2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (<35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

Abstract

גישות ריצוף מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS) הוכחו כשימושיות בריצוף ישיר של RNA ללא צורך במתווך DNA משלים (cDNA). עם זאת, גישות כאלה מיושמות לעתים רחוקות כשיטת ריצוף RNA דה נובו , אלא משמשות בעיקר ככלי שיכול לסייע באבטחת איכות לאישור רצפים ידועים של דגימות RNA חד-גדיליות מטוהרות. לאחרונה, פיתחנו שיטת ריצוף RNA ישירה על ידי שילוב אסטרטגיית תיוג קצה הידרופובית של זמן שימור מסה דו-ממדית בריצוף מבוסס MS (2D-HELS MS Seq). שיטה זו מסוגלת לרצף במדויק רצפי RNA בודדים כמו גם תערובות המכילות עד 12 רצפי RNA נפרדים. בנוסף לארבעת הריבונוקלאוטידים הקנוניים (A, C, G ו-U), לשיטה יש את היכולת לרצף אוליגונוקלאוטידים של RNA המכילים נוקלאוטידים ששונו. זה אפשרי מכיוון שלנוקלאובסיס השונה יש מסה ייחודית מהותית שיכולה לסייע בזיהויו ובמיקומו ברצף ה-RNA, או שניתן להמיר אותו למוצר בעל מסה ייחודית. במחקר זה, השתמשנו ב-RNA, תוך שילוב שני נוקלאוטידים שעברו שינוי מייצג (פסאודורידין (Ψ) ו-5-מתילציטוזין (m⁵C)), כדי להמחיש את יישום השיטה לריצוף דה נובו של אוליגונוקלאוטיד RNA יחיד כמו גם תערובת של אוליגונוקלאוטידים של RNA, כל אחד עם רצף שונה ו/או נוקלאוטידים ששונו. הנהלים והפרוטוקולים המתוארים כאן לרצף RNA מודל זה יהיו ישימים לדגימות RNA קצרות אחרות (<35 nt) בעת שימוש במערכת LC-MS סטנדרטית ברזולוציה גבוהה, וניתן להשתמש בהם גם לאימות רצף של אוליגונוקלאוטידים RNA טיפוליים ששונו. בעתיד, עם פיתוח אלגוריתמים חזקים יותר ועם מכשירים טובים יותר, שיטה זו תוכל לאפשר ריצוף של דגימות ביולוגיות מורכבות יותר.

Introduction

שיטות ריצוף מבוססות ספקטרומטריית מסה (MS), כולל MS מלמעלה למטה ו-MS טנדם 1,2,3,4, פותחו לריצוף ישיר של RNA. עם זאת, טכניקות פיצול באתרן לייצור יעיל של סולמות RNA באיכות גבוהה בספקטרומטרי מסה לא ניתן ליישם כיום על ריצוף דה נובו ^5,6. יתר על כן, זה לא טריוויאלי במיוחד לנתח את נתוני הטרשת הנפוצה המסורתיים החד-ממדיים (1D) לריצוף דה נובו של אפילו רצף RNA מטוהר אחד, וזה יהיה מאתגר עוד יותר עבור ריצוף MS של דגימות RNA מעורבות ^7,8. לכן, פותחה שיטת ריצוף RNA דו-ממדית (2D) מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-MS, המשלבת ייצור של סולמות זמן שימור מסה דו-ממדיים (t_R) להחלפת סולמות מסה חד-ממדיים, מה שמקל בהרבה על זיהוי רכיבי הסולם הדרושים לריצוף דה נובו של RNAs⁸. עם זאת, שיטת ריצוף ה-RNA הדו-ממדית המבוססת על LC-MS מוגבלת בעיקר ל-RNA קצר סינתטי מטוהר, מכיוון שהיא אינה יכולה לקרוא רצף שלם המבוסס אך ורק על סולם אחד, אלא חייבת להסתמך על שני סולמות סמוכים הקיימים במקביל (סולמות 5'- ו-3')⁸. ליתר דיוק, גישה זו דורשת קריאות קצה זוגיות דו-כיווניות לקריאת נוקלאובסיסים סופיים באזור המסה הנמוכה⁸. המורכבות הנוספת של קריאת הקצה הזוגי מביאה לכך ששיטה זו אינה ניתנת לריצוף של תערובות RNA מכיוון שנוצר בלבול באיזה שבר סולם שייך לאיזה סולם עבור הדגימות הלא ידועות.

כדי להתגבר על המחסומים שהוזכרו לעיל בגישות ריצוף RNA מבוססות MS ולהרחיב יישומים כאלה בריצוף RNA ישיר, יש לטפל בשתי בעיות: 1) כיצד ליצור סולם מסה איכותי שניתן להשתמש בו לקריאת רצף שלם, מהנוקלאוטיד הראשון ועד האחרון בגדיל RNA, ו-2) כיצד לזהות ביעילות כל סולם RNA/מסה במערך נתונים מורכב של MS. יחד עם פירוק חומצה מבוקר היטב, פיתחנו שיטת ריצוף חדשה על ידי הכנסת אסטרטגיית תיוג קצה הידרופובי (HELS) לטכניקת הריצוף המבוססת על MS, וטיפלנו בהצלחה בשתי הבעיות הללו על ידי הוספת תג הידרופובי בקצה 5 ו/או 3 של ה-RNA לריצוף⁹. שיטה זו יוצרת סולם רצף "אידיאלי" מ-RNA - כל שבר סולם נובע מחשוף RNA ספציפי לאתר אך ורק בכל קשר פוספודיאסטר, והפרש המסה בין שני שברי סולם סמוכים הוא המסה המדויקת של שינוי הנוקלאוטיד או הנוקלאוטיד במיקום זה ^8,9,10. זה אפשרי מכיוון שאנו כוללים שלב הידרוליזה חומצי מבוקר מאוד, המפרק את ה-RNA, בממוצע, פעם אחת לכל מולקולה, לפני שהוא מוזרק למכשיר. כתוצאה מכך, כל תוצר של שבר פירוק מזוהה בספקטרומטר המסה וכל השברים יחד יוצרים סולם ריצוף ^8,9,10. אסטרטגיה חדשה זו מאפשרת קריאה מלאה של רצף RNA מסולם אחד בודד של גדיל RNA ללא קריאת קצה מזווג מהסולם השני של ה-RNA, ובנוסף מאפשרת ריצוף MS של תערובות RNA עם מספר גדילים שונים המכילים שינויים נוקלאוטידים קומבינטוריים⁹. על ידי הוספת תג בקצה ה-5 ו/או ה-3 של ה-RNA, שברי הסולם המסומנים מציגים עיכוב משמעותי של t_R, מה שיכול לעזור להבחין בין שני סולמות המסה זה מזה וגם מהאזור הרועש בעל המסה הנמוכה. הסטת Mass-t_R הנגרמת על ידי הוספת התג ההידרופובי מקלה על זיהוי סולם מסה ומפשטת את ניתוח הנתונים ליצירת רצף. יתר על כן, הוספת התג ההידרופובי יכולה לסייע בזיהוי הבסיס הסופי בגדיל על ידי מניעת שבר הסולם המתאים לו_{להיות באזור R} הרועש בעל המסה הנמוכה-t עקב עליית המסה וההידרופוביות הנגרמת על ידי התג, ובכך לאפשר זיהוי של הרצף השלם של RNA מסולם יחיד; אין צורך בקריאות קצוות מזווגות. כתוצאה מכך, הדגמנו בעבר ריצוף מוצלח של תערובת מורכבת של עד 12 גדילים נפרדים של RNA ללא שימוש באלגוריתם ריצוף מתקדם^{כלשהו 9}, מה שפותח את הדלת לריצוף דה נובו MS של RNA המכיל נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כאחד והופך אותו לאפשרי יותר לריצוף של דגימות RNA מעורבות ומורכבות יותר. למעשה, באמצעות 2D-HELS MS Seq, אפילו רצפנו בהצלחה אוכלוסייה מעורבת של דגימות tRNA¹⁰ ומרחיבים באופן פעיל את היישום שלה לדגימות RNA מורכבות אחרות.

כדי להקל על 2D-HELS MS Seq לרצף ישירות מגוון רחב יותר של דגימות RNA, כאן נתמקד בהיבטים הטכניים של גישת ריצוף זו ונסקור את כל השלבים החיוניים הדרושים בעת יישום הטכניקה לקראת ריצוף ישיר של דגימות RNA. דוגמאות ספציפיות ישמשו להמחשת טכניקת הריצוף, כולל רצפי RNA בודדים סינתטיים, תערובות של מספר רצפי RNA מובחנים ו-RNA מותאמים המכילים נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כגון פסאודורידינים (ψ) ו-5-מתילציטוזין (m⁵C). מכיוון שכל ה-RNA מכילים קשרי פוספודיאסטר, כל סוג של RNA יכול לעבור הידרוליזה בחומצה כדי ליצור סולם רצף אידיאלי עבור 2D-HELS MS Seq בתנאים אופטימליים ^8,9. עם זאת, זיהוי כל שברי הסולם של RNA נתון תלוי במכשיר. ב-LC-MS סטנדרטי ברזולוציה גבוהה (40K), כמות הטעינה המינימלית לריצוף דגימת RNA קצרה מטוהרת (<35 nt) היא 100 pmol לריצה. עם זאת, נדרש חומר נוסף (עד 400 pmol לדגימת RNA) כאשר יש לבצע ניסויים נוספים (למשל, להבחין בין שינויים בבסיס איזומרי החולקים מסות זהות). הפרוטוקול המשמש לריצוף המודל של RNA סינתטי שונה יהיה ישים גם לריצוף דגימות RNA רחבות יותר, כולל דגימות RNA ביולוגיות עם שינויי בסיס לא ידועים. עם זאת, נדרשת כמות דגימה גדולה עוד יותר, כגון 1000 pmol לריצוף tRNA (~76 nt) באמצעות מכשיר LC-MS סטנדרטי, כדי לרצף את ה-tRNA השלם עם כל השינויים, ויש לפתח אלגוריתם מתקדם לריצוף דה נובו ¹⁰ שלו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תכנון אוליגונוקלאוטידים של RNA

1. תכנן אוליגונוקלאוטידים של RNA סינתטי באורכים שונים (19 nt, 20 nt ו-21 nt), כולל אחד (RNA #6) עם נוקלאוטידים קנוניים ומשתנים כאחד. ψ משמש כמודל לשינויים שאינם משני מסה, וזה מאתגר עבור ריצוף MS מכיוון שיש לו מסה זהה ל-U.^{m 5}C נבחר כמודל לשינויים משני מסה כדי להדגים את החוסן של הגישה.
   
   RNA #1: 5'-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3'
   RNA #2: 5'-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3'
   RNA #3: 5'-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3'
   RNA #4: 5'-HO-GCGUACAUCUCUCUUUAU-OH-3'
   RNA #5: 5'-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3'
   RNA #6: 5'-HO-AAACCGUψACCAUUAm⁵CUGAG-OH-3'
    
2. ממיסים כל RNA סינתטי במים שטופלו בדיאתיל-פירוקרבונט (DEPC) נטולי נוקלאז (מבוטא כ-H₂O שטופל ב-DEPC אלא אם צוין אחרת) כדי לקבל תמיסת מלאי RNA של 100 מ"מ. פתרונות מלאי מאוחסנים לטווח ארוך בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. כדי למנוע השפלה אפשרית של דגימת RNA, השתמש באספקה ניסיונית ללא RNase כולל מים שטופלו ב-DEPC, צינורות מיקרו-צנטריפוגה וקצות פיפטה. נגב לעתים קרובות משטחים של ציוד מעבדה באמצעות מגבונים לסילוק RNase.

2. סמן את 3'-קצה ה-RNA בביוטין

1. פרוטוקול תגובה דו-שלבי (אדנילציה וקשירה)
   1. הוסף 1 מיקרוליטר של מאגר תגובת אדנילציה פי 10 המכיל 50 מ"מ נתרן אצטט, pH 6.0, 10 מ"מ MgCl₂, 5 מ"מ דיכלורודיפנילטריכלורואתאן (DTT), 0.1 מ"מ חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 1 מיקרוליטר של 1 מ"מ ATP, 1 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר ציטידין ביספוספט ביוטיניל (pCp-ביוטין), 1 מיקרוליטר של 50 מיקרומטר Mth RNA ליגאז, ו-6 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC (נפח כולל של 10 מיקרוליטר) לתוך צינור PCR דק דופן ללא RNase של 0.2 מ"ל.
      הערה: אחסן את הריאגנטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפני התגובה הדו-שלבית. מפשירים את הריאגנטים בטמפרטורת החדר ומערבבים היטב על ידי מערבולת וצנטריפוגה לפני הוספה לתגובה.
   2. דגרו את התגובה במכונת PCR בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת והשביתו את התגובה בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. בצע את שלב הקשירה בצינור PCR נטול RNase, בעל דופן דקה של 0.2 מ"ל המכיל 10 מיקרוליטר של תמיסת תגובה מהשלב הקודם על ידי הוספת 3 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ligase המכיל 50 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן (Tris)-HCl, pH 7.8, 10 מ"מ MgCl₂, 1 מ"מ DTT, 1.5 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מ"מ של ה-RNA שיש לרצף, 3 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO) כדי להגיע ל-10% (v/v), 1 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-11.5 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC (לנפח כולל של 30 מ"ל). דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
      הערה: שלב רכיבי תגובה בטמפרטורת החדר עקב נקודת הקיפאון הגבוהה של DMSO (18.45 מעלות צלזיוס).
   4. דגרו את התגובה למשך הלילה בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.
   5. להרוות ולטהר את התגובה על ידי טיהור עמודות להסרת אנזימים ושחרור pCp-ביוטין באמצעות Oligo Clean & Concentrator (Zymo Research, Irvine, CA, USA). מאגר קשירה של אוליגו, מאגר שטיפת DNA, עמודות ספין וצינורות איסוף מסופקים בערכה. הוסף 20 מ"ל של H₂O שטופל ב-DEPC לתמיסת התגובה כדי להגיע לנפח דגימה של 50 מ"ל לפני הוספת מאגר הכריכה.
   6. הוסף 100 מ"ל של מאגר מחייב לכל תמיסת תגובה. מוסיפים 400 מיקרוליטר אתנול, מערבבים על ידי פיפטינג ומעבירים את התערובת לעמודה. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
   7. הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר שטיפת DNA לעמודה. צנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם ומהירות מרבית למשך 30 שניות ודקה אחת, בהתאמה.
   8. העבירו את העמודה לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 15 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC לעמודה ולצנטריפוגה ב-10,000 x g למשך 30 שניות כדי לסלק את תוצר ה-RNA.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשלב זה עד לביצוע השלב הבא.
2. פרוטוקול תגובה חד-שלבי
   1. בצע תגובת תיוג בשלב אחד על ידי שילוב של 2 מיקרוליטר של 150 מיקרומטר אדנוזין-5'-5'-דיפוספט-{5'-(ציטידין-2'-O-מתיל-3'-פוספט-TEG}C-ביוטין (AppCp-biotin), 3 מיקרוליטר של מאגר תגובת ליגאז פי 10, 1.5 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מ"מ של ה-RNA לרצף, 3 מיקרוליטר של DMSO נטול מים כדי להגיע ל-10% (v/v), 1 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-19.5 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC (לנפח כולל של 30 מ"ל) בצינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל.
   2. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
   3. בצע טיהור עמודות כמתואר לעיל בשלבים 2.1.5-2.1.8.
      הערה: הכן צינור תגובה נפרד/בלעדי לכל דגימת RNA (סולם 150 pmol של RNA). ייתכן שיהיה צורך בתיוג של קצה 5' של ה-RNA(ים) עם סולפו-ציאנין3 (Cy3) או Cy3 (למשל, לאימות ריצוף דו-כיווני). השיטה שונה מזו של 3'-biotinylation ומתוארת בפרסום קודם⁹.

3. ללכוד דגימת RNA ביוטינילית על חרוזי סטרפטווידין

1. הפעל 200 מיקרוליטר של חרוזי מגנט סטרפטווידין C1 על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של מאגר B&W 1x (5 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 מ"מ EDTA, 1 M NaCl) בצינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase של 1.5 מ"ל. מערבל את התמיסה הזו והנח אותה על מעמד מגנט למשך 2 דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט על ידי הוצאת התמיסה בזהירות.
2. שטפו את החרוזים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של תמיסה A (0.1 M NaOH שטופל ב-DEPC ו-0.05 M NaCl שטופל ב-DEPC) ופעם אחת ב-200 מיקרוליטר של תמיסה B (0.1 M NaCl שטופל ב-DEPC). עבור כל שלב כביסה, מערבל את התמיסה והניח אותה על מעמד מגנט למשך 2 דקות, ולאחר מכן השלכת הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של 2x מאגר שחור-לבן (10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5, 1 מ"מ EDTA, 2 מ"מ NaCl).
3. הוסף מאגר שחור-לבן אחד לדגימת ה-RNA הביוטיניל עד לנפח 100 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף תמיסה זו לחרוזים השטופים המאוחסנים ב-100 מיקרוליטר של מאגר שחור-לבן פי 2. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר פלטפורמת נדנדה ב-100 סל"ד. הנח את הצינור על מעמד מגנט למשך 2 דקות והשליך את הסופרנטנט.
4. שטפו את החרוזים המצופים 3 פעמים במאגר שחור-לבן 1x ומדדו את הריכוז הסופי של סופרנטנט בכל שלב שטיפה על ידי Nanodrop לניתוח התאוששות, כדי לוודא שמולקולות ה-RNA המטרה נשארות על החרוזים.
5. דגרו את החרוזים ב-10 מ"מ EDTA, pH 8.2 עם 95% פורממיד ב-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות במכונת PCR. שמור את הצינור על מעמד המגנט למשך 2 דקות ואסוף את הסופרנטנט (המכיל את ה-RNA הביוטיני המשתחרר מחרוזי הסטרפטווידין) על ידי פיפט.
   הערה: שלב הפרדה פיזי זה לפני פירוק חומצה משמש רק לריצוף של RNA#1 באיור 1c, ואינו חובה עבור 2D-HELS MS Seq מכיוון שתווית הביוטין ההידרופובית עלולה לגרום לשברי הסולם המסומנים ב-3' להיות בעלי t_R מאוחר משמעותית במהלך מדידת LC-MS, מה שיכול להבחין בבירור בין שברי סולם 3' המסומנים לבין שברי סולם 5' הלא מסומנים בתרשים 2D mass-t_R .

4. הידרוליזה חומצית של RNA ליצירת סולמות טרשת נפוצה לריצוף

1. חלקו כל דגימת RNA לשלוש נקודות שוות. לדוגמה, חלקו דגימת RNA בנפח של 15 מיקרוליטר דגימת RNA לשלוש נקודות של 5 מיקרוליטר.
2. הוסף נפח שווה של חומצה פורמית כדי להשיג 50% (v/v) חומצה פורמית בתערובת התגובה ^8,9.
3. דגרו את התגובה ב-40 מעלות צלזיוס במכונת PCR, כאשר תגובה אחת פועלת במשך 2 דקות, אחת למשך 5 דקות ואחת למשך 15 דקות, בהתאמה.
4. להרוות את פירוק החומצה על ידי הקפאה מיידית של הדגימה על קרח יבש לאחר סיום כל תגובה.
5. השתמש ברכז ואקום צנטריפוגלי כדי לייבש את הדגימה. הדגימה מיובשת לחלוטין בדרך כלל תוך 30 דקות, וחומצה פורמית מוסרת יחד עם H₂O במהלך תהליך הייבוש מכיוון שלחומצה פורמית יש נקודת רתיחה (100.8 מעלות צלזיוס) הדומה לזו של H₂O (100 מעלות צלזיוס).
6. השעו ושלבו בסך הכל שלוש דגימות מיובשות ב-20 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC למדידת LC-MS.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס בשלב זה בזמן ההמתנה למדידת LC-MS.

5. המרת ψ לחיבור CMC-ψ

1. הוסף 80 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל המכיל 0.0141 גרם של N-cyclohexyl-Nʹ-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (CMC) ו-0.07 גרם אוריאה. הוסף 10 מיקרוליטר ממלאי הדגימה של 100 מיקרומטר של ה-RNA לרצף, 8 מיקרוליטר של מאגר ביצין 1 M (pH 8.3) ו-1.28 מיקרוליטר של 0.5 M EDTA. הוסף H₂O שטופל ב-DEPC כדי להגיע לנפח כולל של 160 μL. הריכוזים הסופיים הם 0.17 M CMC, 7 M אוריאה ו-4 mM EDTA ב-50 מ"מ bicine (pH 8.3)¹¹.
   הערה: פרוטוקול זה חל על רצף RNA סינתטי יחיד או על תערובות RNA.
2. חלקו את תמיסת התגובה של 160 מיקרוליטר לארבע נקודות שוות בצינורות PCR נטולי RNase עם קירות דקים של 0.2 מ"ל ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות במכונת PCR.
   הערה: 50 מיקרוליטר לצינור הוא נפח התגובה המרבי שניתן להשתמש בו במכונת PCR.
3. הרוו כל תגובה עם 10 מיקרוליטר של 1.5 M נתרן אצטט ו-0.5 מ"מ EDTA (pH 5.6).
4. בצע טיהור עמודות עם ארבע עמודות ספין מקבילות כדי להסיר מגיבים מוגזמים בהתאם לנוהל כמתואר בשלבים 2.1.5-2.1.8. ממיסים את המוצר המטוהר ב-15 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC בכל צינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל.
5. העבירו את המוצר המטוהר לארבעה צינורות PCR נטולי RNase ובעלי קירות דקים של 0.2 מ"ל. הוסף 20 מיקרוליטר של מאגר 0.1 M Na₂CO₃ (pH 10.4) לכל 15 מיקרוליטר של מוצר מטוהר והוסף H₂O שטופל ב-DEPC כדי ליצור נפח סופי של 40 מיקרוליטר לכל צינור תגובה (בסך הכל ארבעה צינורות). דגרו את התגובה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים במכונת PCR.
6. להרוות ולטהר את התגובה על ידי טיהור עמודות עם ארבע עמודות ספין מקבילות כמתואר בשלב 2.1.5. הוצא את המוצר המומר ψ CMC לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה נטולת RNase בנפח 1.5 מ"ל כל אחת עם 15 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC.
7. שלב את הדגימה המטוהרת של CMC-ψ מארבעה צינורות איסוף לצינור אחד. בצע פירוק חומצה פורמית ב-50% (v/v) על פי הנהלים המתוארים בשלבים 4.1-4.6 ליצירת סולמות טרשת נפוצה לריצוף.

6. מדידת LC-MS

1. הכן שלבים ניידים למדידת LC-MS. שלב נייד A הוא 25 מ"מ hexafluoro-2-propanol עם 10 מ"מ דיאיזופרופילאמין במים בדרגת LC-MS; שלב B נייד הוא מתנול.
2. העבר את הדגימה לבקבוקון דגימת LC-MS לניתוח. כל נפח הזרקת דגימה הוא 20 מיקרוליטר המכיל 100-400 pmol של RNA.
3. השתמש בתנאי ה-LC הבאים: טמפרטורת עמודה של 35 מעלות צלזיוס, קצב זרימה של 0.3 מ"ל/דקה; שיפוע ליניארי מ-2-20% שלב B נייד במשך 15 דקות ואחריו שלב כביסה של 2 דקות עם 90% שלב B נייד.
   הערה: עבור תוויות קצה הידרופוביות יותר כגון Cy3 ו-sulfo-Cy3 כפי שהוזכר בסעיף 2, ייתכן שיהיה צורך באחוז גבוה יותר של ממס אורגני לפליטת דגימה (כלומר, ניתן להשתמש בשיפוע דומה אך עם טווח אחוזים מוגבר של שלב B נייד). לדוגמה, 2-38% שלב B נייד במשך 30 דקות עם שלב כביסה של 2 דקות עם 90% שלב B נייד.
4. הפרד ונתח דגימות בספקטרומטר מסה Agilent Q-TOF (Quadrupole Time-of-Flight) יחד עם מערכת LC המצוידת בדגימה אוטומטית ומערכת MS HPLC (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים). עמודת LC היא עמודת C18 בגודל 50 מ"מ x 2.1 מ"מ עם גודל חלקיקים של 1.7 מיקרומטר. השתמש בהגדרות MS הבאות: מצב יונים שליליים; טווח, 350 m/z עד 3200 m/z; קצב סריקה, 2 ספקטרים לשנייה; זרימת גז ייבוש, 17 ליטר לדקה; טמפרטורת גז ייבוש, 250 מעלות צלזיוס; לחץ נבולייזר, 30 psig; מתח נימי, 3500 וולט; ומתח פרצנטור, 365 וולט. שימו לב שפרמטרים אלה ספציפיים לסוג או לדגם של ספקטרומטר המסה בו נעשה שימוש.
5. רכוש נתונים באמצעות תוכנת הרכישה Agilent MassHunter. השתמש בזרימת עבודה של חילוץ תכונות מולקולאריות זריזות (MFE) כדי לחלץ מידע מורכב כולל מסה, זמן שמירה, נפח (שפע MFE עבור מיני היונים המתאימים) וציון איכות וכו'. השתמש בהגדרות MFE הבאות: "פורמט נתונים מרכזי, מולקולות קטנות (כרומטוגרפיות), שיא בגובה ≥ 100, עד מקסימום 1000, ציון איכות ≥ 50".
   הערה: מטב את הגדרות MFE כדי לחלץ תרכובות פוטנציאליות רבות ככל האפשר, עד 1000 לכל היותר, עם ציוני איכות של ≥ 50.

7. אוטומציה של יצירת רצף RNA על ידי אלגוריתם חישובי

הערה: הליך זה מוצג רק עבור RNA #1 באיור 1c.

1. מיין תרכובות שחולצו MFE לפי סדר ירידה בנפח (עוצמת שיא)_ו-tR. בצע בחירה מוקדמת של נתונים באמצעות 1) הגדרת t_R בין 4 ל-10 דקות כדי לבחור את שברי ה-RNA המסומנים על ידי הביוטין, מכיוון שה-t_Rשל רכיבי סולם המסה המסומנים בביוטין מועברים לחלון t_R זה (4 דקות עד 10 דקות), ו-2) תוך שימוש בסדר גודל גבוה יותר של תרכובות קלט ממספר שברי הסולם לחישוב אלגוריתם כדי להפחית את כמות הנתונים על סמך נפח. לדוגמה, עבור 20 nt RNA, 20 רכיבי סולם mass-t_R מסומנים יידרשו לריצוף של 20 nt RNA, וכך, 200 תרכובות מקובץ הנתונים MFE ייבחרו על סמך נפח. שימו לב שחלון t_R עשוי להיות שונה כאשר נעשה שימוש בסוג או דגם אחר של ספקטרומטר מסה.
2. בצע עיבוד נתונים ויצירת רצף של RNA #1 באמצעות גרסה מתוקנת של אלגוריתם שפורסם⁸. קודי המקור של האלגוריתם המתוקן תוארו קודם לכן (https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)⁹.
3. בנוסף לאוטומציה של יצירת רצף באמצעות האלגוריתם, חשב ידנית את הפרשי המסה בין שני רכיבי סולם סמוכים לקריאת בסיס. ניתן לקרוא לכל הבסיסים ב-RNA באופן ידני ולהתאים אותם לבסיסים התיאורטיים במסד הנתונים של נוקלאוטידים ושינוי RNA⁸; לפיכך, ניתן לקרוא במדויק את הרצף המלא של גדיל ה-RNA באופן ידני, המשמש לאישור הדיוק של קריאת הרצף המדווח על ידי האלגוריתם. מבנים נוספים של שינויים ב-RNA ניתן למצוא במאגרי שינוי RNA¹², והמסות התיאורטיות המתאימות להם מתקבלות על ידי ChemBioDraw. בטבלאות S1-S2, הפרש המסה של ppm (חלקים למיליון) מוצג כאשר משווים את המסה הנצפית למסה התיאורטית שלה עבור רכיב סולם ספציפי, וערך קטן מ-10 ppm נחשב להתאמה טובה עבור כל קריאת בסיס.

8. רצף תערובות RNA

1. סמנו תערובת של חמישה גדילי RNA (RNA #1 עד #5) ב-3'-00 שלהם עם A(5')pp(5')Cp-TEG-biotin באמצעות פרוטוקול חד-שלבי המתואר בשלב 2.2. בנפח כולל של תמיסת תגובה של 150 מיקרוליטר, הוסף 15 מיקרוליטר של מאגר תגובה של 10x T4 RNA ליגאז, 1.5 מיקרוליטר מכל גדיל RNA (מלאי 100 מיקרומטר של RNA #1 עד #5, בהתאמה, לנפח כולל של 7.5 מיקרוליטר), 10 מיקרוליטר של 150 מיקרומטר A(5')pp(5')Cp-TEG-ביוטין, 15 מיקרוליטר של DMSO נטול מים, 5 מיקרוליטר של T4 RNA ליגאז (10 יחידות/מיקרוליטר), ו-97.5 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC. מחלקים באופן שווה את תמיסת התגובה לחמש אליקוטות. כל צינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase מכיל 30 מיקרוליטר של תמיסת תגובה.
2. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס במכונת PCR.
3. בצע טיהור עמודות על פי הנוהל כמתואר בשלבים 2.1.5-2.1.8 עם חמש עמודות ספין מקבילות. יש להוציא דגימת תערובת של 5 גדילי RNA 3'-biotinylated (תערובת של RNA #1 עד #5) לצינור מיקרו-צנטריפוגה נטול RNase בנפח 1.5 מ"ל כל אחד עם 15 מיקרוליטר של H₂O שטופל ב-DEPC.
4. שלב את דגימות התערובת המטוהרות מחמשת צינורות האיסוף לצינור אחד. בצע פירוק חומצה פורמית על פי ההליך המתואר בסעיף 4.
5. מדוד דגימות לפי LC-MS כמתואר בסעיף 6, ונתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים עם הגדרות MFE ממוטבות כדי לחלץ נתונים המכילים מסה, t_R ונפח כמתואר בשלב 6.5. אלגוריתם העיבוד וקריאת הבסיס הטיפוסי אינו מיושם בשל מורכבות הנתונים המוגברת משמעותית הנובעת מהתערובת. כל הבסיסים ב-RNA של הדגימה המעורבת נקראים ידנית בשיטה הדומה לסעיף 7.3 ותואמים היטב את הבסיסים התיאורטיים במסד הנתונים של נוקלאוטידים ושינויים של RNA⁸, וכך הרצפים המלאים של כל חמשת גדילי ה-RNA בדגימה המעורבת נקראים במדויק. בטבלאות S7-S11, כל המידע מפורט כולל מסה נצפית, t_R, נפח, ציון איכות והפרש מסה ppm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הצגת תג ביוטין לקצה ה-3 של ה-RNA כדי לייצר סולמות Mass-t_R הניתנים לזיהוי בקלות. זרימת העבודה של גישת 2D-HELS MS Seq מודגמת באיור 1a. תווית הביוטין ההידרופובית שהוצגה לקצה ה-3 של ה-RNA (ראה סעיף 2) מגדילה את המסות_וה-tR של רכיבי הסולם המסומנים ב-3' בהשוואה ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בניגוד לפיצול MS מבוסס טנדם, הידרוליזה חומצית מבוקרת מאוד משמשת בגישת 2D-HELS MS Seq כדי לפצל את ה-RNA לפני הניתוח עם ספקטרומטר מסה ^9,10. כתוצאה מכך, ניתן לזהות כל שבר מושפל בחומצה על ידי המכשיר, ויוצר את המקבילה לסולם ריצוף. בתנאים אופטימליים, שיטה זו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5' DNA Adenylation kit	New England Biolabs	E2610S	50uM concentration
6550 Q-TOF mass spectrometer	Agilent Technologies	5991-2116EN	Coupled to a 1290 Infinity LC system
A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin-3´	ChemGenes	91718	HPLC purified
ATPγS	Sigma-Aldrich	11162306001	Lithium salt
Bicine	Sigma-Aldrich	B8660	BioXtra, ≥99% (titration)
Biotin maleimide	Vector Laboratories	SP-1501	Long arm
C18 column	Waters	186003532	50 mm × 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 μm
Centrifugal Vacuum Concentrator	Labconco	Refrig 115v/60hz 7310022	Labconco CentriVap
ChemBioDraw	PerkinElmer	ChemDraw Prime	Generate a chemical structure and property data of structures & fragments
CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)	Sigma-Aldrich	2491-17-0	95% Purifiy
Cyanine3 maleimide (Cy3)	Lumiprobe	11080	Water insoluble
DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9906	Autoclaved, certified nuclease-free
Diisopropylamine (DIPA)	Thermo Fisher Scientific	108-18-9	99% Alfa Aesar
DMSO	Sigma-Aldrich	276855	Anhydrous dimethyl sulfoxide, 99.9%
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758	Anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
Formic acid	Merck	64-18-6	98-100%, ACS reag, Ph Eur
Hexafluoro-2-propanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	920-66-1	99% Acros Organics
LC-MS sample vials	Thermo Fisher Scientific	C4000-11	Plastic screw thread vials
LC-MS vial caps	Thermo Fisher Scientific	C5000-54A	Autosampler vial screw thread caps
Na2CO3 buffer	Sigma-Aldrich	88975	BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3
Oligo Clean & Concentrator	Zymo Research	D4060	Spin column
OriginLab	OriginLab	OriginPro	Data analysis and graphing software
pCp-biotin	TriLink BioTechnologies	NU-1706-BIO	20 ul (1 mM)
RNA #1--#6	Integrated DNA Technologies	Custom RNA oligos	19nt-21nt single-stranded RNAs, used without further purification
Rocking platform shaker	VWR	Orbital Shaker Standard 1000	Speed Range 40 to 300 rpm
Streptavidin magnetic beads	Thermo Fisher Scientific	88816	Binding approx. 55ug biotinylated rabbit lgG per mg of beads
Sulfonated Cyanine3 maleimide	Lumiprobe	11380	Water soluble
T4 DNA ligase 1	New England Biolabs	M0202S	400 units/uL
T4 polynucleotide kinase	Sigma-Aldrich	T4PNK-RO	From phage T4 am N81 pse T1 infected Escherichia coli BB
Tris-HCl buffer	Sigma-Aldrich	T6455	Tris-HCl Buffer, pH 10, 10×, Antigen Retriever
Urea	Sigma-Aldrich	81871	Urea for synthesis. CAS No. 57-13-6, EC Number 200-315-5.