ב Vivo מיקוד של תאים סרטניים אנושיים Xenografted עם חלקיקים פלורסנט פונקציונלי סיליקה ב דגי זברה

Summary

מתואר כאן היא שיטה לניצול עוברי דגי זברה כדי ללמוד את היכולת של חלקיקים פונקציונליים למקד תאים סרטניים אנושיים vivo. שיטה זו מאפשרת הערכה ובחירה של חלקיקים אופטימליים לניסויים עתידיים בבעלי חיים גדולים ובניסויים קליניים.

Abstract

פיתוח חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, ולהרוס תאים סרטניים הוא עניין רב בתחום של ננו-תרופות. במודלים של בעלי חיים vivo נדרשים לגישור הננוטכנולוגיה ליישום הביו-רפואי שלה. העכבר מייצג את המודל החיי המסורתי לניסויים פרה-לקלינליים; עם זאת, עכברים יקרים יחסית לשמור ויש להם מחזורים ניסיוניים ארוכים בשל צרגיות מוגבלות מכל אמא. דגי הזברה התגלו כמערכת מודל רבת עוצמה למחקר התפתחותי וביו-רפואי, כולל חקר הסרטן. בפרט, בשל השקיפות האופטית שלה והתפתחות מהירה, עוברי דגי זברה מתאימים היטב בזמן אמת בניטור vivo של ההתנהגות של תאים סרטניים והאינטראקציות שלהם עם המיקרו-סביבה שלהם. שיטה זו פותחה כדי להציג באופן רציף תאים סרטניים אנושיים וחלקיקים פונקציונליים בעוברי דגי זברה קספר שקופים ולפקח על זיהוי vivo ומיקוד של התאים הסרטניים על ידי חלקיקים בזמן אמת. פרוטוקול ממוטב זה מראה כי חלקיקים פלואורסצנטים מתויגים, אשר פונקציונליים עם קבוצות חומצה פולית, יכול במיוחד לזהות ולמכון גרורתי תאים סרטניים אפיתל צוואר הרחם מתויג עם פלואורוכרום שונה. תהליך הזיהוי והאיקוד יכול להתרחש כבר ב-30 דקות לאחר הבדיקה של החלקיקים שנבדקו. כל הניסוי דורש רק רבייה של כמה זוגות של דגים בוגרים ולוקח פחות מ-4 ימים להשלים. יתר על כן, עוברי דגי זברה חסרים מערכת חיסונית אדפטיבית פונקציונלית, המאפשרת את ההתעמלות של מגוון רחב של תאים סרטניים אנושיים. לפיכך, השירות של הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בדיקה של חלקיקים על סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים, הקלה על הבחירה של חלקיקים אופטימליים בכל הקשר סרטן ספציפי לבדיקות עתידיות ביונקים והמרפאה.

Introduction

התפתחות חלקיקים המסוגלים לזהות, מיקוד, והשמדת תאים סרטניים הוא עניין רב הן פיזיקאים וחוקרים ביו-רפואיים. הופעתו של ננו-תרופות הובילה להתפתחות של מספר חלקיקים, כגון אלה התווססו עם ליגנדים מיקוד ו / או^{תרופות כימותרפיות 1,,2,,3}. המאפיינים הנוספים של חלקיקים מאפשרים את האינטראקציה שלהם עם המערכת הביולוגית, חישה וניטור אירועים ביולוגיים ביעילות גבוהה ודיוק יחד עם יישומים טיפוליים. חלקיקי תחמוצת זהב וברזל משמשים בעיקר בטומוגרפיה ממוחשבת ויישומי הדמיית תהודה מגנטית, בהתאמה. בעוד הפעילויות אנזימטיות של זהב וחלקיקים תחמוצת ברזל לאפשר זיהוי של תאים סרטניים באמצעות אסיאים צבע, חלקיקי פלורסנט מתאימים היטב ביישומים הדמיה vivo^4. ביניהם, חלקיקי פלורסנט ultrabright מועילים במיוחד, בשל יכולתם לזהות סוגי סרטן מוקדם עם פחות חלקיקים ורעילות מופחתת⁵.

למרות יתרונות אלה, חלקיקים דורשים ניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים vivo לבחירה של ננו חומרים מתאימים אופטימיזציה של תהליך הסינתזה. בנוסף, בדיוק כמו סמים, חלקיקים מסתמכים על מודלים של בעלי חיים לבדיקות פרה-קרטיות כדי לקבוע את היעילות שלהם ואת הרעלים. המודל הקדם-לקליני הנפוץ ביותר הוא העכבר, שהוא יונק שתחזוקה שלו מגיעה בעלות גבוהה יחסית. עבור מחקרי סרטן, או עכברים מהונדסים גנטית או עכברים xenografted משמשים בדרך^{כלל 6,7}. אורך הניסויים הללו משתרע לעתים קרובות בין שבועות לחודשיים. בפרט, עבור מחקרי גרורות סרטן, תאים סרטניים מוזרקים ישירות לתוך מערכת הדם של העכברים במקומות כגון ורידים זנב^{טחול 8,9,10}. מודלים אלה מייצגים רק את השלבים הסופיים של גרורות כאשר תאים סרטניים מתפשטים ליישב איברים רחוקים. יתר על כן, בשל בעיות ניראות, זה מאתגר במיוחד כדי לפקח על נדידת תאים סרטניים, פילוח nanoparticle של תאים סרטניים בעכברים.

דגי הזברה (Danio rerio) הפכו למערכת בעלי חוליות רבת עוצמה לחקר הסרטן בשל הפוריות הגבוהה שלה, עלות נמוכה, התפתחות מהירה, שקיפות אופטית ושימור^{גנטי 11,12}. יתרון נוסף של דגי הזברה על פני מודל העכבר הוא הפריה של ביצי הדגים אקס רחם, המאפשר לעוברים להיות במעקב לאורך כל התפתחותם. ההתפתחות העוברית מהירה בדגי זברה, ובתוך 24 שעות לאחר הפוריות (HPF), מטוס הגוף החוליות כבר יצר¹³. ב-72 כ"ס, הביצים בקעות מהצ'וריון, ועוברות מהעובר לשלב הטיגון. השקיפות של דגי הזברה, זן קספר ^{בפרט 14}, מספקת הזדמנות ייחודית לדמיין את הנדידה של תאים סרטניים ואת ההכרה שלהם ומיקוד על ידי חלקיקים בחיה חיה. לבסוף, דגי זברה לפתח את המערכת החיסונית המולדת שלהם על ידי 48 hpf, עם המערכת החיסונית אדפטיבית מפגר מאחור ורק הופך פונקציונלי ב 28 ימים לאחר^{פוריות 15}. פער זמן זה הוא אידיאלי עבור השתלה של סוגים שונים של תאים סרטניים אנושיים לתוך עוברי דגי זברה מבלי לחוות דחיות חיסוניות.

מתואר כאן היא שיטה המנצלת את השקיפות וההתפתחות המהירה של דגי זברה כדי להדגים את ההכרה ואת מיקוד של תאים סרטניים אנושיים על ידי חלקיקים פלורסנט ב vivo. באסיי זה, תאים סרטניים צוואר הרחם האנושי (תאי HeLa) מהונדסים גנטית לבטא חלבון פלורסנט אדום הוזרקו לאזור כלי הדם בחלל perivitelline של 48 עוברי HPF. לאחר 20-24 שעות, תאי HeLa כבר התפשטו ברחבי העוברים דרך מערכת הדם של הדגים. עוברים עם גרורות לכאורה היו microinjected עם ~ 0.5 nL של תמיסת ננו-חלקיקים ממש מאחורי העין, שם ממוקם מיטת הנכים העשירה. באמצעות טכניקה זו, חלקיקי סיליקה פלורסנט אולטרה-ברייט יכולים למקד תאי HeLa במהירות של 20-30 דקות לאחר ההתזמה. בשל הפשטות והיעילות שלה, דגי הזברה מייצגים מודל vivo חזק כדי לבדוק מגוון רחב של חלקיקים ליכולתם למקד תאים סרטניים ספציפיים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת בוסטון תחת הפרוטוקול #: PROTO201800543.

1. דור עוברי דגי הזברה של קספר

1. בחר דג קספר בוגר כי הם לפחות 3 חודשים של גיל לרבייה טבעית כדי ליצור עוברי דגי זברה קספר שקופים.
2. מלאו מיכלי הזדווגות דו-קאמריים במי דגים בערב, הפרידו את המיכלים העליונים באמצעות חוצצים, הניחתו דג זכר אחד בצד אחד של התא ודג נקבה אחד או שניים בצד השני של התא, והעזבו את הדגים מופרדים למשך הלילה על ידי חוצצים.
3. תוציא את המחיצות למחרת בבוקר ב-8: 00 בבוקר כשהאורות דולקים. מוסיפים צמחי העשרה מלאכותיים ומטה מעט את התא העליון כדי ליצור אזור רדוד של מים. לאפשר לדגים להתרבות במשך 3-4 שעות.
4. הרם את התאים העליונים של מיכלי ההזדווגות המכילים את הדגים והחזיר אותם לטנקים המקוריים שלהם.
5. לאסוף ביצים הממוקמות בחדרים התחתון על ידי שפיכת המים דרך רשת רשת. מעבירים ביצים לצלחת פטרי סטרילית בצפיפות של לא יותר מ-200 ביצים למנה. מוציאים ביצים מתות או לא מופרות ומלאים את המנה 2/3 מלאה במים מתוקים של דגים.
   הערה: ביצים מופרות ובריאות צריכות להיות שקופות ועגולות. יש להסיר את כל הביצים המעורפלות, הלבנות או מעוותות. מי דגים מתקבלים ממכלי דגים במתקן הדגים.
6. מדגם עוברים באינקובטור ב 28.5 מעלות צלזיוס בין לילה.
7. להלבין את העוברים למחרת בבוקר באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי כמתואר בספר זברה¹⁶, ולשים את העוברים בחזרה לאקובטור (צעד אופציונלי).
8. להוציא את 24 העוברים HPF מהאינקובטור אחר הצהריים ולתתיר את העוברים באמצעות פרונאז.
   1. מסירים כמה שיותר מי דגים מהעוברים בצלחת פטרי ומוסיפים כמה טיפות של תמיסת הפרונאז (1 מ"ג/מ"ל במים דגים) למנה. מערבבים בעדינות את צלחת הפטרי. ברגע שהכוריונים מראים סימנים של התפוררות, פיפט העוברים למעלה ו למטה כמה פעמים כדי לשבור את chorions כדי לשחרר את העוברים.
   2. מוסיפים מיד מי דגים טריים לצלחת פטרי כדי לסיים את התהליך ברגע שרוב העוברים יוצאים מהצ'ויריונים. לשטוף את העוברים פי 3 יותר באמצעות מי דגים כדי להסיר את chorions צף. החזר את העוברים לאקובטור.

2. הכנת תאים סרטניים אנושיים להשתלה

1. הגדר את טמפרטורת האינקובטור בדיוק 35.5 °C. נטרו את האינקובטור כדי להבטיח טמפרטורה עקבית ויציבה באמצעות מדחום בתוך האינקובטור.
2. Autoclave 1 L של מי דגים בבקבוק זכוכית. לעשות פתרון 3% agarose על ידי הוספת 3 גרם של agarose כיתה אלקטרופורזה כדי 100 מ"ל של מי דגים autoclaved ו microwaving עד agarose מומס לחלוטין.
   1. יוצקים תמיסת אגרוז חמה לצלחת פטרי עד שהיא מלאה ב-3/4. מניחים את תבנית המיקרו-ציה על ה"אגרוז". ודא כי התבנית אינה במגע עם החלק התחתון של צלחת פטרי ולא בועות טופס מתחת.
   2. אפשר לפתרון להתגבש ולהסיר בזהירות את התבנית מהצלחת. ממלאים את הצלחת במים משועבדים לאוטו-עבד ולאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס. לפני המלחמה צלחת agarose ומי דגים בחממה 35.5 מעלות C לפני קצירת תאי HeLa.
3. משוך 1.0 מ"מ O.D. x 0.78 מ"מ borosilicate זכוכית נימים על מושך פיפטה באמצעות ההגדרות הבאות: לחץ על 500, חום ב 560, למשוך ב 100, מהירות ב 100, וזמן / עיכוב ב 200. לאחסן מחטים על דיש בצלחת פטרי גדולה כי כבר נגב עם מגבת אתנול.
   התראה: מחטים משותך הן חדות מאוד ושבריריות. נקוט זהירות בעת הטיפול.
4. הכן פתרון מניות של tricaine methanesulfonate (MS222, 4 מ"ג/מ"ל) על-ידי המסת MS222 לתוך מי דגים autoclaved. מערבולת הרבה לפני השימוש. דילול MS222 פתרון מניות 1:100 במים דגים (כלומר, להוסיף 200 μL של פתרון מניות MS222 20 מ"ל של מי דגים לריכוז סופי של 40 μg / מ"ל) כדי להנות עוברים עבור ההליכים הבאים.
5. תרבות hLabel HeLa תאים על ידי PLenti6.2_miRFP670 לנטיוירוס באמצעות הפרוטוקול המתואר^17. קציר RFP + HeLa תאים 30 דקות-1 שעה לפני ההשתלה.
   הערה: תאי HeLa אנושיים כבר תרבות בחממה תרבות רקמות עד 70% confluency במדיום צמיחה מלאה (DMEM בינוני עם 10% FBS) ב 37 ° C בתוספת 5% CO₂.
   1. הסר את תא HeLa בינוני על ידי שאיפה בשכונה תרבות רקמות. לשטוף בקצרה את שכבת התא עם PBS סטרילי כדי להסיר את כל העקבות של הנסיוב.
   2. הוסף 3.0 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA סטרילי לבקבוקון T-75 והחזר את התאים לתוך אינקובטור תרבות רקמות 37 °C במשך 3-5 דקות כדי להקל על עיכול אנזימטי. שים לב בקבוקון מתחת למיקרוסקופ עד ~ 80% של התאים להיות מושעים.
   3. להוסיף 6-8 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה לתוך הבקבוקון. לאסוף את התאים לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל על ידי pipetting בעדינות. צנטריפוגה ב-135 x גרם ל-5 דקות.
   4. לשאוף את supernatant ולתו מחדש תאי HeLa ב 3 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה. חזור על שלב הכביסה לעיל 2x. להשתמש מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מדיום צמיחה מלאה ולספור את התאים תחת המיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
   5. סובב את התאים שוב, הסר את supernatant, ולתחות מחדש את התאים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל בריכוז של 5 x 10^{7 תאים} / מ"ל. לשמור על התאים חמים על ידי החזקת הצינור ביד אחת בעת הובלה למתקן הדגים.
      הערה: תמיד לשמור על התאים חמים על ידי אחסון התאים בתוך אינקובטור 35.5 °C לפני או במהלך הזרקת העוברים.

3. השתלת תאים סרטניים אנושיים

1. נקה את אזור העבודה באמצעות מגבות אתנול לפני ההשתלה (למשל, מספריים, פינצטה, פיפטות פלסטיק, סכיני גילוח).
2. ליישר עוברים בתוך החריצים של צלחת agarose באמצעות פיפטה פלסטיק. מניחים עוברים בצד עם הקדמי פונה קדימה.
   הערה: ודא כי מי הדגים מכסה את העוברים. לשים כמה עוברים בצד לא להזריק תאים סרטניים ולהשתמש כפקדים.
3. הפעל את מקור האוויר ואת המיקרוב הזעיר. להוציא תאי HeLa מתוך האינקובטור ופיפט התאים למעלה ולרדת 20-30x באמצעות קצה P200. טען 3 μL של תערובת תא מיד לתוך מחט באמצעות קצה טעינת ג'ל עם קצה לחתוך. בזהירות הכנס את הקצה לכיוון הקצה התחתון החד של המחט. במידת הצורך, לנער את המחט כדי להבטיח את תערובת התא נע במורד המחט כדי למלא את הקצה החד.
   1. הכנס את המחט לתוך מחזיק המחט. השתמש בזוג פינצטה כדי לשבור בזהירות את קצה המחט. להתאים את הלחץ ואת משך הזמן על microinjector לדחוף את כל בועות האוויר בתוך קצה המחט. להפחית את הלחץ ואת זמן ההזרקה עד הגודל של טיפות הזרקה הוא ~ 1 nL.
   2. מניחים את צלחת ההזרקה מתחת למיקרוסקופ בתנוחה מתאימה כדי לקבל את הצד החלמון של עוברים מול המחט. להניח את העוברים על ידי הוספת חמש טיפות של פתרון MS222 מדולל (40 μg / מ"ל).
   3. מקם את המזרק ולאפשר למחט לגעת בחלל פריביטלין של כל עובר.
4. להזריק את תערובת התא לתוך העוברים באזור כלי הדם מתחת לחלל perivitelline על ידי לחיצה על דוושת הרגל.
5. השתמש ביד הלא שתלטנית כדי להעביר את צלחת ההזרקה לעובר הבא. השתמש ביד הדומיננטית כדי להרחיב ולמשוך את המזרק תוך לחיצה על דוושת כף הרגל בו זמנית כדי להמשיך את ההזרקה. פיפטה כמה טיפות של מי דגים סטריליים על עוברים שהוזרקו. לאחר השלמת הזרקת כל העוברים על הצלחת, שוטפים את העוברים עם מי דגים סטריליים, מניחים אותם על צלחת פטרי סטרילית ומעבירים אותם מיד לאקובטור של 35.5 מעלות צלזיוס.
6. לאחר 3 שעות, לבדוק את העוברים המוזרקים ולהסיר את המתים.
7. להחזיר את העוברים החיים 35.5 ° C אינקובטור דגירה אותם במשך 20-24 שעות כדי לאפשר לתאי HeLa להתפשט מאתר ההזרקה לחלקים אחרים של הגוף.
   הערה: העוברים נשמרים ב אינקובטור 35.5 °C כדי לאפשר את ההישרדות והנדידה של תאים סרטניים אנושיים כי התאים לא עושים טוב ב 28.5 ° C, עוברי דגים טמפרטורה הם בדרך כלל דגדג.

4. הזרקת חלקיקים או רכב

1. להניחות את העוברים המושתלים למחרת בבוקר עם חמש טיפות של תמיסת MS222 מדוללת. אל תוסיף יותר מדי MS222, כי זה יהרוג את העוברים. תחת מיקרוסקופ פלורסנט, בזהירות להרים עוברים עם גרורות זנב של RFP + HeLa תאים ולמקם אותם לתוך צלחת פטרי חדש עם מי דגים סטריליים.
2. הפוך את מחטי ההזרקה כפי שתואר קודם לכן בסעיף 2 באמצעות ההגדרות הבאות: לחץ ב 500, חום ב 645, למשוך ב 60, מהירות ב 50, וזמן / עיכוב ב 100.
3. בצע את ההליכים בשלבים 3.1-3.3 כדי ליישר עוברים ולהעמיס רכב (למשל, H 2 O) או פתרון nanoparticle_לתוךהמחט.
4. להזריק 0.5 nL של 1 תמיסת ננו-חלקיקים מ"ג/מ"ל מאחורי העין ולהמשיך את ההזרקה כמתואר בשלבים 3.5-3.6(איור 1B). מיקום זה מאחורי העיניים מועשר בנימים, המאפשר לחלקיקים להיכנס למחזור הדם.
5. לאחר הליך דומה, להזריק את הרכב (למשל, H₂O) ששימש להשעיית החלקיקים לתוך עוברים עם תאי HeLa מושתלים ואלה ללא (כלומר, פקדים)(איור 1א, ג).
6. דגירה כל העוברים מוזרקים ב 35.5 ° C.

5. הדמיה ומעקב אחר חלקיקים ותאים סרטניים

1. לבחון עוברים מוזרקים תחת מיקרוסקופ פלורסנט ב 0, 30, 60, 90, 120, 180, ו 210 דקות postinjection של חלקיקים כדי לפקח על התפלגותם במחזור ואת מידת פילוח תאים סרטניים. מיקוד של תאים סרטניים על ידי חלקיקים ניתן לצפות כבר 30 דקות postinjection בהתאם לסוג של ננו חלקיקים נבדק.
2. פיפט 2-3 עוברים לתוך צלחת פטרי ולשתק אותם על ידי הוספת חמש טיפות של פתרון MS222 מדולל (40 μg / מ"ל). ברגע שהעוברים מפסיקים לשחות, הסירו את רוב המים כדי לאפשר לעוברים לשכב על צדיהם.
3. השתמשו בפיפטה עם מברשת דקה ורכה המחוברת לקצה כדי ליישר את העוברים כך שהם שוכבים על צדיהם עם הפנים הקדמיות קדימה ורק עין אחת נראית לעין.
4. תדמינו את העוברים בערוצי אדום, כחול ובהירפילד בהגדלה נמוכה (2x) כדי ללכוד את העובר כולו ולחזור על ההגדלה הגבוהה יותר (6.4x) כדי ללכוד את אזור הזנב. למקד את העובר מתחת לערוץ האדום כדי למנוע דימום של חלקיקים.
   הערה: העוברים אינם יכולים לזוז במהלך ההדמיה. כל תנועה תוביל לתמונות מטושטשות ול חוסר היכולת לחפוף תמונות מערוצים שונים.
5. מוסיפים מי דגים טריים לעוברים מיד לאחר ההדמיה ומחזירים אותם לאקובטור. חזור על שלבים 5.2-5.4 כדי למצוא את העוברים בנקודות זמן שונות.

תוצאות

התרשימים של הפרוטוקול באות 1 ממחישים את הנהלים הכוללים של מחקר זה. דגים בוגרים זכרים ונקביים שקופים גודלו כדי ליצור עוברים (סעיף 1). תאי RFP+ HeLa הוזרקו לאזור כלי הדם תחת חלל פריביטלין של עוברי דגי הזברה ב 48 hpf, עם עוברים לא מקוצרים כפקדים (סעיף 3). עבור אנשים...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מנצל את דגי הזברה כמערכת vivo כדי לבדוק את היכולת של חלקיקים לזהות ולכוון תאים סרטניים אנושיים גרורתיים. מספר גורמים יכולים להשפיע על ביצוע מוצלח של הניסויים. ראשית, עוברים צריכים להיות מפותחים במלואם ב 48 hpf. השלב ההתפתחותי הנכון של העוברים מאפשר להם לסבול ולשרוד את ההשת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	KSE scientific	BMK-A1705
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1.0 mm O.D. x 0,78 mm
Computer and monitor	ThinkCentre	X000335
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV	sold by Fisher
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F0926
Fish incubator	VWR	35960-056
Hemocytometer	Fishersci brand	02-671-51B
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Microloader tip	Eppendorf	E5242956003	sold by Fisher
Micromanipulator	Applied Scientific Instrumentation	MMPI-3
Needle Puller	Sutter instruments	P-97
Olympus MVX-10 fluorescent microscope	Olympus	MVX-10
P200 tip	Fishersci brand	07-200-293
PBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1X)	Corning	21-030-CV	sold by Fisher
Petri dish	Corning	SB93102	sold by Fisher
Plastic pipette	Fishersci brand	50-998-100
pLenti6.2_miRFP670	Addgene	13726
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	SYSPV820
Pronase	Roche-Sigma-Fisher	50-100-3275	Roche product made by Sigma- sold by Fisher
Razor blade	Fishersci brand	12-640
SZ51 dissection microscope	Olympus	SZ51
Tricaine methanesulfonate	Western Chemicals	NC0872873	sold by Fisher
Trypsin-EDTA	Corning	MT25053CI	sold by Fisher
Tweezer	Fishersci brand	12-000-122