הערכה של חמצון הסלולר באמצעות מערכת משנית ספציפי לחמצון-רגיש ירוק פלורסנט ירוקה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההערכה של מצב החמצון הייחודי של תא משנה בתוך התא. בדיקה פלואורסצנטית תלויית-חמצון רגישה מאפשרת ניתוח טימטרי נוח בתאים שלמים.

Abstract

מדידת חמצון תאיים/הפחתת המאזן מספק סקירה של המצב הפיסיולוגי ו/או פתופסולוגית הסטטוס של אורגניזם. תיוולים חשובים במיוחד להארת המצב החדש של התאים באמצעות dithiol מופחת וביחס דיגומי. מהונדסים cysteine-המכיל חלבונים פלורסנט לפתוח עידן חדש לחמצון רגישות biosensors. אחד מהם, חלבון הניאון רגישות ירוק רגיש (רוfp), יכול בקלות להיות הציג לתאים עם התמרה ויראלי, המאפשר את מצב החמצון של תאי subcellular להיות מוערך מבלי לשבש את התהליכים הסלולריים. Cysteines מופחת ו cysteines תחמוצת של רוfp יש עירור מקסימה ב 488 ננומטר ו 405 nm, בהתאמה, עם פליטה ב 525 nm. הערכת היחס בין צורות מופחתות ומחמצנים מאפשרת חישוב נוח של איזון מחדש בתוך התא. במאמר שיטה זה, מונצח האדם האנושי משולשת שליליים סרטן השד תאים (מד א-MB-231) שימשו כדי להעריך את הסטטוס של חמצון בתוך התא החי. שלבי הפרוטוקול כוללים התמרה מד-התאים מספר 6-1-MB-231, הטיפול ב-H₂O₂, והערכה של היחס ציסטאין וציסטינה עם שתי הזרימה הציטונסות והמיקרוסקופיה הפלואורסצנטית.

Introduction

לחץ חמצוני הוגדר ב 1985 על ידי הלמוט שעירים כמו "הפרעה ב-prooxidant-מאזן נוגד חמצון לטובת לשעבר"¹, ושפע של מחקר נערך כדי להשיג מחלות-, תזונה-, ו-הזדקנות-מעמד החיים ספציפי חמצון של אורגניזמים^1,2,3. מאז, ההבנה של לחץ חמצוני הפך להיות רחב יותר. בדיקת השערות של שימוש נוגדי חמצון נגד מחלות ו/או הזדקנות הראו כי לחץ חמצוני לא רק גורם נזק אלא גם יש תפקידים אחרים בתאים. יתר על כן, מדענים הראו כי רדיקלים חופשיים לשחק תפקיד חשוב עבור התמרה אות². כל מחקרים אלה מחזקים את החשיבות של קביעת השינויים הפחתת חמצון היחס של קרו. פעילות אנזימים, נוגדי חמצון ו/או חמצון, ומוצרי חמצון ניתן להעריך עם שיטות שונות. בין אלה, שיטות הקובעות חמצון תיול הם ללא ספק המשמשים ביותר משום שהם מדווחים על האיזון בין נוגדי חמצון ו prooxidants בתאים, כמו גם אורגניזמים⁴. במיוחד, היחס בין הגלוטתיון (gsh)/גלוטתיון קשר דיסולפידי (gssg) ו/או ציסטאין (cys)/cyסטינה (cyss) משמשים כסמנים לניטור מעמד החמצון של אורגניזמים².

שיטות המשמשות לאמירת האיזון בין prooxidants ונוגדי חמצון להסתמך בעיקר על רמות של חלבונים מופחת/תחמוצת או מולקולות קטנות בתוך תאים. הכלים המערבי וספקטרומטר המסה משמשים כדי להעריך באופן כללי את היחס של מופחת/תחמוצת קרו (חלבון, שומנים וכו '), ו gsh/gssg יחס יכול להיות מוערך עם ספקטרופוטומטר⁵. תכונה נפוצה של שיטות אלה היא הנטייה הפיזית של המערכת על ידי הליזה תא ו/או רקמת המגון העור. מנתח אלה גם להיות מאתגרת כאשר יש צורך למדוד את מצב החמצון של תאים סלולריים שונים. כל אלה מרטבאליות לגרום לחפצים בסביבת העבודה.

החלבונים הניאון הרגישים מחדש פתחו עידן היתרון להערכת איזון החמצון מבלי לגרום להפרעה בתאים⁶. הם יכולים למקד תאים תאיים שונים, המאפשר כימות של פעילויות ספציפיות לחלקה (g., לומר את המצב החדש של המיטו, ואת הציטוסול) כדי לחקור את הקשר בין אורגלים סלולריים. חלבון פלורסנט צהוב (YFP), חלבון פלורסנט ירוק (GFP), וחלבונים HyPeR נבדקים על ידי מאייר ועמיתיו⁶. בין החלבונים האלה, החמצון הרגיש (gfp) הוא ייחודי עקב קריאות פלורסנט שונות של cys (ex. 488 ננומטר/em. 525 nm) ו-cyss (ex. 405 nm/525 nm) שאריות, אשר מאפשרת ניתוח של טימטרי, בניגוד לחלבונים אחרים הרגישים מפני חמצון כגון yfp^7,8. פלט טימטרי הוא בעל ערך מכיוון שהוא מאזן את ההבדלים בין רמות הביטוי, הרגישויות לזיהוי והלבנת^שמונה. תאי משנה של תאים (ציטוזול, המיטומטר, גרעין) או אורגניזמים שונים (חיידקים, כמו גם תאים ממיונקים) ניתן לפלח על ידי שינוי רוfp^7,9,10.

הספר מבוצע באמצעות טכניקות הדמיה פלואורסצנטית, במיוחד עבור ניסויים חזותיים בזמן אמת. ניתוח ציטומטלי זרימה של "רומינטריק" ניתן גם לניסויים בנקודות זמן שנקבעו מראש. המאמר הנוכחי מתאר הן את השימוש של מיקרוסקופ פלורסנט ואת הזרימה cy, מנסה לבצע הערכה מחודשת של מעמד החמצון בתאי היונקים overexpressing (ממוקד ציטוסול) באמצעות התמרה ויראלית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה הותאם במיוחד ל-70%-80% בתאים מד א-231-MB. עבור קווי תאים אחרים, יש למטב מחדש את מספר התאים וריבוי הזיהומים (מוי).

1. הכנת תאים (יום 1)

1. שמור מד א-MB-231 קו תא ב 75 ס"מ² מבחנות עם 10 מ ל של מדיום שונה של הנשר של Dulbecco (dmem) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (fbs) ב 37 ° c ב 5% CO₂ מחולל אווירה.
   הערה: DMEM בתוספת של 10% FBS, 37 ° c, ו-5% CO₂ מחולל אווירה משמשים עבור כל הקבצים המצורפים והטיפול incubations במהלך כל הפרוטוקול.
2. הכן את תאים מד-ה231. לניסוי
   1. מוחלק את המדיום בתוך הבקבוקון, לנתק את התאים עם 2 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון עבור 2 דקות, ו להשבית את הפעילות טריפסין עם 6 מ ל של בינונית מלאה (DMEM זיכרון עם 10% FBS). צנטריפוגה את התאים ב 150 x g עבור 5 דקות. ומכה את הסופרנטאנט ומשהה את התאים ב -5 מ ל של מדיום שלם.
   2. מערבבים מתלה שווה של תאי נפח ו-0.4% טרי, כחול. קח 10 μL של תערובת זו ולספור את התאים עם מונה התא האוטומטי.
      הערה: ניתן להשתמש בדלפק של קולטר או בהאנטי-הומוציטוטר לספירת תאים.
   3. הזרע את התאים לתוך 6 צלחת הבאר לצורך זרימה cy, ניתוח הזרע 150,000 תאים בגודל 1 מ ל בינוני לכל טוב. המתן 16 שעות לקובץ מצורף לתא.
   4. זרע את התאים לתוך 4 שקופית קאמרית היטב עבור דימות פלורסנט ו-seed 25,000 תאים 0.5 mL של בינוני לכל טוב. המתן 16 שעות לקובץ מצורף לתא.
      הערה: בארות בקרת זרעים בנוסף לבארות טיפול. השתמש באחת מבארות הבקרה כדי לקבוע את מספר התאים (אופציונלי: אם תקופת הקובץ המצורף עבור התאים קצרה מזמן ההכפלה, ניתן להניח שמספר התאים זהה לצפיפות הזריעה) והשני עבור פקד שאינו נגוע (0 מע).

2. אדנגיזציה של התמרה (יום 2 ו -3)

התראה: אדנווירוסים יכולים לגרום למחלות. בעת העברת התאים, השתמש בטיפים מסוננים ובטיפים טהרים, בפיפטות פסטר ובצינורות מיקרוצנטריפוגה עם מלבין 10%.

הערה: פרוטוקול זה הוכח עם כמות מסוימת של התאים הסלולאריים ציטוסול, אך בתאי הסלולר האחרים (למשל, מרחב מיטוכונדריאני או מנשא) יכול להיות ממוקד עם אותו פרוטוקול.

1. צור עקומת מינון-תגובה עבור משרד המידע כדי להשיג את יעילות התמרה הגבוהה ביותר על-ידי חישוב הנפח של אדנווירוס (mL) הנדרש עבור כל ערך משרד ה-i-MB-231 קו תא (טבלה 1):
   
   הערה: סיכוייו פונקציונלי של כל אצווה של מלאי אדנונגיפי, אשר מבוטא כיחידת היווצרות פלאק (pfu) לכל mL, מסופק על ידי החברה. משרד המידע האופטימלי לצורך התמרה שונה בין סוגי תאים. עבור מרבית תאי היונקים, טווח משרד המידע האופטימלי הוא בין 10 ל-300. על פי התגובה התאית, ערכי משרד התקשורת צריכים להיות מחושבים מחדש (למשל, טווח מוי צריך להיות מופחת אם התאים יש תגובה ציטוטוקסיים, או טווח צריך להיות מוגבר אם לתאים יש התמרה נמוכה יעילות).
2. הפוך 1:100 דילול של 6 x 10¹⁰ pfu/mL אדנוויראלי הפתרון עם התרבות התאית בינונית (dmem עם 10% fbs) עבור מלטף אמין.
3. פיפטה ולהוסיף 0.0125 mL (12.5 μL), 0.025 mL (25 μL), 0.05 mL (50 μL) של אדנוויראלי של הדילול לתוך כל באר של 6 צלחת הבאר על מנת לשנות את התאים ה150,000 עם 50, 100, ו-200 מע בהתאמה עבור הניתוח cy, לעבורבטבלה 1.
4. הפיפטה והוספת 0.0042 mL (4.2 μL) של הדילול האנטי-ויראלי בבארות בארבע שקופיות הקאמרית כדי לשנות את 25,000 תאים עם 100 מע להדמיה (שולחן 1).
   הערה: כמות מינימלית של בינונית יש להשתמש בבארות כדי להבטיח את האינטראקציה הגבוהה ביותר בין המבנה והתאים של ה-הנגיף. את התוכן סרום של מדיום התרבות ייתכן שיהיה צורך להקטין עבור קווי תאים שונים, כי רמות גבוהות של סרום יכול להשפיע לרעה על יעילות התמרה בסוגי תאים מסוימים.
5. התאים הדגירה עבור 16 – 24 שעות תחת תנאי תחזוקה תא. למחרת (יום 3), לשנות את המדיום לתרבות התאים בינונית (DMEM עם 10% FBS) כדי לאפשר שחזור התא 24 שעות נוספות. לדמיין את התאים תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את המבנה שלהם; תאים יכולים לבטא את רוfp גם אם יש להם שינויים מורפולוגיים.
   הערה: ביום 3, התאים אמורים להתחיל לבטא את רוfp; לכן, יעילות התמרה ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ קרינה (מסננים עם ex. 488/em. 525). כדי להשיג תוצאות עקביות עקבית, להיות מודעים ולתעד את השינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ הניגודיות פאזה ולבחון מורפולוגיה תוך הערכת יעילות התמרה.
6. לבנות עקומת התגובה מינון באמצעות 50, 100 ו 200 ממוי דגימות מוכן בשלב 2.3 התוצאות יעילות התמרה שלהם שהתקבלו מהניתוח זרימה cy, שלבים 3.1 ו-4.1. הערכת יעילות התמרה אופטימלית עם תיעוד של שינויים מורפולוגיים (שלב 2.5) ואת עקומת המינון-תגובה של משרד הבין.
   הערה: למרות שיותר מ-98% מאוכלוסיית התאים ב-100 מארה ב ו200 מארה ב מבטאים את זה (ראו תוצאות מייצגות), 200 החברה מארה ב הראתה שינויים ניכרים במבנה התאים של תאי מד א-MB-231. כתוצאה מכך, משרד המידע היעיל ביותר עבור תאים מד א-MB-231 היה נחוש להיות 100.
7. לאחר משרד הפנים האופטימלי (כאן, 100 מע) נבחר עבור קו התאים מד א-MB-231, התנהלות ניסוי עם חומרי בדיקה (10 μM H_{2O 2 והרכב} שלה 0.1% המים).
   1. הכן והזרע את התאים לפי סעיף 1. שימוש בנפח התמרה ויראלי עבור 100 מע מחושב בשלב 2.1, חזור על שלבים 2.2-2.4 עבור 100 מארה ב. התמרה ויראלית של תאים. לאחר מכן מודקת את הצלחת ואת שקופיות קאמרית לפי שלב 2.5.

3. רכישת מאזן כלוניים

1. הציטוצינסי זרימה (יום 4)
   1. ביום 4, בתאי הדגירה משלב 2.7.1 עם 10 μM H₂O₂ עבור 1 H.
      הערה: 10 μM H₂או₂ שימש כחומר המבחן ו 0.1% המים האלה שימשו כטיפול ברכב בפרוטוקול זה. סוכני חמצן אחרים יכולים לשמש כפקדים חיוביים כאן.
   2. מספר מדיה מ 6 צלחת הבאר, להחליף עם 750 μL של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון ולחכות 2 דקות לתאים להתנתק. הפעל טריפסין עם 2 מ ל של בינוני מלא (DMEM עם 10% FBS) ולאסוף את אמצעי האחסון לתוך 15 מ"ל שפופרות חרוט.
   3. צנטריפוגה את הצינורות ב 150 x g עבור 5 דקות ב 4 º c. להיפטר supernatant ולהשעות את התאים ב 500 μL של מלוחים מאגור פוספט (PBS).
   4. חזור על שלב 3.1.3
   5. לסנן את השעיות התא לתוך הזרימה cy, התואם צינורות באמצעות 40 יקרומטר רשת שינוי. לשמור על הצינורות על הקרח והרחק מן האור ובצע צעד 4.1 עבור ניתוח נתונים.
2. הדמיה מיקרוסקופית (יום 4)
   1. ביום 4, לטפל בתאים עם 10 μM H₂O₂, לרכוש תמונות מיד (נקודת זמן 0) ו 1 H לאחר הטיפול ובצע צעד 4.2 עבור ניתוח נתונים.

4. ניתוח נתונים

1. מכמת
   1. הגדרת שיטת הזרימה cy, עבור 3 ניתוחים שונים באמצעות תוכנה לרכישתמדגם (ראה טבלת חומרים): פיזור הקדמי (fcs) על ציר x ופיזור בצד (הסוכנות למען המוות) על ציר y כדי להעריך את גודל התא ואת המורכבות של תאים (הסוכנות למען האו לזיהוי מחוספס של תאים לחיות); לשעבר. 488 ננומטר 525 ננומטר (פלואורואסעין איזוטיאוקלאט [FITC]) מסנן על ציר ה-x ו-אס. סי. על ציר y כדי להעריך את CyS-רוfp; לשעבר. 405 ננומטר 525 nm (סגול מבריק 510 [BV510]) מסנן בנדנה על ציר ה-x ו-ss על ציר y כדי להעריך CySS-רוfp.
   2. רוכשים בקרת משרד הפיקוח 0 ומדמיינים תאים עם תוכנת רכישה לדוגמה. חזור על שלב זה עבור הדגימות הנותרות (50, 100, 200 ממוי קבוצות ומאוחר יותר על 10 μM_{H 2}O₂ תאים מטופלים ותאים טיפול בכלי רכב). שמור את הקבצים לניתוח נתונים.
   3. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים (ראה טבלת חומרים) ופתח קובץ לדוגמה 0 ממוי. הערכת האוכלוסיה של התאים המעניינים (שער 1). הגדר את הגגים הבאים כדי למזער את הזריחה של הרקע עבור ex. 488 ננומטר/em. 525 nm (שער 2) ו-ex. 405 ננומטר/em. 525 nm (שער 3) מסנני בנדנה עם תאי בקרה שאינם נגועים (0 מע).
   4. פתח את הקבצים 50, 100 ו-200 מארה ב בתוכנת ניתוח נתונים כדי להעריך את עקומת תגובת המינון. לנתח את עוצמות הזריחה עם גייטס 2 ו 3 עבור כל מדגם. חזור על שלב זה עבור דגימות בדיקה (10 μM H₂O₂ תאים מטופלים ותאים הטיפול ברכב).
   5. לחשב את היחס עוצמת פלורסנט ממוצע בין תחמוצת לעומת צורות מופחתת של רוfp עם המשוואה הבאה.

2. הערכת תמונות
   1. השתמש במיקרוסקופ המכיל מסנני קרינה עבור CyS-רוfp ו-CySS-רוfp (ex. 488 ננומטר/em. 525 nm ו ex. 405 ננומטר/em. 525 מסננים ננומטר, בהתאמה).
   2. בכל באר של שקופית קאמרית, לבחור 4 אזורים אקראיים להשיג תמונות, באמצעות מטרת 4x כדי להמחיש אזורים גדולים יותר.
      הערה: ניתן להשתמש במטרה 20x גם עבור תצוגות תמונה.
   3. פתח את התמונה באמצעות תוכנת ImageJ¹¹. החל את הניתוח | למדוד פקודות עבור כל תמונה ולהשתמש במשוואה בשלב 4.1.5 כדי לכמת את הנתונים.
      הערה: קוונפיקציה של התמונות הוא מטימטרי; לפיכך, הפרוטוקול אינו כולל חיסור של רקע. עם זאת, כדי שתוכל להשוות בין תמונות, בהירות, ניגודיות ורוויה, עליך להיות זהה עבור כל תמונה. מובהקות סטטיסטית הוערך בניתוח חד כיוון של שונות (ANOVA) ו-Tukey הבדיקה הפוסט הוק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המצב החדש של ה-CyS/CySS הוא בקלות עם התמרה באמצעות מדידה של רוfps. בדיקת פלורסנט מכמת את היחס בין צורות מופחתת ו תחמוצת (העירור אורכי גל 488 nm ו 405 nm, בהתאמה). נתונים בעלי קרינה פלואורסצנטית ניתן להשיג על ידי שניהם cy, הזרמת לנסות מיקרוסקופ.

מספר גדול של תאים יכול בעקביות ובנוחות להיות ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

האיזון הטימלי/דיגופרתי באורגניזם משקף את מעמדם החדש של תאים. אורגניזמים חיים יש גלוטתיון, cysteine, החלבון thiols, ו נמוך מולקולרי משקל thiols, כולם מושפעים על ידי רמת החמצון ואת הד מעמד החמצון של תאים⁴. הנדסה מהונדסים לאפשר את הכמת הבלתי מפריעה של האיזון thiol/disulfide באמצעות שאריות CyS שלהם

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Sciences	25200-056	Cell culture
4-well chamber slide	Thermo Scientific	154526	Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap	Falcon	352235	Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate	Corning	353046	Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes	MidSci	C15B	Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks	Corning	4306414	Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP	ViraQuest	VQAd roGFP	roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet	Thermo Scientific	1300 Series A2	Cell culture
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227	Cell counting
Countess cell counter chamber slides	Invitrogen	C10283	Cell counting
DMEM	Gibco by Life Sciences	11995-065	Cell culture
FBS	Atlanta Biologicals	S11150	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl	Fisherbrand	02-717-161	Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl	Fisherbrand	02-717-166	Cell culture
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa	Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope	Advanced Microscopy Group (AMG)	Evos FL	Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30%	Fisher Scientific	H325-100	Positive control
Light Cube, Custom	Life Sciences	CUB0037	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP	Thermo Scientific	AMEP4651	Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231	American Tissue Culture Collection	HTB-26	Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml	Grenier Bio-One	623201	Cell culture
PBS	Gibco by Life Sciences	10010-023	Cell culture
Pipet controller	Drummond	Hood Mate Model 360	Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml	Fisherbrand	13-678-11B	Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml	Fisherbrand	13-678-11D	Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml	Fisherbrand	13-678-11E	Cell culture
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	HERACell 150i	CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell counting