JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

Abstract

ההליכים שהוצגו מתארים מתודולוגיה כללית להדביק יתושים Aedes aegypti עם וירוס זיקה בתנאי מעבדה כדי לקבוע את קצב ההדבקה, זיהום מופץ, והעברה פוטנציאלית של הנגיף באוכלוסיית היתושים המדוברת. הליכים אלה נמצאים בשימוש נרחב עם שינויים שונים בהערכות כשירות וקטורית ברחבי העולם. הם חשובים בקביעת התפקיד הפוטנציאלי כי יתוש נתון (כלומר, מינים, אוכלוסייה, הפרט) עשוי לשחק בהעברת סוכן נתון.

Introduction

יכולת וקטורית מוגדרת כיכולת ברמת המינים, האוכלוסייה ואפילו הפרט, של פרוקי רגליים נתון כגון יתוש, קרציה או זבוב חול פלבוטומין, לרכוש ולהעביר סוכן ביולוגית עם שכפול או התפתחות בפרוקי הרגליים1,2. ביחס ליתושים ווירוסים המועברים על ידי פרוקי רגליים (כלומר, ארבו-וירוסים), הסוכן מודבק ממארח וירמי על ידי יתושה נקבה. בעקבות בליעה, הנגיף חייב להדביק באופן פרודוקטיבי אחד מאוכלוסייה קטנה של תאי אפיתל midgut3, להתגבר על מכשולים פיזיולוגיים שונים כגון השפלה פרוטאוליטית על ידי אנזימי עיכול, נוכחות של המיקרוביוטה (מחסום זיהום midgut, או MIB), ואת מטריצה פריטרופית מופרשת. זיהום של אפיתל midgut חייב להיות מלווה שכפול של הנגיף ובסופו של דבר לברוח מן midgut לתוך מערכת הדם הפתוחה של היתוש, או המולימף, המייצג את תחילתו של זיהום מופץ להתגבר על מחסום הבריחה midgut (MEB). בשלב זה הנגיף יכול להקים זיהומים של רקמות משניות (למשל, עצבים, שרירים וגופי שומן) ולהמשיך לשכפל, אם כי שכפול משני כזה לא יכול להיות נחוץ בהחלט עבור הנגיף להדביק את תאי acinar של בלוטות הרוק (להתגבר על מחסום זיהום בלוטת הרוק). יציאה מתאי האצין של בלוטת הרוק לחללים האפיטליים שלהם ואז תנועה לתוך צינור הרוק מאפשרת חיסון של הנגיף למארחים הבאים על נשיכה, ומשלימה את מחזור השידור1,2,4,5,6,7.

בהתחשב במנגנון ההתפשטות המאופיין היטב והשמור בדרך כלל בתוך וקטור יתושים, הערכות כשירות וקטור מעבדה דומות לעתים קרובות באופן מתודולוגי, אם כי הבדלים בפרוטוקולים קיימים1,2. בדרך כלל, לאחר חשיפה לנגיף הפה, יתושים נותחים כך שרקמות בודדות כגון אמצע, רגליים, שחלות או בלוטות רוק יכולות להיבדק לזיהום ויראלי, זיהום מופץ, זיהום מופץ / שידור טרנסו-אווריאלי פוטנציאלי, וזיהום מופץ / יכולת שידור פוטנציאלית, בהתאמה8. עצם נוכחותו של וירוס בבלוטות הרוק, עם זאת, אינה עדות מוחלטת ליכולת ההדבקה, בהתחשב בראיות של מחסום בריחה /יציאה של בלוטת הרוק (SGEB) בכמה שילובים וקטור / וירוס1,2,4,5,7,9. השיטה הסטנדרטית להוכחת כשירות שידור נותרה העברת יתושים לחיה רגישה10,11,12. עם זאת, בהתחשב בכך עבור arboviruses רבים זה מחייב את השימוש של מודלים מורין immunocompromised13,14,15,16, שיטה זו היא לעתים קרובות עלות-אוסרת. חלופה נפוצה היא אוסף של רוק יתושים, אשר ניתן לנתח על ידי תגובת שרשרת שעתוק הפוך-פולימראז (RT-PCR) או בדיקה זיהומית כדי להדגים את נוכחותו של הגנום הנגיפי או חלקיקים זיהומיים, בהתאמה. ראוי לציין כי שיטות איסוף רוק במבחנה כאלה עשויות ערך יתר עלהמידה 12 או לזלזל17 את כמות הנגיף שהופקד במהלך האכלת vivo, המציין כי נתונים כאלה חייבים להתפרש בזהירות. עם זאת, שיטת מביטה היא בעלת ערך רב כאשר מנותחת מנקודת המבט של עצם נוכחות הנגיף ברוק, מה שמצביע על פוטנציאל ההדבקה.

קיימות שתי גישות עיקריות לקביעת תפקידם של וקטורים יתושים בהתפרצויות מחלות ארבו-ויראליות. השיטה הראשונה כוללת מעקב שדה, שבו יתושים נאספים בהקשר של שידור פעיל18,19,20,21,22,23,24. עם זאת, בהתחשב בכך ששיעורי ההדבקה הם בדרך כלל נמוכים למדי (למשל, שיעור ההדבקה המשוער של 0.061% יתושים באזורים של וירוס זיקה פעיל (ZIKV) במחזור בארצות הברית21), הפללה של מינים וקטוריים פוטנציאליים יכולה להיות מוטה בכבדות על ידי לכידת מתודולוגיה25,26 וסיכוי אקראי (למשל, דגימת אדם נגוע אחד מתוך 1,600 לא נגוע)21 . אם ניקח זאת בחשבון, מחקר נתון לא יכול לרכוש יתושים מספיק הן במספרים גולמיים או מגוון מינים כדי לדגום במדויק יתושים המעורבים בהעברת. לעומת זאת, ניתוחי כשירות וקטורית מתבצעים במסגרת מעבדה, המאפשרים שליטה קפדנית בפרמטרים כגון מינון אוראלי. למרות שאינם מסוגלים לייצג את המורכבות האמיתית של זיהום יתושים ויכולת שידור במסגרת שדה, הערכות מעבדה אלה נשארות כלים רבי עוצמה בתחום הארבו-וירביולוגיה.

בהתבסס על ניתוחי כשירות וקטור שונים עם ZIKV במספר מינים של יתושים, אוכלוסיות ושיטות27,28,29,30,31,32, כמו גם סקירה אחרונה של הערכות יכולת וקטורית1, אנו מתארים כאן כמה מהפרוטוקולים הקשורים לזרימת עבודה וקטורית טיפוסית. בניסויים אלה, שלוש אוכלוסיות Ae. aegypti מאמריקה (העיר סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה התחתון, TX, ארה"ב) נחשפו לזן יחיד של ZIKV (Mex 1-7, גישה GenBank: KX247632.1) ב 4, 5, או 6יומן 10 יחידות יוצרות מיקוד (FFU)/ mL באמצעות מקת דם מלאכותי. לאחר מכן, הם נותחו לראיות לזיהום, זיהום מופץ ויכולת שידור לאחר זמנים שונים של דגירה קיצונית (2, 4, 7, 10 ו -14 ימים) באמצעות ניתוח ובסיס מדבקות מבוסס תרבות תאים. למרות שזרימת העבודה/הפרוטוקולים הנוכחיים ממוטבים עבור ZIKV, אלמנטים רבים ניתנים לתרגום ישיר לארובווירוסים אחרים המועברים על ידי יתושים ברמות בלימת פרוקי רגליים וביו-בטיחות 2 ו-3 (ACL/BSL2 או ACL/BSL3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו בפרוטוקולים אלה בוצעו בעמידה מלאה בפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס בגלווסטון.

1. להגביר את זיקה מיק"ב בתאי Vero

  1. לגדל תאי Vero (CCL-81 או VeroE6) בשינוי של Dulbecco של המדיום החיוני המינימלי של נשר (DMEM) בתוספת 10% v / v סרום בקר עוברי מומת חום (FBS), ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין (100 U / mL ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) באינקובטור לח של 37 °C עם 5% CO2 עד בין 80−90% conencency בבקבוק תרבית רקמות 150 ס"מ2.
  2. בארון בטיחות ביולוגית (BSC), להסיר את המדיום ולהיפטר או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול (שולחן החומרים). מיד לחסן את monolayer עם 1 מ"ל של מלאי ויראלי, מכוון 0.1−1 חלקיק ויראלי זיהומיות לכל תא. להסעיר את הבקבוקון מיד כך inoculum יוצר קשר עם monolayer בשלמותו.
  3. למעלה המדיום לנפח של 5 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן להעביר את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2 במשך 60 דקות.
  4. מוציאים את הבקבוק מהחממה ומכניסים אותו ל-BSC. הוסף מדיום נוסף לנפח כולל של 15 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין. הזז את הבקבוקון לתוך אינקובטור 37 °C לח עם 5% CO2.
  5. בדוק את הבקבוקון מדי יום תחת מיקרוסקופיה ניגוד פאזה לקבלת ראיות של אפקטים ציטוטופתיים (CPE). המשך לקציר הנגיפי (שלב 1.7) כאשר רק כ 40−50% מהתאים נשארים ב monolayer, בדרך כלל 3−5 ימים לאחר ההדבקה בהתאם לזן של ZIKV מנוצל.
  6. שאפו את הסופר-טבעי והכניסו למז"ל חרוט 50 מ"ל. להבהיר את supernatant של פסולת הסלולר על ידי צנטריפוגה (3,500 x גרם במשך 20 דקות).
    הערה: אם צלוחיות מרובות נדבקו באופן זהה, supernatants מבקבוקונים מרובים ניתן לשלב לתוך צינורות חרוט 50 מ"ל.
  7. הסר את supernatant מן הצינור חרוט 50 מ"ל אחד טרי, דואג לא לשבש את הכדור. להשלים את supernatant עם FBS מומת חום לריכוז הסופי של 30% (v/ v). Aliquot תערובת זו לתוך צינורות כובע בורג בודדים להקפיא ב -80 °C (80 °F) עד השימוש.

2. הכנת דם מלאכותי

  1. ביום שבו יתושים ייחשפו לדמיכות דם זיהומיות, הפעילו את מקור הכוח (שולחן החומרים) במתקן בלימת פרוקי רגליים, כך שיחידות ההאכלה (שולחן החומרים) יתחממו מראש עד שהיתושים יהיו מוכנים לחשיפה.
  2. הכן כתמי דם מלאכותיים באמצעות אחת השיטות המתוארות להלן.
    1. שיטה 1: שלבו דם אנושי שנקטף טרי (תוך שבוע) שנרכש מסחרית 1:1 v/v עם מלאי ויראלי (שהוכן כמתואר בסעיף 1).
      הערה: שיטה זו מותנית בהיעדר נוגדנים למשפחת הנגיף/וירוס הנמצאת בדם.
    2. אם היעדר נוגדנים לא ניתן לאשר או מקור הדם ידוע יש חשיפה פלביוירוס קודם, לשטוף ולארוז באופן ידני אריתרוציטים.
      1. ב BSC, להוסיף 30 מ"ל של דם אנושי שלם לצינור חרוטי 50 מ"ל ומעל עד 50 מ"ל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
      2. צנטריפוגה ב 3,500 x g במשך 20 דקות.
      3. שאפו את supernatant או על ידי לשפוך בעדינות לתוך מחבת מגש המכיל או 10% אקונומיקה או דילול עובד של אמוניום רבוע כפול, דואג לא להשליך את כדורי אריתרוציטים.
      4. הוסף 10 מ"ל של PBS והקש בעדינות על החלק התחתון של הצינור חרוטי נגד החלק התחתון של BSC, כך גלולה אריתרוציטים כבר מחדש. להביא את נפח המתלה עד 50 מ"ל עם PBS. מערבבים על ידי היפוך עדין.
      5. חזור על שלבים 2.2.2.1−2.2.2.4 בסך הכל 4−6x. אשר כי supernatant הוא ברור או רק מעט ורוד כבר לא אטום. הסר את כל supernatant באמצעות pipette סרולוגי. resuspend גלולה אריתרוציטים ב 1−2 מ"ל של PBS.
      6. להרכיב את הדם: 350 μL של אריתרוציטים ארוזים, 100 μL של 10% סוכרוז, 200 μL של FBS מומת חום, 900 מיקרומטר RECOMBINANT ATP, ו 2 מ"ל של מלאי וירוס מדולל כראוי באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.
  3. כיסוי יחידת מאגר 3 מ"ל סטנדרטית(שולחן חומרים)עם עור של עכבר לא נגוע (אפשרויות אחרות כוללות סרט פרפין, קרומים קולגניים, או מעטפת נקניקיות).
  4. מניחים את המאגר המקורה על מגבות נייר לבן. הוסף ~ 2 מ"ל של דם זיהומיות למאגר 1 מ"ל בכל פעם. בדוק את המגבת מתחת למאכיל לכל ראיה לדליפה. אם קיימות דליפות, יש לשחזר את נקזת הדם מהמזינים ולהשליך את הכיסויים. לאטום את המאכילים עם תקעים. שוב לאשר כי אין דליפות קיימות.

3. תיוג של קמות דם/בדיקת פלאק

  1. באמצעות הנפח הנותר של קמות הדם מוכן, לבצע סדרת דילול טורי 10x (כלומר, 6 דילול, החל מדולל 10x כדי 1,000,000x) באמצעות DMEM בתוספת 2% v / v חום מומת FBS, ו 1% (v / v) פניצילין-סטרפטומיצין.
  2. Aliquot 100 μL של דילול לתוך בארות של 24 או 12 לוחות היטב מן מדלל ביותר מרוכז ביותר.
  3. דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור.
  4. בסוף תקופת הדגירה של 1 שעות, להחזיר את הלוחות לתוך BSC ולהוסיף 1 מ"ל או 2 מ"ל של כיסוי methylcellulose 24 טוב או 12 לוחות היטב, בהתאמה.
  5. מניחים צלחות כיסוי בחזרה 37 °C ,5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי זן וירוס).
  6. לאחר הדגירה, להסיר את הצלחות מן האינקובטור ולהביא לתוך BSC. יש להשליך את כיסוי המתילצלולוז למחבת מגש המכילה 10% אקונומיקה או חומר חיטוי אמוניום דו-צדדי.
  7. לשטוף כל באר 2x עם PBS, להשליך את לשטוף לתוך מחבת מגש המכיל 10% אקונומיקה או אמוניום quaternary כפול.
  8. הוסף ~ 1 מ"ל של מתנול:אצטון (1:1 v:v) ולאפשר לתאים לתקן על צלחת לפחות 30 דקות BSC בטמפרטורת החדר (RT). להשליך מתנול:אצטון על פי מדיניות מוסדית על פסולת אורגנית.
  9. דמיין את ZIKV באמצעות אחת משתי שיטות המתוארות להלן.
    1. לאחר הסרת מתנול:אצטון, כתם מיד עם פתרון סגול קריסטל (0.25% w /v ב 30% מתנול) במשך 5 דקות. יש לשטוף 2x במי ברז ולהשאיר לייבוש, ולאחר מכן לדמיין ישירות על ידי העין לראיות של לוחות או הרס של monolayer.
    2. לחלופין, בצע מיקוד יצירת מעש.
      1. אפשר ללוחות להתייבש עד שלא יישאר קיבוע אורגני.
        הערה: זה צריך לקחת ~ 2−3 שעות מחוץ ל- BSC אבל יכול להיות מואץ על ידי ייבוש אוויר BSC או מכסה המנוע אדים כימיים.
      2. לשטוף כל באר 3x במשך 15 דקות כל אחד PBS nonsterile (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית. הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון חסימה (PBS + 3% FBS) לכל באר וסלע במשך 15 דקות ב RT.
      3. הוסף 100 μL לבאר של α-ZIKV או α-flavivirus העיקרי נוגדן (למשל, קבוצת flavivirus hybridoma D1-4G2-4-15 [4G2]) בדילול של 1:2,000 בחסימת פתרון. דגירה עם נדנדה למינימום של 4 שעות (רצוי לילה, לא יעלה על 18 שעות) ב RT.
      4. הסר את הנוגדן העיקרי לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (Mg2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.
      5. הוסף 100 μL לבאר של הנוגדן המשני (עז α עכבר HRP מסומן) מדולל 1:2,000 בחסימה חוצץ. דגירה עם נדנדה במשך שעה ב RT.
      6. לשטוף 3x במשך 15 דקות כל אחד עם PBS (מ"ג2 + ו Ca2 + חינם) על נדנדת צלחת מסלולית.
      7. Aliquot 100 μL של ריאגנט פיתוחמצע (טבלת החומרים)לבאר. צלחות סלע ב RT במשך 15 דקות.
      8. לעצור את התגובה עם התפתחות של מוקדים / לוחות על ידי הסרת המצע ושטיפה את הצלחות 2x עם מי ברז. יוצקים ממי ברז ומאפשרים לצלחות להתייבש לפני הכימות.
      9. ספירת מוקדים ויראליים כדי לקבוע את מספר FFU הנוכחי במדגם נתון.

4. ניהול דם

  1. השתמש Ae. aegypti יתושים 2−4 ימים לאחר אקסלוסיה. מיין יתושים נקבות לתוך 0.5 L קרטון קרטון עם מכסים מוקרן לשלול מהם סוכר (בדרך כלל 36−48 שעות לפני מקצית הדם זיהומיות). ספק מי ליביטום עד באמצעות כדורי כותנה רוויים במים.
  2. הסר את כדורי הכותנה רווי מים בבוקר כי היתושים יהיו חשופים לדם זיהומיות.
  3. חבר מאגרים המכילים כתמי דם מלאכותיים ליחידת האכלה מוביל בתוך תיבת כפפות פלסטיק שקופה.
  4. בתוך תא הכפפות, מניחים קרטון קרטון 0.5 L עם מכסה מוקרן, המכיל 50−100 יתושי Ae. aegypti מורעבים, מתחת ליחידת ההאכלה המחוברת למאגר.
    הערה: יתושים מורעבים כראוי בדרך כלל להאכיל בתוך 20 דקות. האכלה יכולה להיות ממושכת לפי הצורך כדי להגדיל את גודל המדגם באוכלוסיות איטיות יותר, אם כי זה לא צריך להאריך מעבר 60 דקות, כי (ZIKV) titer ויראלי יכול להקטין בתוך המאכיל לאחר ~ 60 דקות.
  5. עם השלמת ההאכלה, להסיר את המאגר ולטבול אקונומיקה 10% טרי.
  6. יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 s ב -20 מעלות צלזיוס או במשך 5 דקות במקרר.
  7. בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. לספור ולמיין את הנקבות הספוגות מיתושים לא שקועים. יש להיפטר מהיתושים הלא מנוצלים על ידי טבילה בצינור חרוט 50 מ"ל מלא ב-70% אתנול. בעוד היתושים עדיין מרדים, לשפוך אותם בחזרה לתוך קרטון קרטון 0.5 L לכסות במהירות עם המסך ואת המכסה. חותכים רשת מסך עודפת מהקרטון ומאבטחים את הרשת עם סרט הדבקה.
  8. מוסיפים כדור כותנה רווי בסורוז מימי ומסונן סטרילי 10% למסך של כל קרטון. מניחים את כל קרטוני היתוש במיכל פלסטיק משני גדול עם ספוג לח כדי לשמור על לחות.
  9. מניחים מיכל משני המכיל קרטונים של יתושים לתוך אינקובטור עם טמפרטורה של 27 ± 1 °C (או לפי הצורך כדי לדמות תנאים באזור העניין) עם 80% ± 10% לחות יחסית 16:8 אור:מחזור כהה). שמור על היתושים עם גישה ל-10% סוכרוז עד להשלמת הניסויים.

5. רכישה ועיבוד לדוגמה

  1. בימים שצוינו לאחר ההזנה, שאף מספר קבוע מראש של יתושים מהקרטונים המתאימים באמצעות שאיפה מכנית בתוך תא כפפות. כובע צינור האוסף עם סיבוב כותנה לאחר מספר היתושים הנדרש נרכש.
  2. יתושים מרדים קר על ידי דגירה במשך 30 שניות ב -20 °C (5 °F) או במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  3. בתוך תא הכפפות, יוצקים את היתושים לתוך צלחת פטרי על קרח. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להסיר את כל שש הרגליים של כל יתוש ומניחים בצינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל המכיל נושאת כדור נירוסטה מעוקרת (7/32) ו 500 μL של מדיה איסוף יתושים (MCM) המורכב DMEM, 2% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 2.5 μg / mL amphotericin.
  4. מניחים בעדינות את היתוש על טיפת שמן מינרלי כדי לרסן אותו, תוך כדי קבילות שלא לאפשר כל מגע בין השמן לראש היתוש ופרובו-ביס.
  5. הכנס את פרובוסיס היתוש לתוך קצה פיפטה 10 μL מלא 10 μL של FBS מומת חום.
    הערה: לחלופין, ניתן למלא את הפיפטה ב סוכרוז, דם או שמן מינרלי. השמן מאפשר הדמיה ישירה של בועות רוק באמצעות מיקרוסקופיה קלה.
  6. אפשר ליתושים להזיל ריר במשך 30 דקות. להוציא את קצה micropipette המכיל FBS + רוק לתוך צינור microcentrifuge המכיל 100 μL של MCM, ולאחר מכן למקם את הפגר לתוך צינור microcentrifuge התחתון עגול 2 מ"ל נפרד המכיל נושאת כדור פלדה מעוקרת 500 μL של MCM. ודא כי הצינורות המשמשים את הגופים, הרגליים והרוק מסומנים כך שיהיה ברור שכל שלוש הדגימות מקורן באותו יתוש.
  7. בעוד היתושים הם ריר, לבצע שלבים 5.3−5.5 על היתושים הנותרים.
  8. להעביר את הצינורות המכילים את הגופים והרגליים למכשיר הומוגניזציה של רקמת כרסום חרוזים הכלול בתוך BSC. תטריאט את כל דגימות הגוף והרגל ב-26 הרץ למשך 5 דקות כדי לשחרר חלקיקים ויראליים לתוך הסופר-נט. להבהיר את כל הדגימות על ידי צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות כדי גלולה פסולת הסלולר.
    הערה: בשלב זה, דגימות ניתן להקפיא ב -80 °C (80 °F), או ed מיד.

6. איתור זיק"ב באמצעות תצוקת זיהומיות

  1. ב BSC, להכין 24 לוחות תרבית רקמות היטב עם תאי Vero (105 תאים לבאר) 24 שעות לפני תחילת ההדבקה. סמן כל באר בזהות של יתוש / דגימה אחת.
  2. אם דגימות הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס, אפשר להפשיר.
  3. הסר את המדיה מלוחות התא Vero לפני החיסון עם דגימות צלחת אחת בכל פעם.
  4. עבור דגימות המכילות גופים או רגליים, בזהירות aliquot 100 μL של supernatant מובהר לתוך כל באר, דואג לא להפריע פסולת תא יתוש מן הכדור.
    הערה: דגימות רוק ניתן לדלל 1:1 (v/v) עם MCM לפני חיסון על תאים כדי לחסוך דגימות עבור titration מאוחר יותר, במידת הצורך.
  5. מעבירים את הלוחות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ודגרה למשך שעה.
  6. החזר את הצלחות ל- BSC והוסף ~ 1 מ"ל של כיסוי methylcellulose לכל באר. מניחים את הלוחות המכוסים בחזרה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור ודגרה במשך 3−7 ימים (תלוי וירוס / זן).
  7. בצע קיבוע ופריטים חזותיים כמתואר בשלבים 3.6−3.9.
  8. לגבי ניקוד באמצעות מיקוד יצירת בדיקה, לכמת את הבארות החיוביות על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ אור. זיהוי של כתמים intracytoplasmic של תאים בבאר מצביע על נוכחות של וירוס. דגימות מקבלות ציון אך ורק כ-focus-חיובי או שלילי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שלוש אוכלוסיות של Ae. aegypti מאמריקה (סלבדור, ברזיל; הרפובליקה הדומיניקנית; ועמק ריו גרנדה, TX, ארה"ב) נחשפו לזן התפרצות של ZIKV מאמריקה (ZIKV Mex 1-7, מדינת צ'יאפס, מקסיקו, 2015) על מגוון של טיטרים של דם (4, 5, ו -6 יומן10 FFU / mL) שהוצגו בקם דם מלאכותי מבוסס אריתרוציטים אנושי שטוף. בימים 2, 4, 7, 10 ו - 14 לאחר ה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטות המתוארות כאן מספקות זרימת עבודה כללית לביצוע ניתוחי כשירות וקטורית. כמסגרת כללית, רבות מהמתודולוגיות הללו נשמרות ברחבי הספרות. עם זאת, יש מקום משמעותי לשינויים (נבדק אזר וויבר1). וירוס (למשל, שושלת ויראלית, אחסון של וירוס אתגר, היסטוריית מעבר ויראלית), אנטומולוגיה (למשל, ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לצוות של מרכז ההתייחסות העולמי לווירוסים מתפתחים ו Arboviruses (WRCEVA): ד"ר רוברט טש, הילדה גוזמן, ד"ר קנת פלנטה, ד"ר ג'סיקה פלנטה, דיון שרטון ודיביה מירצ'נדאני, על עבודתם הבלתי נלאה באוצר ובספקת זנים ויראליים רבים המשמשים לניסויי היכולת הווקטורית שלנו ושל קבוצות אחרות. העבודה המוצגת מומנה על ידי קרן מלגות מקלפלין (SRA) ו- NIH מעניקה AI120942 ו- AI121452.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3mL Standard ReservoirR37P30Hemotek LtdInsectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls4RJH9GraingerGrinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/CaseA16-P4FisherScientificFixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell cultureA6419-1GMilliporeSigmaReagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigmaPrimary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle5450-0011KPL/SeracareSecondary Antibody for focus forming assay
BleachNC0427256FisherScientificDecontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 5010-126-34FisherScientificCell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning07-200-740FisherScientificCell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning07-200-91FisherScientificCell culture consumable
Crystal VioletC0775-100GMilliporeSigmaStain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case05-402-7FisherScientificPlastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes14-959-70CFisherScientificPlastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes14-959-49AFisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case13-675-20FisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case13-675-15BFisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case13-675-30FisherScientificPlastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case13-675-22FisherScientificPlastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes08-772BFisherScientificPlastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mLS11150Atlanta BiologicalsCell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides12-550-A3FisherScientificImmobilization of Mosquitos
FU1 FeederFU1-0Hemotek LtdInsectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles140-040-182FisherScientificCell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle15-290-026Fisher ScientificCell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case15-140-163FisherScientificCell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles25-200-114FisherScientificCell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles11-965-118FisherScientificCell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit7203706LampireBloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator2809BBioquipInsectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/CaseA412-4FisherScientificFixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/BottleM0512-250GMilliporeSigmaCell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant DetergentC849T34Thomas ScientificDecontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biologyM5904-5X5MLMilliporeSigmaImmobilization of Mosquitos
O-ringsOR37-25Hemotek LtdInsectary Equipment
Plastic PlugsPP5-250Hemotek LtdInsectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V)PS6120Hemotek LtdInsectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points4525BioquipInsectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case50-809-242FisherScientificPlastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology84097-250GMilliporeSigmaReagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case21-402-487FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-486FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-484FisherScientificPlastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case21-402-482FisherScientificPlastic consumable
TissueLyser II85300QIAGENHomogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL5510-0030SeracareDeveloping solution for focus forming assay
VeroCCL-81American Type Culture CollectionMammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]CRL-1586American Type Culture CollectionMammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

References

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661(2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072(2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434(2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159Aedes aegyptiarbovirus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved