באגרסיביות למעלה ולמטה. תנועה מוגזמת כולל תנועה גלויה מצד לצד עלולה לגרום לשבר בלהב.
  11. החלק העבה הראשון הוא "חיתוך פסולת" כדי לספק משטח מוגדר היטב במקביל לכל חתך נוסף. לאחר חיתוך הפסולת הראשוני, הרימו את הזרוע המסתובבת והזיזו את הצ'אק לכיוון הלהב 5 מ"מ באמצעות חוגת המיקום. קטעים עבים נוספים (~ 1 מ"מ) עבור מיקרוסקופיה ניתן לאסוף עוד יותר בשיטה זו.
    הערה: על מנת לחסוך רקמה יקרת ערך, ניתן להשמיט את חיתוך הפסולת. עם זאת, בעת חתך מדגם עם קצה לא אחיד, חיוני כי שיא הדגימה יהיה בשורה משיקת לקצה של קצת מקדחת coring.
    1. הקפד להסביר את ה- kerf של הלהב בעת חיתוך. לדוגמה, כדי לקבל קטע 5 מ"מ מלהב בעל קרף של 0.5 מ"מ, להזיז את המדגם ולזרוק 5.5 מ"מ לכיוון הלהב.
  12. לאחר השלמת החתך, מניחים את שקופית הזכוכית עם הדגימה המותקנת על צלחת חמה כדי להמיס את האפוקסי התרמי. זה מאפשר הסרה מהירה של בלוקים עצם מהשקופית.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. קורטינג לדוגמה

  1. הר 5 מ"מ חלקי עצם לתחתית פח אלומיניום רדוד (~ 8 ס"מ קוטר) באמצעות טכניקת מליטה אפוקסי תרמית כמתואר בשלבים 2.2-2.4.
  2. מניחים את הפח על שולחן מכונת XY של מכונת הטחנה (ראו טבלת חומרים)ומהדקים ביד את מלחצי התיקון (איור 4).
  3. הכנס 2 מ"מ בקוטר פנימי של תכשיטן חלול-פיר של תכשיטן משובץ יהלום (ראה טבלה של חומרים)לצ'אק טחנה-מקדחה. כוונן את מגביל העומק כדי למנוע הידברות דרך הפח (איור 5).
  4. יישר את ההיבט הצדדי המרכזי של דגימת העצם מתחת לסיבית המקדחה תוך הימנעות ממגע קרוב עם האזורים periosteum, endosteum או trabecularized מאוד.
    הערה: בחירה אוטומטית של קליפות הירך באמצע הקדמי אינה אפשרית מכיוון שעובי קליפת המוח משתנה בין אנשים, במיוחד עם הגיל הגובר.
  5. ממלאים את הפח במים מזוקקים כדי לכסות לחלוטין את המדגם. פעולה זו מונעת הצטברות חום, שריפת הדגימה ו/או נזק לסיבת המקדחה במהלך ההסתבכות.
    הערה: כדי להעריך את האפשרות של נזק לחום שנגרם על ידי coring, מדחום אינפרא אדום שימש כדי להשיג קריאות טמפרטורה מהמים מזוקקים כמו קצת coring הראשון חדר את פני השטח של העצמות. הטמפרטורה השתנתה על ידי 1 °C (69 °F), מ 22.9 - 23 °C (69 °F) בין עשרת הדגימות cored לבדיקה זו. לפיכך, אנו טוענים כי נזק כתוצאה מחום הוא זניח.
  6. במקרים הראשונים של מגע בין סיבית הליבה לעצם, יש להפעיל לחץ עדין על מנת לענוד טבעת על פני השטח הנעלים של העצם. פעולה זו מונעת הסטה של סיבית התרגיל בתחילת תהליך ההסתעפות ומבטיחה מיקום נכון של הסיבית.
  7. במהלך ההסתעפות, הרם את המקדחה פנימה והחוצה מהדגימה תוך שמירה על קצה הסיבית מתחת לפני המים. המשך טכניקה זו כל כמה שניות כדי לשטוף את אבק העצם לכוד ולהבטיח פסולת אינה חסימת קצת המקדחה.
    הערה: אם הליבה יוצרת צורה חרוטית, סביר להניח שזה בגלל 1) המאפשר מספיק זמן לשטוף אבק עצם מן קצת coring, ו 2) coring מתרחש מהר מדי. מהירות מוגברת עלולה לשבור חתיכות גדולות מהמדגם ולרסק את ההיבט המעולה.
  8. לאחר השלמת ההסתבכות, ליבת העצם המתקבלת עלולה להיתקע בסיבית המקדחה החלולה(איור 6). השתמשו בזוג מלקחיים עדינים או מפתח ברגים קטן של אלן כדי לעקור את הליבה מהביט (איור 2).
  9. אחסן את הדגימה המתוחה בצינור microcentrifuge שכותרתו במיקום קריר ויבש עד להדמיה.

4. שגרות עיבוד תמונה להערכת פרמטרים מיקרו-ארכיאולוגיים של העצם מבליבות עצם קליפת המוח

  1. שחזור של תמונות μCT
    1. הורד והתקן את גרסת NRecon העדכנית ביותר https://www.bruker.com/products/microtomography.html לשחזור תמונות ההקרנה של SRμCT.
    2. בחר את קיצור הדרך NRecon בשולחן העבודה ואת GPUReconServer המשויך יופיע.
    3. פתחו את ערכת הנתונים הרצויה בחלון המוקפץ. אם החלון אינו מופיע, בחר את סמל התיקיה בפינה השמאלית העליונה של חלון תצוגת הנתונים.
    4. בחר את ההקרנה הראשונה מרכישת SRμCT. תחת פלט, הסר את הבחירות עבור השתמש בהושקעה ב- ROI ובקנה מידה ב-.
    5. בחר את יעד קובץ השחזור. בחר עיון וצור תיקיה חדשה בשם Recon. תבנית הקובץ שנבחרה צריכה להיות BMP(8).
    6. בדוק פיצוי אי-התאמות.
      הערה: הערכה זו קרובה לעתים קרובות לתיקון. ניתן לכוונן את העיבוד ה-3D המחוספס באופן ידני על-ידי הזזת החצים למעלה ולמטה כדי להזיז את התמונות החופפות כך שהקצוות הימניים והשמאליים יתיישרו קרוב ככל האפשר.
    7. תחת הגדרות, בחר את הבחירות הרצויות להחלת החלקה, התקשות קרן, סיבוב CS, אובייקט גדול מ- FOV ואלגוריתמים של ממצאים טבעתיים.
    8. התאם את ההיסטוגרמה תחת פלט על-ידי בחירה באפשרות אוטומטי.
      הערה: התמונה המתקבלת עשויה להיות עמומה.
    9. בחר התחל כדי להתחיל לעבד את השחזור.
    10. השתמש במינוח סטנדרטי למדדי תעלה/אוסטאוציט לקונה28. אלה עשויים לכלול: נפח רקמת VOI הכולל (טלוויזיה), נפח התעלה (Ca.V), המספר הכולל של תעלות (Ca.N), קוטר התעלה הממוצע (Ca.Dm), נקבוביות קליפת המוח (Ca.V / TV), נתון כאחוז, המספר הכולל של לקונה (N.Lc), ונפח לקונה ממוצע (Lc.V), בין היתר. כדי לקבוע את צפיפות הלכוג'ר למ"מ3 (N.Lc/BV), נפח העצם (BV) מחושב כנפח כולל פחות נפח תעלה (TV-Ca.V).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  2. איסוף נתונים מיקרו-ארכיאולוגיים מתמונות משוחזרות
    1. הורד והתקן את הגירסה העדכנית ביותר של CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html לניתוח פרמטרים מיקרו-ארכיאולוגיים.
      הערה: הגרסה החינמית של CTAnalyser מוגבלת בפונקציונליות. לכן, מומלץ לרכוש רישיון מלא כדי לבצע ניתוחים מפורטים יותר.
    2. תחת תמונה | | מאפיינים שנה את גודל הפיקסל, ודא שגודל הפיקסל תואם לגודל של פרוטוקול הדימות μCT שהוחל.
      הערה: אם אתם עורכים תמונות ב-ImageJ או בתוכנית דומה, שימו לב שעם השמירה, הכותרת המוטבעת בקובץ TIFF תשתנה ותוכנת הניתוח תשנה את גודל הפיקסל בעת ייבוא ערכת הנתונים.
    3. בחר עיבוד מותאם אישית כדי ליצור רשימת משימות (ראה חומרים משלימים) כדי לנתח את מיקרו-ארכיטקטורת העצם מתוך ערכת הנתונים של הסריקה. פרוטוקול כללי עבור פרמטרים רשת lacunar osteocyte באמצעות תוספים קניינית CTAnalyser כדלקמן כאן:
      הערה: רשימת המשימות של התוסף פועלת היטב עבור ערכות נתונים שבהן הדוגמה היא הנושא היחיד הגלוי ב- FOV. אם שטח ריק מקיף את הדגימה, נדרש יישום של החזר על ההשקעה. אחרת, הערכים שנאספו בניתוח תלת-ממדי וניתוח אובייקטים בודדים יופחתו באופן מלאכותי.
      1. טען מחדש את התמונות כדי לאפס ו/או להתאים שינויים כלשהם (למשל, מעריכה ב- ImageJ או דומה) לפני פתיחת תפריט עיבוד מותאם אישית בתוכנת הניתוח.
      2. להפחתת הרעש בתמונות, יש להחיל מסנן מעבר נמוך של Gaussian בשטח תלת-ממדי עם ליבה עגולה ורדיוס של 2-3.
        הערה: הגדרות אלה הוחלו על ערכות נתונים מניסויי SRμCT שדווחו באמצעות ניסויים ובדיקות שגיאות. המטרה הייתה להשיג את השחזורים האיכותיים ביותר עבור הנתונים. התאם את הגדרות השחזור כך שיתאימו לכל התקנה ניסיונית ייחודית.
      3. החל סף כללי בגווני אפור על התמונות על-ידי בחירת ערכים נמוכים וגבוהים להדגשת תעלות כלי דם. הפרוסות המשוחזרות המופיעות באיורים 8B ו- 8D מתארות סף לדוגמה של 0-155.
        הערה: בדומה לשלב 4.2.3.2, הגדרות הסף שהוחלו כאן נבחרו באמצעות ניסוי וטעייה נרחבים. יש להתאים את הסף עבור כל הגדרה ניסיונית ומערכת דימות μCT בשימוש.
      4. Despeckle (denoise) כדי להסיר כתמים לבנים בחלל 3D כי הם בתוך פיקסל נפחי (voxel) טווח גודל של לקונה osteocyte על מנת לבודד תעלות בלבד.
        הערה: עבור סריקת SRμCT של עצם קליפת המוח האנושית שנלקחה בגודל פיקסל 0.9 מיקרומטר, הגבול התחתון ללונה אוסטאוציט הוא 13 ווקסלים.
      5. Despeckle כדי להסיר כתמים שחורים בחלל 2D כדי להסיר חפצים בתעלות. אלה יכולים להיות גדולים למדי דו-ממדי, ובכך להסיר תכונות <15,000 פיקסלים.
      6. יש לרחב את הנקבוביות בחלל תלת-ממדי באמצעות פונקציית הפעולה המורפולוגית עם גרעין עגול ברדיוס של 2 או 3, בהתאם לאיכות התמונות, על מנת לבודד רקמות רכות הלכודות בתעלות.
      7. בצע פונקציית Despeckle נוספת באמצעות אותן הגדרות כמו שלב 4.2.3.5. על מנת להסיר רקמות רכות מבודדות בתוך תעלות.
      8. לשחוק את ההארך משלב 4.2.3.6. שימוש בפונקציית פעולה מורפולוגית באמצעות ליבה עגולה ברדיוס של 2 או 3. הרדיוס עבור שלב זה חייב להתאים לרדיוס המשמש בהליך 4.2.3.6.
      9. הפעל ניתוח תלת-ממדי ובחר אילו פרמטרים לחשב עבור נפח תעלות כלי הדם. בדרך כלל, הערכים הבסיסיים יספקו מידע מספיק.
      10. שמור את התמונות המעובדות באמצעות שמירת מפות סיביות בתיקיית משנה מותאמת אישית בספריה.
        הערה: אם יוצרים תמונת שחזור תלת מימדית מהתמונות המעובדות באמצעות תוכנית כגון אמירה/אביזו, שפירית, דרישתי וכו', מומלץ לשמור את התמונות כמומונוכרום (סיבית אחת).
      11. חשב את מספר תעלות כלי הדם ותיאר את גודלן, צורתן וכיוונן באמצעות הפונקציה ניתוח אובייקטים בודדים.
      12. חזור על שלבים 4.2.3.1 – 4.2.3.3. כדי לאפס את התמונה לניתוח לקונה osteocyte.
      13. הסר כתמים לבנים בחלל 3D באמצעות הפונקציה Despeckle, להבטיח כי חפצים כאלה קטנים יותר מהגבול התחתון של גודל lacunar. צעד זה מסיר רעש מהסריקה שעשויה להיראות כנקבוביות קליפת המוח, תוך שמירה על לקונה אוסטאוציטית אמיתית. עבור סריקות SRμCT אנושיות בגודל 0.9 מיקרומטר פיקסלים, גבול תחתון זה הוא 13 voxels.
      14. Despeckle פעם נוספת כדי להסיר כתמים לבנים כי הם גדולים יותר מהגבול העליון של גודל lacunar. עבור ערכות נתונים אנושיות של SRμCT עם ההגדרות המפורטות בשלב 4.2.3.13, מגבלה זו היא 2743 voxels.
      15. בצע ניתוח תלת מימדי כדי לחלץ מידע מיקרו-מבני הנוגע ללונה אוסטאוציט במיוחד.
      16. בחרו 'שמור מפות סיביות' לשמירת התמונות המעובדות כדי לבודד את הלונה האוסטיאוצית.
      17. בצע ניתוח אובייקטים בודדים כדי לחשב את מספר האוסטוציטים בתלת-ממד בתוך אמצעי העניין (VOI) שנבחר.
        הערה: לאחר שרשימת המשימות הוקמה ונבדקה, ל- CTAnalyser יש פונקציית מנהל אצווה (BatMan) שניתן להעסיק כדי להאיץ את חילוץ הנתונים ולהבטיח עיבוד תמונה אחיד. רשימת משימות עם הגדרות לדוגמה עבור הליך 4.2.3. ניתן למצוא בחומרים משלימים.

תוצאות

השיטה המתוארת של דגימת ליבה הוכיחה להיות יעיל מאוד ויעיל. דגימות Coring באמצעות פרוטוקול זה מותר עבור הרכש של >300 דגימות בגודל עקבי לניסויים על CLS BMIT-BM קרן2, עם FOV של ~ 2 מ"מ ב 1.49 מיקרומטר voxel גודל. כדי לאמת את העקביות של קוטר הליבה, שלוש מדידות נלקחו לאורך (למעלה, באמצע, למטה) של תת קבוצה ...

Discussion

לא היה פרוטוקול מקיף ומתוקנן לרכש דגימות ליבת עצם קליפת המוח האחידת והגלינדרית להדמיית SRμCT ברזולוציה גבוהה עם הגדרות FOV מוגבלות. הפרוטוקול המפורט כאן ממלא את החלל הזה על ידי מתן הדרכה מקיפה לגבי איך להשיג דגימות ליבת עצם קליפת המוח בגודל עקבי עבור הדמיית SRμCT ואת ההדמיה המדויקת הבאים והפקת...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר המתואר במאמר זה בוצע במתקן BMIT במקור האור הקנדי, הנתמך על ידי קרן קנדה לחדשנות, מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסי של קנדה, אוניברסיטת ססקצ'ואן, ממשלת ססקצ'ואן, גיוון כלכלי מערבי קנדה, מועצת המחקר הלאומית קנדה והמכונים הקנדיים לחקר הבריאות. המחברים רוצים להודות למדעני הקורה במקור האור הקנדי, ובמיוחד לאדם ווב, דניס מילר, סרגיי גאסילוב ונינג זו על הסיוע בהקמה ופתרון בעיות של מערכות המיקרוסקופ SkyScan SRμCT וקרן לבנה. ברצוננו גם להודות לבית דלזל מאוניברסיטת טולדו קולג' לרפואה ומדעי החיים ולד"ר ג'פרי וונסטופ מהאוניברסיטה הרפואית של צפון מזרח אוהיו על הגישה לדגימות קעורות למחקר זה. JM Andronowski נתמך באמצעות קרנות מחקר סטארט-אפ המסופקות על ידי אוניברסיטת אקרון ומכון לאומי למחקר ופיתוח צדק במדעי הזיהוי הפלילי למטרות צדק פלילי (2018-DU-BX-0188). RA דייוויס נתמך על ידי עוזר בוגר המסופק על ידי אוניברסיטת אקרון. ציוד ואספקה המשמשים coring ו ניסור נרכשו על ידי קרנות סטארט-אפ שסופקו על ידי אוניברסיטת אקרון ו NSF להעניק EAR-1624242 ל CW Holyoke.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" plunge cutting carbide for compositesWarrior6181228.6mm plunge
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liters
Blunt-tipped forcepsFisher Scientific10-300
Centrifuge tubesThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
Diamond wafering saw blade for composite materialBuehler#11-4247
Drill PressJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forcepsFisher Scientific22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drillMSC Industrial Supply#04804571
Glass microscope slidesTed Pella2600575x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuckBuehler#112488Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °CThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bitOtto Frei#119.0502mm inner diameter hollow stem coring bit
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating sawHarbor Freight62866
Oven-safe glass dishesPyrex1117715Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000)Buehler111280160
Razor bladesAmazon25181
Shallow aluminum tinsAmazonB01MRWLD0R~8cm diameter
Specimen cupsAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergentAlconox1304-11.8kg box
Ultrasonic cleanerMTI CorporationKJ201508006

References

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al. Beamlines of the biomedical imaging and therapy facility at the Canadian light source - part 3. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 775, 1-4 (2015).
  3. Carter, Y., Suchorab, J. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Normal variation in cortical osteocyte lacunar parameters in healthy young males. Journal of Anatomy. 225 (3), 328-336 (2014).
  4. Carter, Y., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Cooper, D. M. L. Femoral osteocyte lacunar density, volume and morphology in women across the lifespan. Journal of Structural Biology. 183 (3), 519-526 (2013).
  5. Langer, M., et al. X-Ray Phase Nanotomography Resolves the 3D Human Bone Ultrastructure. PLoS ONE. 7 (8), 35691 (2012).
  6. Peyrin, F., Dong, P., Pacureanu, A., Langer, M. Micro- and Nano-CT for the Study of Bone Ultrastructure. Current Osteoporosis Reports. 12 (4), 465-474 (2014).
  7. Dong, P., et al. 3D osteocyte lacunar morphometric properties and distributions in human femoral cortical bone using synchrotron radiation micro-CT images. Bone. 60, 172-185 (2014).
  8. Gauthier, R., et al. 3D micro structural analysis of human cortical bone in paired femoral diaphysis, femoral neck and radial diaphysis. Journal of Structural Biology. 204 (2), 182-190 (2018).
  9. Giuliani, A., et al. Bisphosphonate-related osteonecrosis of the human jaw: A combined 3D assessment of bone descriptors by histology and synchrotron radiation-based microtomography. Oral Oncology. 82, 200-202 (2018).
  10. Andronowski, J. M., Pratt, I. V., Cooper, D. M. L. Occurrence of osteon banding in adult human cortical bone. American Journal of Physical Anthropology. 164 (3), 635-642 (2017).
  11. Andronowski, J. M., Mundorff, A. Z., Pratt, I. V., Davoren, J. M., Cooper, D. M. L. Evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-CT approach. Forensic Science International: Genetics. 28, 211-218 (2017).
  12. Britz, H. M., et al. Prolonged unloading in growing rats reduces cortical osteocyte lacunar density and volume in the distal tibia. Bone. 51 (5), 913-919 (2012).
  13. Maggiano, I. S., et al. Three-dimensional reconstruction of Haversian systems in human cortical bone using synchrotron radiation-based micro-CT: morphology and quantification of branching and transverse connections across age. Journal of Anatomy. 228 (5), 719-732 (2016).
  14. Cooper, D. M. L., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Hallgrímsson, B. Three-dimensional microcomputed tomography imaging of basic multicellular unit-related resorption spaces in human cortical bone. The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 228 (7), 806-816 (2006).
  15. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J., Ulrich, C. Rheology of magnesite: Rheology of Magnesite. Journal of Geophysical Research: Solid Earth. 119 (8), 6534-6557 (2014).
  16. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K. Reversible water weakening of quartz. Earth and Planetary Science Letters. 374, 185-190 (2013).
  17. Holyoke, C. W., Kronenberg, A. K., Newman, J. Dislocation creep of polycrystalline dolomite. Tectonophysics. 590, 72-82 (2013).
  18. Raterron, P., Fraysse, G., Girard, J., Holyoke, C. W. Strength of orthoenstatite single crystals at mantle pressure and temperature and comparison with olivine. Earth and Planetary Science Letters. 450, 326-336 (2016).
  19. Millard, J. W., et al. Pressure Dependence of Magnesite Creep. Geosciences. 9 (10), 420 (2019).
  20. Thomas, C. D. L., Feik, S. A., Clement, J. G. Regional variation of intracortical porosity in the midshaft of the human femur: age and sex differences. Journal of Anatomy. 206 (2), 115-125 (2005).
  21. Jowsey, J. Age Changes in Human Bone. Clinical Orthopaedics and Related Research. 17, 210 (1960).
  22. Martin, R. B., Pickett, J. C., Zinaich, S. Studies of skeletal remodeling in aging men. Clinical Orthopaedics and Related Research. (149), 268-282 (1980).
  23. Martin, R. B., Burr, D. B. Mechanical implications of porosity distribution in bone of the appendicular skeleton. Orthopedic Transactions. 8, 342-343 (1984).
  24. Bousson, V., et al. Distribution of Intracortical Porosity in Human Midfemoral Cortex by Age and Gender. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (7), 1308-1317 (2001).
  25. Goldman, H. M., Thomas, C. D. L., Clement, J. G., Bromage, T. G. Relationships among microstructural properties of bone at the human midshaft femur. Journal of Anatomy. 206 (2), 127-139 (2005).
  26. De Micheli, P. O., Witzel, U. Microstructural mechanical study of a transverse osteon under compressive loading: The role of fiber reinforcement and explanation of some geometrical and mechanical microscopic properties. Journal of Biomechanics. 44 (8), 1588-1592 (2011).
  27. Martin, R. B., Boardman, D. L. The effects of collagen fiber orientation, porosity, density, and mineralization on bovine cortical bone bending properties. Journal of Biomechanics. 26 (9), 1047-1054 (1993).
  28. Cooper, D. M. L., Turinsky, A. L., Sensen, C. W., Hallgrímsson, B. Quantitative 3D analysis of the canal network in cortical bone by micro-computed tomography. The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 274 (1), 169-179 (2003).
  29. Crowder, C., Heinrich, J., Stout, S. D. Rib histomorphometry for adult age estimation. Forensic Microscopy for Skeletal Tissues: Methods and Protocols. , 109-127 (2012).
  30. Pfeiffer, S. Paleohistology: Health and disease. Biological Anthropology of the Human Skeleton. , 287-302 (2000).
  31. Bone Hedges, R. E. M. diagenesis: an overview of processes. Archaeometry. 44 (3), 319-328 (2002).
  32. . The use of formaldehyde imbedded human remains in experimental procedures Available from: https://capa-acap.net/sites/default/files/basic-page/capa_2017_program_final_no_cover.pdf (2017)
  33. Currey, J. D., Brear, K., Zioupos, P., Reilly, G. C. Effect of formaldehyde fixation on some mechanical properties of bovine bone. Biomaterials. 16 (16), 1267-1271 (1995).
  34. Asaka, T., Kikugawa, H. Effect of formaldehyde solution on fracture characteristics of bovine femoral compact bone. Journal of the Japan Institute of Metals. 69 (8), 711-714 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160CT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved