הערכת מבנה עיני גלובלי בעקבות Spaceflight באמצעות שיטת הדמיה מיקרו-מחושבת (מיקרו-CT)

Summary

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-מחושבת ברזולוציה גבוהה כדי לקבוע אם נגרם נזק לתענות חלל על מבנים עיניים. הפרוטוקול מראה את המדידה הזעירה-CT של מבנים עיניים של מכרסם vivo לשעבר. אנו מדגימים את היכולת להעריך שינויים מורפולוגיים עיניים בעקבות טיסות חלל באמצעות טכניקה תלת-מינדית לא הרסנית כדי להעריך נזק עיני.

Abstract

על פי הדיווחים, חשיפה ממושכת לסביבת הטיסה בחלל מייצרת שינויים מורולוגיים ואופטלמוסיים פונקציונליים באסטרונאוטים במהלך משימת תחנת החלל הבינלאומית (ISS) ואחריה. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של שינויים אלה הנגרמים על-ידי חלל אינם ידועים כעת. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע את ההשפעה של סביבת spaceflight על מבנים עיניים על ידי הערכת עובי רשתית העכבר, אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), כורואיד ואת שכבת sclera באמצעות הדמיית מיקרו CT. עכברים זכרים בני עשרה שבועות C57BL/6 שוחזרו על סיפון ה-ISS למשימה בת 35 יום ולאחר מכן חזרו לכדור הארץ בחיים לניתוח רקמות. לשם השוואה, עכברי בקרת קרקע (GC) על פני כדור הארץ נשמרו בתנאים סביבתיים זהים וחומרה. דגימות רקמת עינית נאספו לניתוח מיקרו-CT בתוך 38 (±4) שעות לאחר הנחיתה. התמונות של חתך רוחב של הרשתית, RPE, choroid, ואת שכבת sclera של העין הקבועה נרשם בתצוגה סיסית וקשת באמצעות שיטת רכישת הדמיה מיקרו CT. ניתוח המיקרו-CT הראה כי אזורי הרוחב של הרשתית, RPE ועובי שכבת כורואיד שונו בדגימות טיסה בחלל בהשוואה ל-GC, כאשר דגימות טיסה בחלל מראות חתך רוחב ושכבות דקים יותר באופן משמעותי בהשוואה לפקדים. ממצאי מחקר זה מצביעים על כך שהערכת מיקרו-CT היא שיטה רגישה ואמינה לאפיון שינויים במבנה ה עיני. תוצאות אלה צפויות לשפר את ההבנה של ההשפעה של לחץ סביבתי על מבנים עיניים גלובליים.

Introduction

בסביבת microgravity של spaceflight, לחץ תוך גולגולתי מוגבר (ICP) הנגרמת על ידי שינוי נוזלים אולי תרם לתסמונת נוירו-עינית הקשורה לחללית (SANS)^1,2,,3,,4,,5. ואכן, יותר מ-40% מהאסטרונאוטים חוו את SANS במהלך משימת תחנת החלל הבינלאומית (ISS)^{6 ואחריה}, כולל נושא הטיסה לחלל של מחקר^{התאומים של נאס"א 7}. הפתופיזיולוגיה הנוכחית של SANS כוללת שינויים פיזיולוגיים כגון בצקת דיסק אופטי, שיטוח כדור הארץ, קפלי כורואידים ורשתית, שינויי שגיאה שבירה היפראופית, ואוטמי שכבת סיבי עצב (כלומר, כתמי צמר גפן)^{ומתועדים היטב 5,8}. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של השינויים והגורמים התורמים לפיתוח הנזק אינם ברורים. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של SANS, מודלים של בעלי חיים זמינים לאפיון השינויים הקשורים לחללית במבנה ובתפקוד של רשתית.

בחקירה קודמת על אותן חיות, דיווחנו על ההשפעה של 35 ימים של חללית על רשתית העכבר. התוצאות מסיקות כי spaceflight גורם נזק משמעותי ברשתית וסקולטור רשתית, וכמה חלבונים / מסלולים הקשורים למוות תאים, דלקת ומתח חילוף חומרים שונו באופן משמעותי לאחר spaceflight⁹.

כיום, ישנן מגוון רחב של טכניקות הדמיה לא פולשניות הוקמו כדי לפקח על התפתחות המחלה והתקדמות, כמו גם תגובות פיזיולוגיות לחצים סביבתיים שונים, אשר נמצאים גם בשימוש נרחב במודלים מכרסמים קטנים. אחת הטכניקות הללו היא micro-CT, אשר מעריך מבנים אנטומיים ותהליכים פתולוגיים, ונעשה בו שימוש מוצלח על אורגניזמים קטנים כמו עכברים¹⁰.

Micro-CT יכול להשיג רזולוציה microsized, וזה יכול לספק ניגודיות גבוהה לניתוח נפח של רקמות רכות עם תוספת של סוכן^{הניגודיות המתאים 10,,11,12,,13,,14}. טכנולוגיית Micro-CT היא יתרון בהשוואה לשיטות מסורתיות כגון אנטומיה ברוטו, מיקרוסקופיה קלה, ובדיקת היסטולוגיה, כפי שהוא ממזער נזק פיזי לפרופיל הגיאומטרי של הדגימות ואינו משנה את הקשר המרחבי בין מבנים. בנוסף, ניתן לשחזר מודלים תלת מימדיים (תלת-ממדיים) של מבנים מתמונות מיקרו-CT^12,14. עד כה, למרות ראיות המציגות ליקוי ראייה בעקבות חשיפה לסביבת החלל, מעט נתונים במודלים של בעלי חיים זמינים להבנה טובה יותר של השינויים הקשורים לחללית במבנה ובתפקוד של רשתית. במחקר הנוכחי, עכברים הוטסו במשימה של 35 יום על סיפון ISS כדי לקבוע את ההשפעה של סביבת הטיסה בחלל על מבני רקמות עינית על ידי כימות המיקרו-מבנה של הרשתית, RPE, ואת שכבות כורואיד באמצעות מיקרו-CT.

Protocol

המחקר עקב אחר ההמלצות המתוארות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ואושר הן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והן על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת לומה לינדה (LLU) ומינהל האווירונאוטיקה והחלל הלאומי (נאס"א). מידע מפורט יותר לגבי ניסוי טיסה זה ניתן למצוא במקום^{אחר 9,15}.

1. תנאי טיסה ובקרה

הערה: מטען שירות אספקה מסחרי 12 (CRS-12) שוגר על ידי SpaceX במרכז החלל קנדי (KSC) במשימה בת 35 יום באוגוסט 2017 שכללה עכברים בני 10 שבועות C57BL/6 (n = 20) לניסוי מחקר המכרסמים התשיעי של נאס"א (RR-9).

1. לפני החזרה לכדור הארץ באמצעות קפסולת הדרקון של SpaceX, יש העכברים לחיות בבתי גידול מכרסמים של נאס"א (RH) על סיפון ISS במשך 35 ימים בטמפרטורת סביבה של 26-28 ° C עם מחזור אור / כהה של 12 שעות לאורך כל הטיסה.
2. מקם עכברי בקרת קרקע (GC) באותה חומרת דיור המשמשת בטיסה והתאמת פרמטרים סביבתיים כגון טמפרטורה ופחמן דו חמצני (CO_{2) רמות קרוב}ככל האפשר בהתבסס על נתוני טלמטריה.
3. להאכיל עכברי GC אותה דיאטת בר מזון נאס"א כמו עמיתיהם מבוססי החלל. ספק הן את הטיסה בחלל והן את עכברי GC עם אותה גישה אד libitum למים ומזון.

2. הערכה לאחר טיסה של העכברים

1. בתוך 28 שעות של התזה על כדור הארץ, להעביר את העכברים לאוניברסיטת לומה לינדה (LLU). ברגע שהם שם, הסירו את העכברים ממתחם בעלי החיים והעריכו את ההישרדות והבריאות.
   הערה: לאחר התצפית, צוות הבדיקה דיווח כי כל העכברים שרדו את משימת החלל 35 יום היו במצב טוב, כלומר אין ליקויים ניכרים / חריגות.

3. לנתח ושימור של עיני העכבר לאחר spaceflight

1. בתוך 38 (±4) שעות של splashdown (n = 20/group), המתת דם העכברים ב 100% CO_{2 ולאסוף} את עיניהם.
2. לנתח את הרשתיות העין הימנית ולמקם בנפרד cryovials סטרילי, snap-freeze בחנקן נוזלי, ולשמור על $80 °C לפני השימוש.
3. לתקן את כל העיניים השמאליות ב 4% paraformaldehyde בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) במשך 24 שעות ולאחר מכן לשטוף עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) עבור מיקרו-CT assays.

4. הכנה לדוגמה לסריקת מיקרו-CT

1. לאחר קיבעון, מייבשים את עיני העכברים באתנול. כדי למנוע התכווצות נוספת או פתאומית של המדגם הקבוע, השתמשו בסדרה מדורגת של פתרונות אתנול: החל מ-50% אתנול למשך שעה אחת ולאחר מכן הגדלת ריכוזי פתרונות האתנול כדלקמן למשך שעה אחת כל אחד: 70, 80, 90, 96 ו-100%.
   הערה: יש לטפל בעיני העכברים בתא מכסה המנוע.
2. חומצה פוספומולי בדיק (PMA) מכתים
   התראה: על חשבון PMA להיות מאכל, מסרטנים, רעיל לאיברים, ציוד אישי מגן מתאים יש צורך, כולל השימוש בכסה מנוע אדים.
   1. להכין את פתרון הכתמים: 10 מ"ג של PMA ב 100 מ"ל של אתנול מוחלט.
   2. הכתים את העיניים של העכברים (10 wt. % חומצה פוספומולי בדיק - PMA מומס אתנול מוחלט) במשך 6 ימים.
   3. לפני הסריקה, תחילה לשטוף את דגימות העין אתנול מוחלט ולאחר מכן למקם כל עין במיכלי פלסטיק בודדים 2 מ"ל כי הם מלאים 100% אתנול מוחלט. הוסף כרית כותנה לדגימות מיוצבות במהלך הסריקה.

5. סריקה וניתוח מיקרו-CT

הערה: סורק SkyScan 1272, מערכת מיקרו-CT רנטגן שולחנית, שימש להערכת נזק רשתית בעיני העכברים

1. הר את דגימת הרקמה הרכה למחזיק מדגם מתאים. כדי למנוע תנועה כלשהי במהלך מדידות הרנטגן CT, ודא התאמה הדוקה של הדגימה על מחזיקה(איור 1).
2. עם יישור קפדני של כל דגימה, סרוק בנפרד את הדגימה באמצעות צילומי רנטגן.
   1. לאחר פתיחת התוכנה, מרכז את הדגימה במסגרת. בפרוטוקול, אל תשתמש במסנן והגדר את המטריצה כך להגדיל את הפיקסל ב- 4 μm. השתמש במיקרו-מיקום כדי להשאיר את מרכז הדגימה על המסגרת.
   2. לאחר מכן, בדוק את הפרמטר כדי למקסם את סוכן הניגודיות. כדי לבצע את הכיול, הסר את הדגימה ובדוק שהתיקון בעל השדה השטוח גדול מ- 80%.
   3. לאחר הכיול, הכנס מחדש את הדגימה לתא הסריקה. לסריקה, השתמש בשלב סיבוב של 0.400, מסגרת בממוצע של 4, תנועה אקראית של 30 וסובב את הדגימות ב- 180°.
3. השתמש בג'יג מיקום עבור מידות חוזרות. בשל שיפור ניגודיות שלב שבוצע כמתואר, פרטי אובייקט קטן כמו 4 μm ניתן לזהות מצילומי רנטגן שנוצרו על ידי צינור רנטגן מיקרו מיקוד אטום (אנודה טונגסטן) ב 50 keV ו 80 mA עם זמן אינטגרציה של 90 דקות.
   הערה: פרמטרי הרכישה המפורטים בסעיף זה לבחירה כדי להפיק סריקות CT מבט כולל עם איכות התמונה הגבוהה ביותר.
4. לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה (לדוגמה, NRecon) כדי לשחזר את הנתונים.
   1. התאם את היסטוגרמה והשתמש באותו טווח (0 – 0.24) עבור כל הדגימות. שחזור אזור עניין היה מעגל, ולא נעשה שימוש בקנה מידה או בתוויות.
   2. כדי להפחית חפצים במהלך הסריקה, השתמש בתיקון הקשחת קרן של 20, תיקון החלקה של 1, הפחתת חפץ טבעת של 6, ולא לבצע שום שינוי בפיצוי אי-היישור. לאחר השיקום, אושר כי הדגימה נמצאת באזור של עניין.
   3. למקם מחדש תמונות באמצעות מישור במקביל לעצב הראייה ועדשת העיניים.
5. לאחר הסריקה, השתמש בתוכנה (לדוגמה, DataViewer) כדי להמחשה את התמונות הבשוחזרות בכל שלוש התצוגות.
   הערה: במידת הצורך, עם תוכנה זו, ניתן למקם מחדש את התמונות באמצעות מישור המקביל לעצב הראייה ולעדשה של העיניים כדי לבצע ניתוח מתוקן.
6. ניתוח תיאורי
   1. למדוד את המבנים באמצעות כלי מדידה בתוכנה (למשל, CTAn). השתמש בעצב האופטי כדי לבודד את אזור העניין לניתוח. לפי חישוב, הפרוטוקול השתמש בפרוסה האמצעית כדי לבצע את המידות. הערכה זו בוצעה על ידי ניתוח תיאורי (איור 2 ואיור 3).
   2. לבצע מדידות של הרשתית, אפיתל פיגמנט רשתית (RPE), כורואיד, ושכבת sclera בשכבת sagittal(איור 2) ותצוגהסיסי(איור 3). יש לבצע שלוש מידות של כל מבנה כדי לחשב ממוצע.

תוצאות

העובי הממוצע של הרשתית, RPE, choroid, ושכבת sclera נרשם באמצעות סריקות מיקרו CT לאחר ביצוע הפרוטוקול לעיל(איור 1). הטכניקה הראתה שחזור רב-פלנטרי של העיניים בשלוש השקפות שונות. במהלך הניתוח, הצופה הצליח לגלול דרך כל הדגימה כדי לתקנן את הניתוח ממש באמצע הדגימה.

ניתוח המיקרו-CT הראה את אזורי הרוחב של העיניים בתצוגה הסגית והסיסית (איור 2 ואיור 3 ) שבהם בוצעוהמדידות ליניאריות. RPE ושכבה choroid היו באופן משמעותי או מגמה נמוכה יותר בקבוצת spaceflight בהשוואה לקבוצת GC(איור 3).

איור 1: הליך מיקרו-CT של רקמה רכה. (א)דגימת רקמה רכה (עין עכבר). (ב)דגימות תוקנו ב 4% פורמלדהיד בפתרון מאגר פוספט (PBS). לאחר קיבעון, עיני העכברים היו מיובשים באתנול. כדי למנוע התכווצות נוספת ופתאומית של המדגם הקבוע, נעשה שימוש בסדרה מדורגת של פתרונות אתנוליים, החל מ-50% אתנול לשעה אחת ופתרונות אתנול הבאים בריכוזים המפורטים, למשך שעה אחת כל אחד: 70, 80, 90, 96 ו-100%. (ג)עיני העכברים היו מוכתמות בחומצה פוספומוליבידית (PMA) במשך 6 ימים, נשטפו באתנול מוחלט ולאחר מכן הונחו במיכלי פלסטיק בודדים של 2 מ"ל מלאים באתנול מוחלט. (D)סורק מערכת מיקרו-CT רנטגן שולחני שימש להערכת הפציעה הרשתית בעיני עכברים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: מבט קשת של עכבר בקרת קרקע. שכבות העין בצד ימין של התמונה מבוארות, מלמעלה למטה, רשתית (0.077 מ"מ), שכבת פיגמנט רשתית (RPE, 0.038 מ"מ), כורואיד (0.041 מ"מ), sclera (0.059 מ"מ). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'^15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תצוגה סיסית של עכבר בקרת קרקע. שכבות העין בצד ימין של התמונה מסומנות, מלמעלה למטה, רשתית (0.144 מ"מ), שכבת פיגמנט רשתית (RPE, 0.051 מ"מ), כורואיד (0.041 מ"מ), sclera (0.073 מ"מ). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'^15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: עובי ממוצע של שכבת רשתית, שכבת RPE ושכבת כורואיד נמדד על-ידי מיקרו-CT בקבוצות הטיסה והפקדה של החלל. ספירות היו בממוצע על פני חמש רשתיות לכל קבוצה. ערכים הוצגו כעובי ± שגיאה סטנדרטית (SEM). SEM של ממוצע מסומן במ קווי שגיאה. נמוך משמעותית בעובי חתך רוחב בקבוצת הטיסה בחלל (FLT) בהשוואה לקבוצת בקרת הקרקע (GC) מסומן '*' (p < 0.05). נתון זה נלקח מ-Overbey ואח'^15. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

תוצאות המחקר הראו כי היו שינויים מבניים בעין העכבר של הטיסה בחלל באמצעות טכניקת מיקרו-CT בהשוואה לקבוצות GC, במיוחד של הרשתית, RPE, ואת שכבות כורואיד של העין, כפי שמעיד על ידי עובים ירד. Micro-CT מספק טכניקה יעילה ולא הרסנית לאפיון השינויים ללא צורך במניפולציה. השימוש בכתמים PMA שיפר את איכות תמונות מיקרו-CT כדי להשיג בהצלחה תמונות רמוגרפיות תלת-ממדיות ברורות לאחר השחזור, ויתור על כל צורך לשנות פיזית את מבנה הדגימה. יתרון נוסף של תמונות אלה הוא שהם מציגים את כל אזור העניין באופן דיגיטלי, ובכך להגדיל את הנגישות, כמו גם לשחזר את הממצאים. באמצעות תמונות מיקרו-CT המיוצר במהלך מחקר זה, הדגימה ממוקדת הראה בידול של מבנים מרובים כמו הרשתית, RPE, choroid, ו שכבת sclera לקביעת העובי של כל שכבה.

שלב קריטי בתוך הפרוטוקול הוא מניפולציה של הדגימות בשל גודלן ומרקםן. הטיפול בדגימה חייב להיעשות בזהירות מבלי להפעיל לחץ על הדגימה במהלך ההכנה. למיקרו-CT יש כמה מגבלות: רזולוציה והיעדר ערכים מתוקנים עבור הפרמטרים. במהלך הסריקה, סורקי מיקרו-CT שונים עשויים להיות אלגוריתמים שונים לעיבוד תמונה; עם זאת, ניתן להמשיך לכיול גווני אפור כדי להתגבר על כל בעיה. לאחר הסריקה, שחזור התמונות צריך להתבסס על הרקמה והניתוח שיבוצע. זה יכול להיות קריטי מאז איכות התמונה תלויה במערכת הטומוגרפית, ההגדרות, גודל הדגימה, כמו גם שיטות^{ההכנה 16,17}.

בשל היישום המוצלח שלה בחקר מספר סוגים של רקמות נורמליות ופתולוגיות, יכולות הדמיה מיקרו-CT יש להשתמש במחקר עתידי כדי לאסוף נתונים volumetric לניתוחים אחרים. לפיכך, בהתבסס על מטרת המחקר הנוכחי, היה מקובל להשתמש במדידות דו-ממדיות, אך פילוח מבנה התלת-ממד הגולמי יכול גם להועיל כדי לספק קווי מתאר מדויקים של הדגימה כולה. אפילו עם כל היתרונות של טכניקה לא הרסנית, מיקרו-CT לא יחליף שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה, אבל ישלים ויאפשר ניתוחים היסטולוגיים הבאים אם תרצה.

מצב ממושך של הטיסה בחלל מייצר סדרה של שינויים מבניים ופונקציונליים באסטרונאוטים במהלך ואחרי משימת החלל המוגדרת כ-SANS. הממצאים כוללים משמרות היפראופיות, שיטוח כדור הארץ, קפלי כורואיד/רשתית וכתמי צמר גפן¹⁹. בניגוד טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית של אסטרונאוטים (OCT) מציאת של עיבוי שכבת סיבי עצב ברשתית, דילול של רשתית ושכבה כורואידית תועד במחקר זה מיקרו-CT בעלי חיים. תוצאות אלה היו בלתי צפויות. אי-התאמה זו עשויה להיווות כתוצאה מגורמים מבלבלים. לעכברים יש תנוד נוזלי צ'פלאד מוגבל בהשוואה לבני אדם. חוסר זה של שינוי נוזלים אולי עורר תגובות שונות לשינויים כבידתיים. שנית, עכברים נותחו בתוך 38 שעות לאחר ההתזה, ותגובה חריפה לעיבוד מחדש עשויה גם לתרום לשינויים מורפולוגיים ברשתית ובכ'ורואיד. אישור אפשרות זו דורש מדידות נוספות במהלך הטיסה בחלל ולטוח הארוך לאחר המשימה.

תוצאות המחקר מצביעות על כך שתנאי טיסת החלל, במיוחד שינויים כבידתיים, עשויים לגרום לתגובה חריפה וקצרת טווח בעין. דרושה חקירה נוספת כדי לקבוע את ההשלכות של השינויים החריפים על תפקוד רשתית ועל מנגנון השינויים המבניים המושרה על-ידי חלל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 wt. % phosphomolybdic	Sigma	12026-57-2
Ethanol absolute by Baker Analyzed	VWR	80252500
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	L1825
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner	Bruker