JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

דיוקולורה היא אורגניזם מודל מטונלי בתחומי הביולוגיה השונים. אנו מתארים שיטות דגימה, זיהוי מינים, התקנת culturing, ו culturing פרוטוקולים עבור בעלי חיים והזנה פריחת אצות. אנו מדגישים גורמי מפתח שסייעו לחזק את מערכת התרבות ולדון בבעיות וברזולוציות האפשריות.

Abstract

הקבוצה של אויקוקולורה היא דמית המטוס עם יכולת יוצאת דופן האכלה מסנן, זמן דור מהיר, שימור מוקדם התפתחות, ו הגנום קומפקטית. מסיבות אלו, הוא נחשב לאורגניזם מודל שימושי למחקרים אקולוגיים ימיים, ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית וגנומיקה. כאשר מחקרים דורשים לעתים קרובות אספקה קבועה של משאבי בעלי חיים, זה שימושי להקים מערכת התרבות אמין, תחזוקה נמוכה. כאן נתאר שיטת צעד-אחר-צעד להקמת תרבות של א. דו . אנו מתארים כיצד לבחור אתרי דגימה פוטנציאליים, שיטות איסוף, זיהוי בעלי חיים היעד, ואת הגדרת מערכת culturing. אנו מספקים ייעוץ לפתרון בעיות בהתבסס על ההתנסויות שלנו. כמו כן אנו מדגישים גורמים קריטיים המסייעים לקיים מערכת תרבותית חזקה. למרות שפרוטוקול התרבות שסופק כאן הוא מיטבי עבור O. דיואיקה, אנו מקווים שטכניקת הדגימה והגדרת התרבות שלנו תעודד רעיונות חדשים לשמירת חסרי חוליות שבירים אחרים.

Introduction

אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי בטיפול בשאלות ביולוגיות רבות כולל אלה הנוגעים פיתוח, גנטיקה, ופיזיולוגיה. יתר על כן, אורגניזמים נוספים מודל להקל על גילויים חדשים ולכן הם חיוניים כדי להשיג הבנה גדולה יותר של הטבע1,2. זואופלנקטון ימיים הם קבוצות מגוונות של אורגניזמים לשחק תפקיד חשוב באוקיינוס האקולוגית3,4,5,6. למרות השפע והחשיבות האקולוגית שלהם, אורגניזמים של ז'לטין כגון מינהור פלנקטון הם לעתים קרובות תחת מיוצגים במחקרים פלנקטון ביולוגי משום שקיפות שלהם שברישלהם להפוך את אוסף השדה ואת הזיהוי מאתגרת7,8. טכניקות דגימה מותאם ומעבדה לאפשר התבוננות מקרוב של בעלי החיים בתוך מבחנה, אשר הפכה את הידע בביולוגיה של מינהור פלנקטון9,10,11,12.

לאראמיאות (נספחים) הם מחלקה של שחייה ימית ללא תשלום הכוללת כ-70 מינים שתוארו ברחבי העולם8,13. כפי שהם אחת הקבוצות הנפוצות ביותר בתוך זואופלנקטון קהילות14,15,16,17, לאראמיאות מייצגים מקור מזון עיקרי לאורגניזמים גדולים פלנקטון כגון הזחלים דגים18,19. בניגוד לבני-הזוג-מורפולוגיה, שומרות על המבנה של ראשן, ונשארים מפלקוניים לאורך כל חייהם20. כל חיה מתגוררת בתוך מבנה מורכב, הניזון ממסננים, הידוע כבית. הם מצטברים חלקיקים בבתיהם על ידי יצירת זרמי מים דרך התנועה גלית של זנבות שלהם21. בתים סתומים נמחקים לאורך כל היום, שחלקם יוצרים אגרגטים פחמן ובסופו של דבר לשקוע אל קרקעית הים22; כך, לאראמיאות לשחק תפקיד מרכזי השטף פחמן גלובלי23. רוב המינים מדווחים לחיות באזור פלזה בתוך 100 העליון של העמודה המים13; עם זאת, הענק הגדול הבאוורצ מכונה לאכלס את מעמקי 300 m24. מחקר על האמבטיה במונטריי ביי, קליפורניה חשפה כי בעלי החיים משמשים גם וקטור ביולוגי של microplastics, מציע חשיבות פוטנציאלית בהבנת התפקיד של נספחים בתחבורה האנכית והפצה של microplastics באוקיינוסים25.

בשנים האחרונות כאורגניזם מודל,מושך את תשומת הלב בשנה האחרונה למודל בגלל כמה מאפיינים יוצאי דופן. הוא מדווח בדרך כלל ברחבי האוקיינוסים בעולם. הוא בשפע במים החוף26, אשר מאפשר דגימה קלה מן החוף. לטווח ארוך, מעגלי יציבה אפשרי עם מי-ים טבעיים ומלאכותיים27,28,29. זמני הייצור התלויים בטמפרטורה קצרים כמו 4-9 ימים בתנאי מעבדה. היא בעלת פוריות גבוהה עם כל נקבה המסוגלת לייצר > 300 ביצים לאורך כל השנה. כמו tunicate, זה תופס עמדה פילוגנטי חשובה להבנת אבולוציה מיתרניים30,31. ב 70 מגה, O. דיואיקה יש את הגנום הקטן ביותר שזוהו בין כל chordates32. בקרב לאראמואים, או. דיואיקה הינו המינים היחידים שאינם מהדיכודסטיים עד כה33.

התרבות הראשונה בעלת מיקרואצות מPaffenhöfer במעבדה, דווחה על ידי ה- 34. פרוטוקול התרבות המקורי באמצעות מנועים סינכרוניים ומשוטים פותחה על ידי Fenaux ו גורסקי35 ומאוחר יותר אומצה על ידי מעבדות מרובות. לאחרונה, Fujii et al.36 דיווח O. דו כאניקה בתוך מי ים מלאכותיים, מערכת תרבות חזקה ואוסף השדה תוארו על ידי זר והפרוטוקול ממוטב עבור מערכת פשוטה, במחיר סביר דיווחו על ידי מארטי-solansואח ' 29. מלבד מערכת התרבות המסורתית אויקוקולורה , עיצוב חדש שדווחו עם מיכל גידול כפול של שפופרת יש גם את הפוטנציאל לתרבות אויקופליורה sp. 37.

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לייזום מונואולית O. הדו המבוססת על שילוב של פרוטוקולים שפותחו על ידי קבוצות מחקר של אויקויורה העיקרי בבית הסארס הבינלאומי לביולוגיה מולקולרית של ימית27, אוניברסיטת ברצלונה29, אוניברסיטת אוסקה28, ותצפיות שלנו. בפרוטוקולי התרבות שפורסמו בעבר, מידע מפורט על ההרכב של פריחת אצות מדיה, שיטות דיגום החוף, וזיהוי אויקופליורה היו רק מתוארים בערך, השארת הרבה בהירות. כאן, בעזרת מידע חזותי בפרוטוקול וידאו, הרכבנו את כל המידע הקריטי הדרוש כדי להקים תרבות O. דיוקה מהיסוד באופן פשוט, צעד אחר צעד. אנו מתארים כיצד להבדיל o. דיואיקה ממינים אחרים שבדרך כלל דיווחו, O. longicauda, שהוא אחד השלבים המאתגרים ביותר. למרות שמערכות התרבות הקיימות חלות על הטיפוח של O. דיוקה ברחבי העולם, אנו מדגישים את חשיבות התאמת הפרוטוקולים המבוססת על תנאים סביבתיים מקומיים. המידע המוצג משלב נתונים שפורסמו באופן נרחב וכן ידע שהושג באמצעות התנסות. הפרוטוקול הנוכחי מתאים באופן אידיאלי לחוקרים המעוניינים להקים תרבות מבראשית.

Protocol

1. O. דו מתקן תרבות

  1. מערכת מסנני מים (איור 1)
    1. לאסוף מי ים טבעיים מנמל בעומק 2-3 m. להעביר את מי הים דרך מסנן חול (גודל הנקבוביות 1.4 מ"מ) והובלה למיכל מאגר משותף במעבדה. השתמש במסנן המיכל כדי להפיץ את המים על מנת לשמור על איכות המים במיכל המאגר המשותף.
    2. בחדר התרבות, להגדיר מערכת מסנן מרובת השלבים המורכב של מיכל האגירה 100 L עם משאבת כונן מגנטי, 5 יקרומטר ו-1 יקרומטר פוליפרופילן הפצע מסנני מחסנית, ו מחטא UV (100 V) (איור 1).
    3. העבירו את מי-הים ממיכל האגירה המשותף אל מיכל האגירה של חדר התרבות. להעביר את מי הים דרך יחידת מסנן 25 יקרומטר (איור 1א, ב) לפני הכניסה מיכל המים בחדר התרבות. להפיץ את מי הים דרך 5 ו-1 יקרומטר מסננים לילה כדי להסיר ביסודיות חלקיקים שעלולים לעכב את התפתחותם של בעלי חיים.
      הערה: מסנן נוסף עם גודל שינוי גדול יותר (25-50 μm) שימושי כדי למנוע מחלקיקים גדולים יותר לסתימת מסנני המחסנית עם גודלי רשת קטנים יותר. מי הים המסוננים (fSW) מוכן לשימוש בבוקר שלמחרת.
  2. היחידה לתפירת מסוקים (איור 2)
    1. לשמור על בעלי חיים ב 5 או 10 L עגול, כוסות פלסטיק שקוף.
    2. מקום כוסות התרבות על יציבה, שתי רמות נירוסטה יחידת מדפים (L x W x H = 150 ס"מ x 45 ס"מ x 90 ס"מ) עם 5 מ"מ עובי, משטח אקרילי שקוף.
    3. הצב נורות פלורסנט לבנות מתחת למשטח אקרילי כדי להאיר את החיות מתחתית הספלים.
    4. מניחים סדין פלסטיק שחור. מאחורי הספלים הסדין השחור יוצר ניגוד ומגביר את ההדמיה של החיות השקופות.
    5. חיבור מנועים חשמליים סינכרוני למשוטים אקריליק (L x H = 8 ס"מ x 27 ס"מ) (קובץ משלים 2). השהה את המשוטים בתוך כוסות התרבות מהמסילות המקבילות הפועלות לאורך מדפים המדפים (איור 2A).
    6. להפעיל את המנועים כדי ליצור תנועה מעגלית עדין ב כוסות ב 15 סל ד.
      הערה: בעלי החיים בבתים התאית שלהם מאוד קליל; עם זאת, מחזור מים מסייע לשמור ביצים, הזחלים, ומזון פריחת אצות להיות מושעה ומופץ באופן שווה בתוך כוסות התרבות.
  3. משאבת מינון אוטומטי (אופציונלי)
    הערה: יחידת האכלה אוטומטית מפחיתה את דרישות האיוש, במיוחד בסופי שבוע.
    1. כיול את עוצמת הנפח של הנוזלים ממשאבת מינון אוטומטית בהתאם להוראות היצרן.
    2. השימוש 50 mL צינורות כמו מאגרים פריחת אצות.
    3. מקדחה שני חורים 5 מילימטר על כמוסות של צינורות 50 mL לעבור צינורות התעופה. חבר צינורית אחת לתוך משאבת האוויר האקווריום רגיל כדי להציג בועות אוויר, ואת הצינור השני לנמל החלל של משאבת מינון (איור 2B).
      הערה: היכרות עם זרם דק של בועות אוויר עוזר למנוע אצות להתיישב על החלק התחתון של הצינורות.
    4. לתכנת את הזמן והנפח של הזנת פריחת אצות ביום נתון.
  4. תחנת אצות
    1. השתמש יחידת מדפים (L x W x H = 90 ס"מ x 46 ס"מ x 115 ס מ) למקום ארבעה 1 L מבחנות התחתון עגול המכיל את התרבויות עבודה פריחת אצות (ראה שלב 2.1).
    2. בחזרה להאיר את תרבויות העבודה על ידי הצבת אורות פלורסנט מאחורי צלוחיות.
    3. חותם מבחנות עם עוצרי גומי שני חורים.
    4. העבירו מיכל צינורות חד-ממדי. בעזרת פקק הגומי השימוש צינורות התעופה כדי לחבר את הצינורות למשאבת אוויר באקווריום. להציג זרם של בועות אוויר בבקבוקון.

2. מזון מיקרואליגל

  1. ייזום תרבויות אלגל
    הערה: יש לשמור על שלושה סטים של תרבויות (מניות, תתי ומין) עבור שלושה מינים של מיקרואליגל, צ'אטוצרנוס קלאוקיראן, איזוקריזיס sp., ריקואומיה רטיקולטה, ומינים אחד של כחוליות, סינוכוקוקוס sp. מלאי ותרביות משנה משמשות כגיבויים. תרבות העבודה משמשת להזנה יומית.
    1. הכינו ריאגנטים לגידול מיקרואצות וכחוליות (שולחן 1).
    2. כדי ליזום תרבות המניה, האוטוקלב (121 ° c, 25 דקות) 60 – 80 mL של fSW בבקבוקון 100 mL. החיסון העצמי שצוין כמות שונה של קונוויי בינונית27 ו מיקרואצות (שולחן 2). לדוגמה, כדי לחסן את התרבות של מניות של C. calcitrans 60 mL של מי ים, aseptically החיסון 30 μl כל אחד של ויטמין ופתרון a, 15 μl של נתרן סיליקט, 60 μl של סטרפטומיצין, ו 30 μl של C. calcitrans מן התרבות המניה הקודמת.
      הערה: ר. רטיקותה הופך מורוד-אדמדם ל-orangish-חום כאשר הוא נחשף לאור רב מדי. להעביר אותם הרחק מהאור ברגע שהם התחילו לפנות ברור לאור ורוד.
    3. שמרו על תרבות המניה בחממה שנקבעה ב -17 ° c עם תאורה רציפה. לאחר כעשרה ימים, התרבות משנה את צבעו כדי לציין את צמיחת האצות (איור 3). לאחר הופעת הצבעים, הזז אותם ל-4 ° צ' לאחסון לטווח ארוך עד חודש אחד.
    4. על ספסל נקי, כתוביות לעיבוד תת-תרבותי מתרבות המניה (שולחן 2). מודטה ב -17 ° c עם תאורה רציפה. לאחר הופעת צבעי פריחת אצות, המשיכו לאחסן אותם בחממה עד שבועיים.
    5. איחסן עבודה תרבותית מתתי-תרבות (שולחן 2). סגרו את הבקבוקון בעזרת כובע גומי והכניסו צנרת חד פעמית מ-mL. הזיזו את הבקבוקון לתחנת האצות והישארו בטמפרטורת החדר עם שמונה שעות. . אספקה עם האנטנה הקבועה לחדש את תרבות העבודה כל 4 ימים.
    6. מערבבים מלאי ותרבויות משנה פעמיים ביום על ידי מתערבל.
      הערה: האחסון לטווח ארוך של תרבות פריחת אצות על מדיה מוצקה והקפאה הקריוגנית אפשריים עד 3 חודשים ו 1 שנה, בהתאמה29.
  2. יצירת עקומות גדילה של פריחת אצות (אופציונלי)
    הערה: הערכה מדויקת של כמות האכלה חשובה לשמירה על תרבות יציבה של . יצרנו עקומות גדילה לשתי מינים עיקריים של מזון האלגל, צ'אטוצרנוס קלציטרנס ואיזוקריזיס sp.
    1. היכונו C. קלציטרנס ואיזוקריזיס sp. תרביות עבודה (שולחן 2).
    2. לכל זן של תרבות העבודה, לדוגמא שלוש פעמים נפרדות וספיגת מידות ב 660 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה. קח את המידות הממוצעות של הטריליטים מכל תרבות שעובדת.
    3. לאחר הוראות היצרן עבור מונה תאים אוטומטי, הכינו דגימות פריחת אצות לספירה. . תספור כל דוגמא שלוש פעמים קח את הממוצע של שלושה ספירות כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים הנמצאים בכל דוגמה.
    4. המשך לספור מדי יום עד כ-50 מדידות ממוצעות.
    5. ליצור עקומות גדילה עבור מינים של פריחת אצות (איור 4).

3. אוסף השדות של אויקוטורה הפראית

  1. שינוי הפלנקטון נטו (איור 5)
    הערה: המפתח לדגימה מוצלחת של אויקופורה spp. הוא גרירה איטית של פלנקטון נטו עם משוקלל, ללא סינון בקלה סוף. איור 5 מראה תרשים סכמטי של רשת פלנקטון ששונתה.
    1. החלף את בקלה בסוף של מחזיק כף יד הפלנקטון עם שונה 500 mL בורג שטיפת בקבוק העליון.
    2. מקדחה חור בקוטר 3 ס מ בורג בקוטר 4 ס מ של בקבוק לשטוף כדי לאפשר למים ובעלי חיים להיכנס לסוף בקלה.
    3. התאימו את כובע הבקבוק. בקצה רשת הפלנקטון עטפו אותו בחוזקה בעזרת הקלטת החשמלית. אבטח את המכסה עוד יותר עם מהדק צינור נירוסטה.
    4. לצרף משקל 70 g לחלק החיצוני של בקלה סוף שונה עם מיקוד.
    5. חברו את הרצועה בטיחות כדי לאבטח את הקצה.
  2. בחירת אתרי גבייה (איור 6)
    הערה: כל הקולקציות לדוגמה אושרו על-ידי ועדת בטיחות השטח של אסכולת הביטחון. ייתכן שישנה וריאציה עונתית בנוכחות אויקוטורה spp. בהתאם למיקום (איור 6). הימנע מדגימה מיד לאחר אירועי מזג אוויר קיצוניים כגון סופות גשם חמורות.
    1. השתמש בתצוגת הלווין באתר האינטרנט של המפה כדי לזהות אתרי דגימה פוטנציאליים. התמקדנו בנמלים וברציפים שנגישים בקלות באמצעות מכונית וממוקמים בתוך מפרצים או בקרבת האוקיאנוס ה, היכן שפלנקטון נוטים להצטבר: איהיקאווה הארבור במפרץ קין, אוקינאווה, יפן (GPS: 26 ° 25 ' 39.3 "N 127 ° 49 ' 56.6" E).
    2. בקר במיקומי הדגימה הפוטנציאליים כדי להעריך את הנגישות והבטיחות של החוף בכל אתר. השג היתר גבייה מהרשויות המקומיות לפי הצורך.
  3. פרוצדורת דגימה
    1. מטילים את רשת הפלנקטון לתוך הים ומאפשרים לקצה-בקלה לשקוע 1-2 מ' מתחת לפני המים.
    2. לגרור את הרשת אופקית ביד ב 50-100 ס מ s-1. המשך לגרור על ידי הליכה הלוך ושוב במשך 2-5 דקות. התאימו את זמן הגרירה בהתאם לשפע הפיטופלנקטון בנמל, עם גרירה קצרה יותר כשיש יותר פיטופלנקטון.
      הערה: לאראמיאות הם חיות שבירות. גרירה מהירה או הליהוק חוזר של הרשת עלול לפגוע בבעלי חיים לכודים בסוף בקלה.
    3. . הרם בעדינות את הרשת להעביר באיטיות את התוכן של סוף בקלה לתוך בקבוק זכוכית 500 mL עגול. ממלאים לחלוטין את הבקבוק עם מי ים כדי למנוע בועות אוויר.
      הערה: הנוכחות של אויקופורה spp ניתן לאישור על ידי הצגת בקבוקי לדוגמה נגד רקע שחור. רוב בעלי החיים נוטשים את בתיהם בזמן שנאספו. לכן, יש צורך בהשגחה מיקרוסקופית לזיהוי ברמת המינים.
    4. הדגימה חוזרת עד שבקבוקי 3 500 mL נאספים.
    5. מדידת מליחות, טמפרטורה, ו כלורופיל a באמצעות profiler CTD כדי לתעד את טווח הפרמטרים הפיזיים שבו בעלי חיים קיימים באופן טבעי.
    6. איסוף 10-15 L של מי-ים של פני השטח בדלי כדי להתרגל לבעלי חיים בסביבה המעבדה.

4. בידוד וזיהוי בעלי חיים (איור 7, איור 8)

  1. Oikopleura תעודת זהות
    הערה: אורגניזמים פלנקטון אחרים הדומים לאויקויורה spp. במבט ראשון כוללים הצ, פריטילריה spp., nematodes, הזחלים דגים עם שקי חלמון, ו ciona spp. הזחלים.
    1. כדי לחבר בעלי חיים לתנאי מעבדה, להעביר כל 500 mL דגם 10 L המכיל 1:1 יחס של מי ים משטח ממיקום הדגימה מסוננים מי ים (fSW) הנשמרת במעבדה (איור 7a, B). כוונן את עוצמת הקול של הגביע ל-5-10 L בהתאם לריכוז דגימת הפלנקטון.
      הערה: אם דגימת פלנקטון מכילה פסולת בלתי רצויה, לרוץ דרך מסנן גס (גודל שינוי ~ 600 μm) לפני העברת לגביע 10 L.
    2. השתמש מחבט מחובר מנוע חשמלי סינכרוני (15 סל ד) ולשמור על הפלנקטון בהשעיה לילה (שלב 1.2.5).
    3. זיהוי של אויקוקולורה spp. על ידי מחפשים 1-2 מ"מ ארוך, ראשן בצורת חיות גלית זנבות שלהם בתוך בית כדורית, שקוף. בעלי חיים עשויים להיות חופשיים לשחות באופן זמני ללא הבתים. העברה עדינה של ~ 5 בעלי חיים לצלחת פטרי ריקה תוך שימוש בפיפטה קהה.
    4. לסוג הזדהות, לפנות בעלי חיים מבתיהם על ידי דקירה עדינה של הבית עם פיפטה העברה.
    5. שימו לב בעלי חיים שאינם מתחת למיקרוסקופ שדות בגובה 20-40x ומאשרים את אויקופורה Spp (איור 8).
  2. תעודת זהות
    הערה: O. דיוניקה יכולה להיות מזוהה באופן חזותי על ידי נוכחות של זכרים בוגרים ונקבות או שני תאים תת-כוראתיים גדולים הממוקמים במחצית השנייה של זנבות שלהם. המרחק בין שני תאים תת-כוראתיים עשוי להשתנות בין אנשים.
    1. לאחר מכן, בדוק אם יש אויקוקולורה מבשיל לחלוטין עם זיבה המלאה בביצים (איור 8a) או זרע (איור 8a). אם החיה מחזיקה רק ביצים או זרע, לדלג לשלב 4.2.3 כפי שהוא O. הדו, המתואר רק מינים לא הדיכוטיים.
    2. אם בעל החיים אינו בוגר (איור 8C), חפש שני תאים תת-משניים בסוף זנבו (איור 8c).
    3. , ברגע שהמין יאושר. העבירו אותו לצלחת פטרי חדשה חזור על הצעדים 4.1.3-4.2.2 עד 10-20 אנשים מאושרות ברמת המינים.
      הערה: לזיהוי קל יותר, בעלי חיים מורדם בצלחת פטרי המכילה 0.015% tricaine מתיונין (MS222) ב-fSW.
    4. השאר את הספלים מושעים . ליום או יומיים נוספים יכול להיות שאין בוגר או דיואיקה שימשיך לצמוח ולהיות קל יותר להתגלות. אם אף אחד לא מופיע לאחר שבוע, מחק את המדגם ונסה שוב לדגום.

5. הליך הטיפוח של O. דיואיקה

  1. ביצוע מדגם מונוטקה מתחום שנאסף (איור 7)
    הערה: מזון Algal מוכן מדי יום מתרבויות עבודה וכל גביע מונותרבותי מוזן שלוש פעמים ביום ב -9 בבוקר, בשעה 12:00, ו-17:00, בהתאמה (ראה שלב 5.2). החיות נשמרות ב -23 ° c. בתנאים אלה, מחזור החיים של אוקינאווה O. דיואיקה הוא 4 ימים (איור 7c).
    1. כדי ליזום תרבות של O. דיוקה, לבודד 120 בעלי חיים ולהעביר לגביע חדש המכיל 5 L של fsw טרי (איור 7ב, ג).
    2. למחרת בבוקר, חפשו גברים בוגרים עם בעלי-הגונדות צהובים ונקבות עם ביצים המופיעות כספירות זהב (איור 8א, ב).
    3. להפוך את הגביע ההשמה על ידי העברת בעדינות 15 זכרים 30 נקבות לגביע חדש המכיל 2.5 L של fSW טרי עם הצינורות 5 mL בוטה-end.
      הערה: אם אין מספיק זכרים ונקבות, להעביר מבוגרים רבים ככל האפשר לגביע המכיל 1 L של fSW ולתת להם להשריץ באופן טבעי. כדי למזער את הלחץ הפיזי לבעלי חיים במהלך העברה ידנית, הם צריכים לשאוב לאט ושוחרר מתחת לפני המים.
    4. תן לחיות להשריץ בטבעיות. כדי ליזום את הדור הבא הזחלים זנב צריך להופיע כ 3 שעות לאחר ההפריה.
      הערה: השוהם מבוצעים על ידי בעלי חיים מובכים מלאים שנוטשים את בתיהם, שוחים לעבר מי התהום, ומשחררים את המגיים שלהם. הפריה מוצלחת יכול להיות מאושר על ידי חילוץ 5-10 mL של מי ים מהחלק התחתון של בגביע ההשכן וזיהוי ביצים עם בקלינים תחת מיקרוסקופ.
    5. בבוקר הראשון שלאחר ההשרצה (יום 1), דור חדש של בעלי חיים עם בתים מנופחים צריך להופיע בגביע. השתמש 500 mL בגביע מוחזק ביד כדי להעביר בעדינות את התוכן של הגביע השההשריץ לתוך גביע חדש המכיל 7.5 L של fSW טרי (ביצוע סך של 10 L). יוצקים בזווית כדי למנוע תנועה מתיז.
    6. בבוקר השני (יום 2), העברת באופן ידני 150 בעלי חיים לגביע חדש המכיל 5 L של fSW טרי.
    7. בבוקר השלישי (יום 3), להעביר באופן ידני 120 בעלי חיים לגביע חדש עם 5 L של fSW טרי.
      הערה: כדי לסנכרן את ההתפתחות של בעלי חיים, חשוב לבחור אנשים בעלי גדלים דומים במהלך ההעברה הידנית ביום 2 ו-3. מקסימום של 10 בעלי חיים ניתן לשאוב בהעברה אחת.
    8. בבוקר הרביעי (יום 4), בעלי חיים מבשיל לחלוטין צריכים להופיע. חזור על שלב 5.1.3 כדי לסגור את מחזור החיים.
      הערה: ניתן להגדיר משאבת האכלה אוטומטית כדי להאכיל את בעלי החיים ב-17:00 בסופי שבוע ללא נוכחות של צוות culturing.
  2. הכנה יומית של מזון אלגל מתרבות העבודה
    1. למדוד את ספיגת תרבות העבודה ב 660 ננומטר.
    2. מבוסס על תרשים האכלה יומית, לגלות כמה תאים פריחת אצות צריך להיות מוזן עבור בעלי חיים בגודל ספציפי (שולחן 3).
    3. באמצעות עקומות גדילה פריחת אצות (איור 4), לפתור את המשוואות להלן כדי לחשב את נפח של מזון פריחת אצות (mL) נדרש ביום נתון.
      1. כדי לחשב את הנפח של אצות מסוימות הדרושות ליום מסוים וזמן האכלה, השתמש במשוואה הבאה:
        figure-protocol-13913
        figure-protocol-13984
        figure-protocol-14055
        figure-protocol-14126
        figure-protocol-14197
        figure-protocol-14268
        figure-protocol-14339
        היכן YA היא הריכוז פריחת אצות ביום נתון ו הוא נפח של אצות הדרושים לכל האכלה. יתר על כן, הקשר הליניארי בין YA ל- x, הערכים לחיתוך (c) ולשיפוע (m) מוצגים באיור 4. עיין בטבלה 3 עבור ערכי K .
      2. לדוגמה, כדי לחשב את עוצמת הקול של איזוקריזיס sp. הצורך ב-9 AM האכלה של יום 3 בעלי חיים שמרו על התרבות 5 L עם ספיגת פריחת אצות של 0.234 (נמדד ב 660 nm), הבאים חושבו:
        figure-protocol-14904
        figure-protocol-14975
        הערה: אחסן משוואות אלה בגיליון אלקטרוני כך שכמות ההזנה היומית מחושבת באופן אוטומטי על בסיס מדידות ספיגה, גודל החיות, וכמות מי-הים של התרבות (קובץ משלים 1).
    4. העבר את הנפח המחושב של אצות לצינורות 50 mL, צנטריפוגה ב 5000 x g עבור 5 דקות ב 20 ° c.
    5. . הסר את הסופרנטאנט ממלאים את הצינורות בחזרה לכרך המקורי עם fsw טרי, החלפת מדיה פריחת אצות הישן.
    6. אחסן מזון מוכן במקרר עד שיהיה מוכן לשימוש עבור ההזנה הבאה. בבוקר שלמחרת, הכינו את האוכל הישן לאחר שהאוכל החדש מוכן.
  3. פחם פעיל (אופציונלי)
    הערה: 10 גרם של פחם מופעל מתווסף לכל גביע התרבות כדי לשמור על איכות המים. ניתן להשתמש בפחמים עד ארבע פעמים. פתח את תיק הפחם לאט כדי למנוע אבק פחמים להיכנס לתוך כוסות התרבות.
    1. העברת ~ 700 g של פחם פעיל במיכל. לטבול במים טריים (FW) במשך 48 שעות ולאפשר להם להתיישב בתחתית.
    2. לשטוף עם FW להסיר אבק פחם שיורית.
    3. מרתיחים פחם ב FW עבור 15-20 דקות. להסיר מהחום ולאפשר קריר.
    4. לשטוף עד רוב אבק הפחם מוסר, והמים הופכים ברורים.
    5. לאחסן פחם נקי 2 בגביע L המכיל fSW. כסו את הגביע כדי למנוע כניסת אבק.
    6. הוסיפו פחם לכל גביע חדש לפני שאתם מעבירים את החיות.

תוצאות

אויקופטורה ניתן לאסוף מסירה או מנמל על ידי איטית, גרירה עדינה של הרשת פלנקטון של 100 יקרומטר שינוי עם מסנן ללא סינון (איור 5). בשל טבעו השברירי של בעלי החיים, חשוב להימנע מכל תנועה שעלולה לגרום ללחץ פיסי, כגון טיפול מחוספס ברשת או התזת עקב כיס אוויר לכוד בצנצנת המדגם.

חשוב להבין את התבנית העונתית של אוכלוסיית אויקוקולורה המקומית, כמו גם את התנודות הנלוות במאפיינים הפיזיים של המים באתר הדיגום. הדגימה בין 2015 ל-2019 חשפה וריאציה עונתית עקבית בנוכחותו של O. דיוצה באיהיקאווה ומין נמלים באוקינאווה (איור 6). הטמפרטורה של מי-ים משטח נראה גורם משמעותי. או. דיואיקה היה הגזע הדומיננטי כאשר מי-ים הגיעו ל-≥ 28 ° c, ו -o. longicauda תקיימה לצד התקיים עם O. דיואיקה בטמפרטורה בין 24 ° c ו -27 ° c; עם זאת, O. longicauda נשלט מתחת 23 ° צ' (איור 6a). שינוי הדרגתי במליחות לאחר מספר ימים רצופים של גשם כבד לא התאם את השפע של O. דיופיקה (איור 6b).

באמצעות הליכי דגימה שתוארו לעיל, רוב O. דיואיקה התאוששו היו בין היום 2 ו -3 של מחזור החיים של 4 ימים (איור 7c). זכרים בוגרים הכירו על ידי הצבע הצהוב של הגונדות, ואילו בלוטות המין הנשי שימררו זהב מביצים שהיו 70-80 יקרומטר בקוטר (איור 8א, ב). בוגר O. דיוקה אושרו על ידי שני תאים subchordal על זנבות שלהם (איור 8d). עוד זן דומיננטי במים המקומיים, O. longicauda, היו דומים בגודלם ומורפולוגיה. השתמשנו בקריטריונים הבאים כדי להבחין o. longicauda מ o. דיואיקה38,39,40: חוסר תאים subchordal בזנב, הנוכחות של ילונות בתא המטען, ואת הנוכחות של זיבה אנדרוגינוס (איור 8E, F). מורפולוגיות הזנב השונות שימושיים גם להבחנה o. longicauda מ o. דיואיקה. כאשר חיה עירומה בשלמותה ללא הבית היה מונחה באופן שליו, זנבו של O. longicauda היה ישר יותר עם פחות עקמומיות, נותן לו "הופעה" מראה לעומת זה של O. דיואיקה.

שלושת הגורמים החשובים ביותר להקמת מערכת התרבות היציבה אויקוקולורה הם (i) שמירה על איכות מים גבוהה, (ii) המזהה את משטר ההזנה האופטימלי, ו (iii) הקמת גביע המשמה עם מספר מספיק של זכרים ונקבות. הקדמה של מערכת מסננים מרובת שלבים (איור 1) שיפרה את איכות המים והיציבות של התרבות. מערכת סינון אינה נחוצה עבור מי-ים מלאכותיים; עם זאת, העלות, הזמינות והנוחות של מי הים הטבעיים הופכים אותו לאופציה טובה יותר עבור מעבדות הממוקמות ליד החוף. כדי להקים את משטר ההזנה, אנו ממליצים על מדידת עקומות גדילה פריחת אצות החלות על הגדרות מעבדה בודדות, שכן הטמפרטורה ותנאי האור משתנים מאוד. שילבו את עקומות הצמיחה עם לוחות זמנים שפורסמו בעבר כדי למטב את ריכוזי ההזנה של פריחת אצות וקומפוזיציות27 (איור 4). כמו כן, אנו מספקים לוח זמנים מחמיר לשמירת מזון האלגל (שולחן 2). מערכת ההזנה אוטומטית מאפשרת לנו לשמור על לוח זמנים עקבי האכלה ללא נוכחות של צוות culturing (איור 2B).

לאחר שנעשה שינוי של מי ים אופטימלי והאכלה, חשוב ליזום דורות חדשים על ידי יצירת גביע השומה עם 15 זכרים ו -30 נקבות ב 2.5 ליטר של fSW. זה מבטיח ריכוז טוב של יום 1 חיות בבוקר שלמחרת, אשר מספיק כדי לבודד 150 בעלי חיים ביום 2, 120 ביום 3 ו 45 מבוגרים ביום 4 עבור השנאה. אם אין מספיק זכרים ונקבות ביום 4, לאסוף ולהעביר כמו אנשים בוגרים רבים ככל האפשר 1 L של fSW ולתת להם להשריץ באופן טבעי בתקווה כי יהיו מספיק זחלים לבצע על הדור הבא. לאחר הפרוטוקול המסופק, מחזור החיים של O. דיואיקה הוא 4 ימים ב -23 ° צ' (איור 7c). הקמנו באופן אמין שישה אוכלוסיות פרא עצמאיות של O. דיואיקה, שכולן נמשכו יותר מ -20 דורות.

figure-results-3979
איור 1: סכמטית של מערכת סינון מי-ים.
(A ו-B) מי ים מסונן בתחילה באמצעות יחידת מסנן של 25 יקרומטר לפני הכניסה למיכל המאגר (C) משאבת כונן מגנטי משמש כדי לצייר מי ים מן המיכל המאגר. מי-הים נדחף לאחר מכן דרך שני מסנני פוליפרופילן ומחוטא לפני שהוא חוזר למיכל האגירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4588
איור 2: מערכת התרבות של א. דיואיקה.
(א) מבט מקרוב על מערכת התרבות (ב) הצגת תקריב של מנוע סינכרוני ומאגר אצות עבור משאבת המינון האוטומטי. קטרים פנימיים של צינור סיליקון A ו-B הם 2 מ"מ ו 4 מ"מ, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5142
איור 3: תרביות מניות עבור O. דיואיקה.
משמאל- C. calcitransכהנמן, איזוקריזיס sp., synechococcus sp., ו -R. רטיקותה לאחר שגדל ב -17 ° c תחת אור רציף במשך ~ 10 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5661
איור 4: עקומת הצמיחה של אלגל לשני מיני המזון העיקריים, ק. קלציטרנס ואיזוקריזיס sp.
מגרשי פיזור של דחיסות אופטית (OD) ב660 nm וריכוזי תאים כולל עבור (א) C. קלציטרנס ו (ב) איזוקריזיס sp. כל נקודה מייצגת את הממוצע של שלוש מדידות. מונה תאים שימש לקביעת אחוזי התאים הפעילים וריכוזי התאים הכולל (תאים/mL). המדידות נרשמו במשך 20 יום (n = 47). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6380
איור 5 : מעבר שונה לרשת פלנקטון לדגימה
בקלה בסוף של שנערך ביד פלנקטון נטו (100 יקרומטר רשת שינוי) מוחלף עם בקבוק כביסה 500 mL. משקל 70 גרם מצורף לקצה-בקלה. כ-5 מ' של חבל מוצמד לטבעת המפתח. רצועה בטוחה מצורפת. לאבטחה נוספת אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6922
איור 6: העונתיות של O. דיוקה באוקינווה.
נוכחות והעדר של o. דיואיקה ו o. longicauda ביחס שינויים עונתיים ב (א) טמפרטורה ו (ב) מליחות בנמלים באיהיקאווה (26 ° 25 ' 39.3 "n 127 ° 49" 56.6 "e) ו-Kin (26 ° 26 ' 40.2" n 127 ° 55 "00.3" e) בין 2015-2019. כל מינים נרשמו כנוכחים אם יותר מ-50 בעלי חיים נספרו באופן ידני. מדידות הטמפרטורה והמליחות של מי השטח נרשמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7651
איור 7: תרשים זרימה לייזום מונוקולקה .
(א) שלושה, דגימות פלנקטון של 500 mL נאספים מאתר דיגום (ב) כל צנצנת לדוגמה מדולל ו -O. דיופיקה מבודדת משאר הפלנקטון (C) מונוטריה של o. דיופיקה ביוזמת על ידי העברה ידנית 120 יום 3 בעלי חיים לגביע חדש המכיל 5 ליטר של מי ים מסוננים טריים (fsw). הגדר בגביע ההולמה המכיל 30 נקבות, 15 זכרים ו 2.5 L של fSW טרי. הבוקר הראשון שלאחר ההשרצה (Day1), רוקן בזהירות את הגביע השההשריץ עם הדור החדש של בעלי חיים לתוך גביע המכיל 7.5 L של fSW טרי. ביום השני post-השרצה (יום 2), להעביר 150 בעלי חיים לתוך גביע המכיל 5 L רענן fSW. ביום השלישי שלאחר ההשרצה (יום 3), להעביר 120 בעלי חיים לתוך גביע המכיל 5 L רענן fSW. ביום האחרון (יום 4), הגדר בגביע השלמה חדש המכיל 30 נקבות, 15 זכרים ו-2.5 L טרי fSW לקראת הדור הבא. לחיות מחזור חיים של 4 ימים ב -23 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8811
איור 8: זיהוי של אויקוטורה spp. (A-D: o. דיואיקה, E ו-F . longicauda).
(א) נקבה o. ביצה עם ביצים(ב) זכר o. דו עם זרע (C) לרוחב של השקפה בוגרת של או. דו מימד (ד) השקפה של בוגר o. דיואיקה עם שני תאים subchordal המצוין עם חיצים לבנים (E) השקפה של בוגרת o. longicauda לשאת ביצים (חץ 1) ו זרע (חץ 2) (F) מבט לרוחב של O. longicauda מראה ילונות (חץ 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנטיםמוצרים כימייםכמותהכרך הסופי (mL)עיקורמלאי/פתיחה
פתרון ANa2edta45 גרם1000חיטוי-20 ° צ'/4 ° צ'
ננו3 100 גרם
H3בו3 33.6 גרם
חנה24 20 גר'
מדחס2· 4h2O0.36 גרם
מדחס3· 6h2O1.3 גרם
פתרון ב'1.0 מ ל
פתרון ב'שפני העכבר2 2.1 גרם1000חיטוי4 ° צ'/4 ° צ'
מדחס2· 6h2O2.0 גרם
(NH4) 6mo7o24· 4h2o0.9 גרם
כיתה4· 5h2O2.0 גרם
* רשימת הקטלוג--mL
ויטמיןהמשך (1) · HCl200 מ ג1000חיטוי-20 ° צ'/4 ° צ'
ביוטין1 מ ג
בלקובלאמין (12)1 מ ג
נתרן סיליקטNa2SiO3 5%1000מסנן 0.22 יקרומטר4 ° צ'/4 ° צ'
סטרפטומיציןC21H39N7O12 25 מ"ג/mL50מסנן 0.22 יקרומטר-20 ° C/-20 ° C

טבלה 1: מתכון של ריאגנטים הכרחי לתחזוקת מזון פריחת אצות. לאחר המסת כל הכימיקל הרשום עבור פתרון B, HCl מתווסף עד הפתרון הופך ברור ללא עכירות. כל הריאגנטים מעוקר על ידי אוטוקלינג (120 ° c, 25 דקות) או באמצעות מסנן 0.22 m. כל הריאגנטים למעט מניות ויטמין הם מעוקר לאחר תוספת של כימיקלים מוגדר. לקבלת מניות הויטמין, הקלפה קודם את המים ולאחר מכן פזר את הכימיקל הרשום. טמפרטורות אחסון עבור מלאי וריאגנטים פתוח מפורטים.

סוג תרבות. אלגל-סיASW (mL)ויטמיןפתרון Aנתרן סיליקטסטרפטומיציןאצות (mL)/סוג תרבותדגירה/חנותתדירות
תרבות המניהצ'וטו601/20001/20001/4000
(בלבד)		1/1000
(הכל מלבד צין)		0.03/מניה17 ° C/4 ° Cשבועיים
Iso600.03/מניה
קרנף800.06/מניה
Syn600.03/מניה
תת תרבותצ'וטו5001/20001/20001/4000
(בלבד)		1/1000
(הכל מלבד צין)		10/מניות17 ° צ'/17 ° צ'שבועי
Iso50010/מניות
קרנף50020/מניות
Syn50010/מניות
תרבות העבודהצ'וטו4001/20001/20001/4000
(בלבד)		1/1000
(הכל מלבד צין)		100/משנהRM/RMכל 4 ימים
Iso400100/משנה
קרנף400150/משנה
Syn400100/משנה

שולחן 2: הוראה לתחזוקת סוגי תרבות שלושה אלגל. הוסף את כמות התוספים שצוינה לצלוחיות המכילות מי ים אוטוקליים. מחסן כל בקבוקון עם כמות מסוימת של תרבות פריחת אצות. מודטה ולאחסן תרבויות פריחת אצות בטמפרטורות שצוין. אישוב תרבות מניות חדשה ותרבות תת-תרבותית מתרבות המניה הקודמת, ותרבות העבודה החדשה מהתרבות המשנה הקודמת. האיחסן תרבות מניות חדשה, תתי תרבות ותרבות עבודה כל שבועיים, שבוע וארבעה ימים, בהתאמה. לוח זמנים זה מספק מספיק מזון עבור כ 10 כוסות של תרבות או.. . שמירה על 2 – 3 סטים של כל סוג של תרבות האלגל כגיבויים. RM – טמפרטורת החדר.

יום. אלגל-סי09:00 ו 17:0012PM
1צ'וטו——
Iso10002000
Syn20,00040,000
2צ'וטו10002000
Iso20002000
קרנף10001000
3צ'וטו30004000
Iso30004000
קרנף15001500
4צ'וטו10002000
Iso10002000
קרנף10001000

שולחן 3: ריכוז אלגל לכל האכלה-שונה מפרחים ואח '27. ריכוזי פריחת אצות (תאים mL-1) ומינים פריחת אצות המשמשים האכלה יומית במהלך מחזור החיים של 4 ימים של אוקינווה O. דיואיקה.

משלים קובץ 1: תרשים האכלה יומית. כמויות האכלה יומיות עבור כל גביע התרבות מחושבות באופן אוטומטי לאחר הזנת מדידות מדידה יומית של פריחת אצות (OD), את גודל בעלי החיים (יום), ואת הנפח של מי ים (SW vol.) בכל גביע תרבות. עקומות גדילה של R. רטיקותה וסינוכוקוקוס sp. הותאמו מתוך זר ואח '27. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

משלים קובץ 2: כיצד לחבר מנוע סינכרוני להנעה אקריליק. בורג בחוזקה על ההנעה למנוע באמצעות ברגים משושה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

כדי להקל על הגמישות בהקמת תרבות O ' דיוקה , חשוב להבין את הסביבה הטבעית של בעלי החיים. נתונים עונתיים מספקים מידע על טווחים של פרמטרים פיזיים, אשר ניתן להשתמש כדי להנחות את התנאים culturing מעבדה. היא גם מסייעת להבנת תנודות עונתיות בשפע של בעלי חיים. באוקינווה, O. דיואיקה נמצא באופן האמין ביותר מיוני עד אוקטובר. עם זאת, במפרץ טוקיו, אוכלוסיות שיא בפברואר ובאוקטובר41. למרות שהקולטיורינג של או. דיואיקה מדווחים לעתים קרובות ב-20 מעלותצלזיוס או27התחתונות,28,29, אוקינאווה O. דיואיקה מראה הישרדות טובה יותר בטמפרטורות מעל 20 ° c; זה יכול להיות מוסבר על ידי העובדה את הטמפרטורה מינימום מי ים באוקינווה הוא ~ 20 ° צ' (איור 6). השפע של O. דיואיקה עשוי להיות מושפע גם על ידי פיטופלנקטון פורח42 ו טורף שפע43,44. ללא קשר למקום שבו נאספים O. דיוצה , הבנת העונתיות של האוכלוסיות המקומיות מגדילה את הסיכוי להצלחה בדיגום והצלחה.

בהינתן העונה והמיקום המתאימים, הדגימה הנטו היא דרך יעילה לאסוף מספר גדול של אויקופאורה עם מאמץ מינימלי. רשתות פלנקטון עם גודל שינוי קטן יותר (60-70 μm) עשוי לשמש גם כדי לאסוף את כל שלבי החיות. חיות בוגרות לחלוטין מצויים ברשת, אולי בשל שבריתם בסוף מחזור החיים. לכן, זיהוי המינים ולאחריו דגימה מושגת על ידי התבוננות מיקרוסקופית של תאים subchordal. אנשים מבוגרים בדרך כלל מופיעים יומיים או יומיים לאחר הדגימה כבעלי חיים ממשיכים לצמוח במעבדה. למרות שדגימה נטו יעילה, שיטות דגימה חלופיות עשויות להיות נחוצות בנסיבות שונות. לדוגמה, דגימה נטו ליד אזורים עירוניים יכולה לאסוף מספר רב של פיטופלנקטון, מה שמקשה על הבידוד של אויקופורה. במקרים כאלה, מדגם דלי פשוט לאיסוף מי ים או דגימת סירה מאזורים שמעבר לנמל מומלצים. התוצאות הראו כי השינוי ההדרגתי במליחות עקב ימי גשם רצופים לא השפיע על השפע של O. דיואיקה; עם זאת, החוף דגימה מיד לאחר אירועי מזג אוויר קיצוניים כגון ציקלונים טרופיים צריך להימנע. אירועים אלה גורמים שינויים ביוגיאוכימיים פתאומי ודרסטי בגוף מוגן של מים45,46. מי שנגר הסער עשוי לשאת מזהמים, משקעים וחומרים מזינים עודפים, המגבירים את העכירות ואת איכות המים הנמוכה47. פלנקטון של האכלה מסננים, כגון אויקופלירה, עשויים להיות רגישים במיוחד לשינויים אלה עקב מצב של האכלה וניידות מוגבלת. בנסיבות כאלה, אנו ממליצים לדחות את הדגימה לכמה ימים עד שהתנאים המקומיים יחזרו למסלולם.

המבוא של מערכת סינון מרובת שלבים חיוני לשמור על אורגניזמים קטנים, האכלה מסננים כגון O. דיואיקה. באמצעות מי ים מסוננים למדי (למשל, a 25 יקרומטר רשת במערכת התרבות הקודמת), התרבות היתה לעתים קרובות לא יציבה במיוחד במהלך הקיץ, בגלל השפע הגבוה של פיטופלנקטון. למרות שחלק מהפיטופלנקטון מועילים לצמיחה של o. דיוקה , אחרים מייצרים ביוטוקסינים שעלולים לגרום להתפתחות חריגה של עוברי O. דיוקה 48. בנוסף, ריכוז גבוה של אלהלמה כגון chaetoceros spp. הם עלולים להזיק O. דיואיקה צמיחה כפי שהם יכולים להחזיק setae ארוכה אשר יכול לסתום את הבית ולמנוע האכלה יעילה49. לעתים קרובות הבחנו בבתים של בעלי חיים קטנים שסתומים על ידי C. calcitrans setae; לכן, אנו מאכילים כעת את C. calcitrans רק לבעלי חיים ביום 2 ומעלה (שולחן 3).

למרות שזאת לא היתה בעיה, לאורך זמן קטן לטווח הארוך של O. דיוניקה יכול לחוות טיפות פתאומיות בגודל האוכלוסייה בגלל צוואר בקבוק גנטי; במקרים כאלה, מרטינו-סולאנים ואח '29 ממליצים להוסיף אנשים פראיים חדשים לתרבות כל 20 דורות.

מערכת התרבות של אויקופורה היא גמישה. ניתן להקים תרבות יציבה תוך שבוע. מגוון לטווח ארוך של O. הינו אפשרי בתקציב צנוע עם ציוד לא מומחה. המאמץ היומיומי הנדרש לתחזוקת 5-10 הספלים של אויקופורה הוא בדרך כלל פחות מ 2 שעות עם 2 אנשים. כמו כן ניתן לשמור על הצמח במי ים מלאכותיים, שיועיל לאלה ללא גישה למי ים טבעיים28. אחסון לטווח ארוך של מזון פריחת אצות אפשרי באמצעות התרבות המוצק ו הקריוגנית29. כמו-כן, ניתן להוריד את הזרע בזרעים של או, ולהישאר מסוגלים ליותר משנה50. כל הגורמים הללו מתכוונים כי התרבויות ניתן להקים מחדש בקלות. בסופו של דבר, ניסיון העבר עם מקרי בשוגג של פלאורורכיה sp. עשוי להציע כי מערכת culturing שפותחה עבור אויקופורה יכול להיות מורחב לקהילה רחבה יותר של אורגניזמים הפלחיים שבירים.

O. דיוקה ממשיכה לספק תובנות חזקות לתחומים ביולוגיים שונים. הבנה של העונתיות המקומית, מערכת התרבות הדקדקנית, ומספר אנשים מסורים מאפשרים לתרבות יעילה להיות מבוסס עם מעט מאמץ. מערכת התרבות אויקופורה מספקת את המשאבים הבסיסיים לחקור מגוון רחב של שדות ביולוגיים הנוגעים לאקולוגיה, פיתוח, גנומיקה והתפתחות של הכאודייט הימי הייחודי הזה.

Disclosures

. לסופר אין מה להצהיר

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לגארת ' אילסלי על תמיכתו בהקמת מערכת התרבות. אנו מכירים את התרומות של ריצוקו סואיאמה ושל סילביין Guillot למאמצי הזיהוי המוקדמים של הדגימה והמינים. תודות מיוחדות הן בשל הירוקי נישידה, טאקשי ונאמה, וטאסואיה אוטקזאנו לתמיכה והדרכה נדיבות לאורך כל הדרך, כולל הקמתה הראשונית של מערכת הקולטיורינג המקומית ושיתוף בעלי חיים ותרבות מיקרואליגל. כמו כן, אנו מודים לדניאל כרורד, ז'אן-מארי זר, אן אג'יורד, כריסטיאן קאניטרו, ואלפונסו פרנדז-רולדן על שיתוף המומחיות שלהם בדיגום ובתפירה. ג'יי דנטון, צ'רלס פלסי, וג ג'ולי. סיפקו משוב לא יסולא בפז בכתב היד שרלוט ווסט ניסח משוואה כללית לחישוב פריחת אצות. בסופו של דבר, אנו מודים לווייס על מימון, מרי קולינס וועדת הבטיחות בעבודת השטח של העובדים לקבלת ייעוץ בנוגע להליכי דיגום בטוחים, הצוות של מכונת הקפה-מכונה לבניית הציוד הפולחני והדיגום, וקואיצ'י טודה בגין אספקת מי-ים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Activated charcoalSigmaC2764-2.5KG
Alluminum pulleyRainbow Products10604-10607
BiotinSigmaB4501-100MG
Boric acidWako021-02195
Cobalamin (B12)SigmaV2876-100MG
Cobalt(II) chloride hexahydrateWako036-03682
Copper(II) sulfate pentahydrateWako039-04412
Disodium edetate hydrateWako044-29525
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrateWako019-03212
Hexagon wrenchAnexNo.6600
Hydrochloric acidWako080-01066
Iron(III) chloride hexahydrateWako091-00872
Jebao programmable auto dosing pumpJebaoDP-4
Magnet pumpREI-SEARMD-201
Manganese(II) chloride tetrahydrateWako134-15302
Polypropylene wound cartridge filterAdvantecTCW-10N-PPS
TCW-5N-PPS
TCW-1N-PPS
Screwless terminal blockSATO PARTSSL4500
Simple plankton netRIGO, Japan5512-C
Sodium metasilicateSigma307815-1KG
Sodium nitrateWako195-02545
Sodium phosphate monobasic anhydrousMP Biomedicals194740
Streptomycin sulfate saltSigmaS6501-25G
Synchronous electric motorServoD5N6Z15M
Thiamin hydrochlorideWako201-00852
UV sterilizerIwakiUVF-1000
Zinc chlorideMP Biomedicals194858

References

  1. Travis, J. Is It What We Know or Who We Know? Choice of Organism and Robustness of Inference in Ecology and Evolutionary Biology (American Society of Naturalists Presidential Address). The American Naturalist. 167 (3), 303-314 (2006).
  2. Jenner, R. A., Wills, M. A. The choice of model organisms in evo-devo. Nature Reviews Genetics. 8 (4), 311-314 (2007).
  3. Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
  4. Wilson, S., Ruhl, H., Smith, J. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
  5. Steinberg, D. K., Lomas, M. W., Cope, J. S. Long-term increase in mesozooplankton biomass in the Sargasso Sea: Linkage to climate and implications for food web dynamics and biogeochemical cycling. Global Biogeochemical Cycles. 26 (1), 1004 (2012).
  6. Lombard, F., Kiørboe, T. Marine snow originating from appendicularian houses: Age-dependent settling characteristics. Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. 57 (10), 1304-1313 (2010).
  7. Fenaux, R., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 251-264 (1998).
  8. Hopcroft, R. R., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 45-57 (2005).
  9. Walters, T. L., Gibson, D. M., Frischer, M. E. Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies. Journal of Visualized Experiments. (150), e59832 (2019).
  10. Deibel, D. Feeding mechanism and house of the appendicularian Oikopleura vanhoeffeni. Marine Biology. 93 (3), 429-436 (1986).
  11. Spada, F., et al. Molecular patterning of the oikoplastic epithelium of the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 20624-20632 (2001).
  12. Flood, P. R., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 59-85 (2005).
  13. Tokioka, T. Studies on the distribution of appendicularians and some thaliaceans of the North Pacific, with some morphological notes. Publication of the Seto Marine Biological Laboratory. (8), 351-443 (1960).
  14. Alldredge, A. L. Discarded appendicularian houses as sources of food, surface habitats, and particulate organic matter in planktonic environments. Limnology and Oceanography. 21 (1), 14-24 (1976).
  15. Clarke, C., Roff, J. C. Abundance and biomass of herbivorous zooplankton off Kingston, Jamaica, with estimates of their annual production. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 31 (4), 423-437 (1990).
  16. Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Zooplankton growth rates: extraordinary production by the larvacean Oikopleura dioica in tropical waters. Journal of Plankton Research. 17 (2), 205-220 (1995).
  17. Hopcroft, R. R., Roff, J. C. Production of tropical larvaceans in Kingston Harbour, Jamaica: are we ignoring an important secondary producer. Journal of Plankton Research. 20 (3), 557-569 (1998).
  18. Mochioka, N., Iwamizu, M. Diet of anguilloid larvae: leptocephali feed selectively on larvacean houses and fecal pellets. Marine Biology. 125 (3), 447-452 (1996).
  19. Sakaguchi, S. O., et al. Morphological identity of a taxonomically unassigned cytochrome c oxidase subunit i sequence from stomach contents of juvenile chum salmon determined using polymerase chain reaction. Fisheries Science. 83 (5), 757-765 (2017).
  20. Fenaux, R., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 25-34 (1998).
  21. Sato, R., Tanaka, Y., Ishimaru, T. House production by Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) under laboratory conditions. Journal of Plankton Research. 23 (4), 415-423 (2001).
  22. Flood, R., Deibel, D., Bone, Q. . The Biology of Pelagic Tunicates. , 105-124 (1998).
  23. Alldredge, A., Gorsky, G., Youngbluth, M. J., Deibel, D. . Response of Marine Ecosystems to Global Change: Ecological Impact of Appendicularians. , 309-326 (2005).
  24. Katija, K., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. New technology reveals the role of giant larvaceans in oceanic carbon cycling. Science Advances. 3 (5), 1602374 (2017).
  25. Katija, K., Choy, C. A., Sherlock, R. E., Sherman, A. D., Robison, B. H. From the surface to the seafloor: How giant larvaceans transport microplastics into the deep sea. Science Advances. 3 (8), 1700715 (2017).
  26. Hidaka, K. Species composition and horizontal distribution of the appendicularian community in waters adjacent to the Kuroshio in winter-early spring. Plankton and Benthos Research. 3 (3), 152-164 (2008).
  27. Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359-370 (2009).
  28. Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: culture, genome, and cell lineages. Development, Growth & Differentiation. 50, 239-256 (2008).
  29. Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica culturing made easy: A Low-Cost facility for an emerging animal model in Evo Devo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
  30. Holland, L. Z. Tunicates. Current Biology. 26 (4), 146-152 (2016).
  31. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
  32. Seo, H. C., et al. Miniature genome in the marine chordate Oikopleura dioica. Science. 294 (5551), 2506 (2001).
  33. Fredriksson, G., Olsson, R. The subchordal cells of Oikopleura dioica and O. albicans (Appendicularia, Chordata). Acta Zoologica. 72 (4), 251-256 (1991).
  34. Paffenhöfer, G. A. The cultivation of an appendicularian through numerous generations. Marine Biology. 22 (2), 183-185 (1973).
  35. Fenaux, R., Gorsky, G. Nouvelle technique d'élevage des appendiculaires. Rapports et Procés-Verbaux des Réunions-Commission Internationale pour l'Exploration Scientifique de la Mer Méditerranée. 29, 291-292 (1985).
  36. Fujii, S., Nishio, T., Nishida, H. Cleavage pattern, gastrulation, and neurulation in the appendicularian, Oikopleura dioica. Development Genes and Evolution. 218 (2), 69-79 (2008).
  37. Patry, W. L., Bubel, M., Hansen, C., Knowles, T. Diffusion tubes: a method for the mass culture of ctenophores and other pelagic marine invertebrates. PeerJ. 8, 8938 (2020).
  38. Fenaux, R. The classification of Appendicularia (Tunicata): history and current state. Memoires de I'Institut oceanographique. , (1993).
  39. Shiga, N., Chihara, M., Murano, M. . Illustrated Guide to Marine Plankton in Japan. , 1393-1414 (1997).
  40. Gorsky, G., Castellani, C., Castellani, C., Edwards, M. . Marine Plankton: A practical guide to ecology, methodology, and taxonomy. , 599-606 (2017).
  41. Sato, R., Ishibashi, Y., Tanaka, Y., Ishimaru, T., Dagg, M. J. Productivity and grazing impact of Oikopleura dioica (Tunicata, Appendicularia) in Tokyo Bay. Journal of Plankton Research. 30 (3), 299-309 (2008).
  42. Nakamura, Y., Suzuki, K., Suzuki, S. Y., Hiromi, J. Production of Oikopleura dioica (Appendicularia) following a picoplankton 'bloom'in a eutrophic coastal area. Journal of Plankton Research. 19 (1), 113-124 (1997).
  43. Nakamura, Y. Blooms of tunicates Oikopleura spp. and Dolioletta gegenbauri in the Seto Inland Sea, Japan, during summer. Hydrobiologia. 385 (1-3), 183-192 (1998).
  44. Uye, S. I., Ichino, S. Seasonal variations in abundance, size composition, biomass and production rate of Oikopleura dioica (Fol)(Tunicata: Appendicularia) in a temperate eutrophic inlet. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 189 (1-2), 1-11 (1995).
  45. Tsuchiya, K., et al. Phytoplankton community response and succession in relation to typhoon passages in the coastal waters of Japan. Journal of Plankton Research. 36 (2), 424-438 (2014).
  46. Lopez-Lopez, L., et al. Effects of typhoons on gelatinous carnivore zooplankton off Northern Taiwan. Cahiers de Biologie Marine. 53, 349-355 (2012).
  47. Ares, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Extreme storm-induced run-off causes rapid, context-dependent shifts in nearshore subtropical bacterial communities. bioRxiv. , (2019).
  48. Torres-Águila, N. P., et al. Diatom bloom-derived biotoxins cause aberrant development and gene expression in the appendicularian chordate Oikopleura dioica. Communications Biology. 1 (1), 1-11 (2018).
  49. Troedsson, C., Frischer, M. E., Nejstgaard, J. C., Thompson, E. M. Molecular quantification of differential ingestion and particle trapping rates by the appendicularian Oikopleura dioica as a function of prey size and shape. Limnology and Oceanography. 52 (1), 416-427 (2007).
  50. Ouchi, K., Nishino, A., Nishida, H. Simple procedure for sperm cryopreservation in the larvacean tunicate Oikopleura dioica. Zoological Science. 28 (1), 8-11 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160Tunicate

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved