תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

Aaron R. Waddell; Daiqing Liao

doi:10.3791/61289

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

Abstract

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילציה זליזה של שאריות לינזין על היסטונים וחלבונים אחרים לווסת דינמיקה כרומטין וביטוי גנים. KATs, כגון CBP/p300, נמצאים תחת חקירה אינטנסיבית כיוקדים טיפוליים בשל תפקידם הקריטי בגידולים של סוגי סרטן מגוונים. הפיתוח של מעכבי מולקולה קטנה רומן מיקוד התפקוד אצטילטרנספראז histone (HAT) של KATs הוא מאתגר ודורש תסרוקות חזקות שיכולות לאמת את הספציפיות והעוצמה של מעכבים פוטנציאליים.

מאמר זה מתאר צינור של שלוש שיטות המספקות אימות קפדני במבחנה עבור מעכבי HAT חדשניים (HATi). שיטות אלה כוללות צינור הבדיקה כובע אסיי, כרומטין Hyperacetylation עיכוב (ChHAI) אסיא, ו PCR כמותי חיסוני כרומטין (ChIP-qPCR). ב-HAT ASSay, ה-HATs הרקומביננטיים מצופים בהסטונים בתגובה למבחנה, ומאפשרים אצטילציה של שאריות לינזין ספציפיות על זנבות האבן. תגובה זו יכולה להיות חסומה על ידי HATi ואת הרמות היחסיות של אצטילציה היסטון ספציפית לאתר ניתן למדוד באמצעות immunoblotting. מעכבים שזוהו ב-HAT Assay צריכים להיות מאושרים בסביבה הסלולרית.

אסיי ChHAI משתמש immunoblotting למסך עבור הרומן HATi כי להקטין את hyperacetylation חזק של היסטונים המושרה על ידי מעכב deacetylase histone (HDACi). התוספת של HDACi הוא מועיל כי רמות בסיס של אצטילציה histone יכול להיות קשה לזהות באמצעות immunoblotting.

ה-HAT ו-ChHAI מודדים שינויים גלובליים באצטילציה של היסטון, אך אינם מספקים מידע אודות אצטילציה באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, ChIP-qPCR משמש כדי לחקור את ההשפעות של HATi על רמות אצטילציה histone באלמנטים רגולטוריים גנים. זה מושג באמצעות פירוק חיסוני סלקטיבי של תסביכות היסטון-DNA וניתוח של ה-DNA המטוהר באמצעות qPCR. יחד, שלוש האמורות הללו מאפשרות אימות זהיר של הספציפיות, העוצמה והמנגנון של הפעולה של הרומן HATi.

Introduction

לייסין אצטילtransferases (KATs) לדלל את האצטילציה של שאריות לייסין על חלבונים histone ולא^{היסטון 1,}^,^2,^,^3,^,⁴. מחקרים אחרונים מגלים כי KATs ותפקוד אצטילטרנספראז שלהם יכול לקדם צמיחה גידול מוצק⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. לדוגמה, חלבון מחייב CREB (CBP)/p300 הם שני KATs פרלוגים המסדירים מסלולי איתות רבים^{בסרטן 2}^,³. CBP/p300 יש פונקציה אצטילטרנספראז היסטון מאופיינת היטב (HAT) ללקט את Histone 3 ליסין 27 אצטילציה (H3K27ac)^2,^,^4,^,^5,^,^10,^,¹¹, סמן חשוב עבור משפרי פעיל, אזורי קידום ותעתוק^{גנים פעיל 12,}^,^13,^,¹⁴. CBP/p300 לשמש כמפעילים שותף קריטי עבור נתיבי איתות פרו-צמיחה בגידולים מוצקים על ידי הפעלת שעתוק של אונקוגנים באמצעות אצטילציה של היסטון ותמלול^{גורמים אחרים 4,}^,^9,^,¹⁵^,^16,^,¹⁷^,¹⁸. בשל תפקידם בהתקדמות הגידול, CBP/p300 ו KATs אחרים נמצאים תחת חקירה לפיתוח מעכבי רומן החוסמים את הפונקציה האונקוגנית^{שלהם 4,}^,^5,⁶^,^,⁷^,^8,^,^9,^,^18,^,^19,^,²⁰. A-485 ו GNE-049 מייצגים שני ניסיונות מוצלחים לפתח מעכבים חזקים וספציפיים עבור CBP/p300⁴^,⁹. מעכבים נוספים נמצאים כעת תחת חקירה עבור CBP/p300 ו KATs אחרים.

האיכות של מעכבי KAT שתוארו קודם לכן (KATi) נקרא בשאלה, עם מעכבים רבים להשוויץ השפעות היעד ואפיון גרוע²¹. לכן, אפיון קפדני ואימות של מועמדים לסמים חדשניים חיוני לפיתוח של בדיקות כימיות באיכות גבוהה. להלן שלושה פרוטוקולים הנוהרים צינור לסינון ומאמתים בקפדנות את העוצמה והספנות של הרומן KATi, עם דגש ספציפי על עיכוב פונקציית HAT (HATi) של KATs. CBP/p300 והמעכבים שלהם משמשים כדוגמאות, אך פרוטוקולים אלה יכולים להיות מותאמים עבור KATs אחרים בעלי פונקציית HAT⁷.

הפרוטוקול הראשון הוא אצטילטרנספראז היסטון במבחנה (HAT) תסיסה המשתמשת p300 רקומביננטי מטוהרים והישטונים בתגובה מבוקרת צינור. תוואי זה הוא פשוט לביצוע, הוא חסכוני, ניתן להשתמש בו כדי לסנן תרכובות בהגדרת תפוקה נמוכה, ואינו דורש חומרים רדיואקטיביים. בפרוטוקול זה, p300 קתליציה רקומביננטי אצטילציה ליאזין על זנבות histone במהלך תקופת דגירה קצרה ואת רמות האצטילציה histone נמדדים באמצעות נהלי אימונובולוט סטנדרטיים. התגובה האנזימטית יכולה להתבצע בנוכחות או בהיעדר מעכבי CBP/p300 כדי לסנן עבור תרכובות להפחית אצטילציה histone. בנוסף, ניתן להשתמש ב-HAT כדי לוודא אם תרכובות חדשניות הן סלקטיביות עבור CBP/p300 על-ידי הערכת פעילותן מול KAT מטוהרים אחרים, כגון PCAF. Assay כובע הוא נקודת התחלה מצוינת לחקירת מעכבי רומן בשל הפשטות שלה, עלות נמוכה, ואת היכולת לקבוע את העוצמה / לקטיביות של מעכב. אכן, פרוטוקול זה משמש לעתים קרובות בספרות כמסכים במבחנה⁵^,¹⁰. עם זאת, מעכבים שזוהו ב- HAT assay לא תמיד יעילים בתרבות התא כי תגובת מבחנה היא הרבה יותר פשוטה מאשר מערכת תא חי. לכן, זה חיוני כדי לאפיין מעכבים נוספים בניסויים תרבות התא²²^,²³.

הפרוטוקול השני בצינור הוא עיכוב Hyperacetylation כרומטין (ChHAI) אסה. זה תא מבוסס assay מנצל מעכבי deacetylase histone (HDACi) ככלי היסטונים hyperacetylate בכרומטין לפני דגירה שיתופית עם HATi²⁴. אצטילציה היסטון בסיס יכול להיות נמוך בתרבות התא, מה שהופך את זה קשה בדיקה באמצעות immunoblotting ללא תוספת של HDACi כדי להגדיל את האצטילציה. מטרת ההסדה ChHAI היא לזהות את הרומן HATi שיכול להקטין את העלייה באצטילציה היסטון הנגרמת על ידי עיכוב HDAC. היתרונות של אסיי זה כוללים את העלות הנמוכה שלה, קלות יחסית לבצע, ואת השימוש בתאים בתרבות, אשר מספק רלוונטיות פיזיולוגית יותר מאשר צינור הבדיקה HAT assay. בדומה ל- HAT assay, פרוטוקול זה משתמש ב- immunoblotting סטנדרטי לאיסוף נתונים.

ASSay HAT ו ChHAI לספק נתונים על העוצמה של תרכובות חדשניות לעיכוב אצטילציה histone העולמי, אבל אינם מספקים תובנה כיצד תרכובות אלה משפיעות על שינויים באזורים גנומיים ספציפיים. לכן, הפרוטוקול הסופי, כרומטין Immunoprecipitation-כמוות פולימראז תגובת שרשרת (ChIP-qPCR) הוא ניסוי תרבות התא החוקר אינטראקציות DNA-חלבון באזורים ספציפיים של הגנום. בפרוטוקול ChIP, כרומטין הוא crosslinked כדי לשמר אינטראקציות חלבון DNA. הכרומטין מופק לאחר מכן מתאי ותסביך חלבון ה-DNA עובר פירוק חיסוני סלקטיבי עבור חלבון של עניין (למשל, באמצעות נוגדן ספציפי עבור H3K27ac). לאחר מכן ה-DNA מטוהר וניתח באמצעות qPCR. לדוגמה, ChIP-qPCR יכול לשמש כדי לקבוע אם רומן HATi downregulates אצטילציה histone באונקוגנים בודדים, כגון Cyclin D1²⁵. בעוד ChIP-qPCR היא טכניקה נפוצה בשימוש בתחום, זה יכול להיות קשה לייעל⁴^,¹⁰^,²⁶. פרוטוקול זה מספק עצות למניעת מלכודות פוטנציאליות שעלולות להתרחש בעת ביצוע הליך ChIP-qPCR וכולל בדיקות בקרת איכות שיש לבצע בנתונים.

כאשר נעשה שימוש יחד, שלושת הפרוטוקולים הללו מאפשרים אפיון קפדני ואימות של הרומן HATi. בנוסף, שיטות אלה מציעות יתרונות רבים כי הם קלים לביצוע, זול יחסית ולספק נתונים על אצטילציה histone גלובלית, כמו גם אזורית.

Protocol

1. במבחנה כובע תסה

הכנת מאגר
הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני מאגר.
1. הכן מאגר הבחנה של 5x ו-6 דודיום דודציל סולפט (SDS) ואחסן ב-20°C. אליקוט SDS ב 1 מ"ל aliquots.
2. הכן מאגר ריצה של ג'ל SDS 10x ו-TBST של 10x ומאחסנים בטמפרטורת החדר.
3. הכן מאגר העברה אחד ואחסן ב- 4 °C.
  התראה: בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה. SDS, DTT, ו כחול ברומונול רעילים ים אין לבלוע, לשאוף, או חשוף לעור או לעיניים. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת הליכי טיפול נאותים. אנא השתמש בכסה מנוע אדים כימי לטיפול בכימיקלים מסוכנים.
תגובת HAT
הערה: חומצה אנאקרדית הוא מעכב p300 ידוע 3 והוא משמש^כדוגמה כדי להדגים כיצד assay HAT יכול לזהות מעכבי p300 רומן. ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 1) לקבלת תרשים של שלב 1.2.1.
1. להכין את התגובה האנזימטית הבאה בצינור PCR 0.2 מ"ל: 2 μL של מאגר 5x assay, 1 μL של p300 מטוהר (0.19 μg/ μL), 1 μL של חומצה אנאקרדית (HATi) או DMSO שליטה מדוללת 1x מאגר תסה ו 2 μL של ddH autoclaved₂O. טרום דגירה תערובת זו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להוסיף 3 μL של 100 μM אצטיל-CoA ו 1 μL של H3.1 מטוהר (0.2 μg/ μL) לתגובה.
2. דגירה תערובת התגובה המלאה ב 30 ° C עבור 1 שעה במחזור תרמי PCR.
3. הוסף 2-mercaptoethanol ביחס 1:10 למאגר מדגם SDS 6x.
4. הסר דגימות מהמחזור התרמי PCR ולהוסיף 2 μL של 6x SDS (עם 2-mercaptoethanol הוסיף) לתערובת התגובה.
  התראה: 2-mercaptoethanol הוא רעיל ויש להשתמש בו בתוך מכסה מנוע אדים כימי. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת טיפול נכון.
5. מחממים דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על בלוק חום ומצננים על קרח. אחסן את הדגימות ב-20 או -80°C או בצע אלקטרופורזה של ג'ל וחיסונים כמפורט להלן.
אלקטרופורזה ג'ל וחיסונים
הערה: אם אינו מכיר אלקטרופורזה ג'ל וimmunoblotting,^{עיין בהליך סטנדרטי זה 27} לקבלת פרטים נוספים על אופן ביצוע שלבים 1.3.1-1.3.17. מידע נוסף ניתן למצוא^{כאן 28}^,²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³.
1. פיפטה 10 μL של דגימות (מ שלב 1.2.5.) לתוך הבארים של 4-20% ג'ל polyacrylamide הדרגתי. פיפט 5 μL של סולם חלבון לתוך אחת בארות כהתייחסות משקל מולקולרי. הפעל את הג'ל ב 120 V במשך 90 דקות באמצעות מיכל ג'ל.
2. מעבירים את הג'ל לממברנה פוליוינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב-100 V למשך 70 דקות באמצעות מיכל העברה.
3. מוציאים את הממברנה מאפליקציית ההעברה ומנינים אותה במיכל פלסטיק. חסמו את הממברנה על-ידי הוספת TBST אחד (המכיל 5% חלב) למכל ולנער בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
4. הסר את ה- TBST 1 מתוך שלב 1.3.3. דגירה את הממברנה בן לילה עם נוגדנים אצטיל ספציפיים לאתר נבחרים (למשל, H3K18ac או H3K27ac נוגדנים ראשיים ב 1:5,000 דילול ב 1x TBST המכיל 5% חלב) ב 4 ° C עם טלטול עדין.
5. הסר את פתרון הנוגדנים הראשי. יש לשטוף את הממברנה 2x עם TBST אחד (ללא חלב) בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 15 דקות כל שטיפה.
6. לדלל את הנוגדן המשני בשעה 1:20,000 ב 1x TBST (המכיל 5% חלב) ותדגר את הממברנה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
7. הסר את פתרון הנוגדנים המשני. יש לשטוף את הממברנה 2x עם TBST אחד (ללא חלב) בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 15 דקות כל שטיפה.
8. לנקז את 1x TBST מהממברנה. ערבב תמיסת מי חמצן של כרוב HRP ופתרון לומינול של כרוב HRP ביחס של 1:1 (1 מ"ל מכל אחד) ופיפטה 2 מ"ל של הפתרון המשולב למשטח הממברנה.
9. דגירה את הפתרון עם קרום במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. מנקזים עודפי שמלומינסנטים מהממברנה על גבי מגבת נייר וממקם את הממברנה בניילון נצמד בתוך מחזיק קלטת רנטגן.
11. עברו לחדר חשוך המוקדש לעיבוד סרט רנטגן. לחשוף את הממברנה לסרט רנטגן על ידי הצבת הסרט על גבי הממברנה וסגירת הקלטת עבור 30 שניות.
  הערה: יש לקבוע את זמן המגע בין הסרט לבין הממברנה באופן ניסיוני. אותות חזקים יזדקקו לחשיפות קצרות (שניות) ואותות חלשים יותר עשויים להזדקק לחשיפה ארוכה יותר.
12. הסר את סרט הרנטגן מהקלטת ועיבד את הסרט על-ידי הפעלתו במעבד צילום רנטגן. עיין במדריכים של היצרן לקבלת הוראות ספציפיות כיצד לעבד את סרט הרנטגן.
13. מוציאים את הממברנה מעוטף הניילון ושוטפים אותה עם ddH 2 O_למשך5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
14. דגירה את הממברנה עם 0.2 M NaOH במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
15. לשטוף את הממברנה עם ddH 2 O_במשך5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעידות עדינות.
16. חסמו את הממברנה על-ידי הוספת TBST אחד (המכיל 5% חלב) למכל ולנער בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
17. הוסף את דילול הנוגדנים הראשי הבא (לדוגמה, בדיקה עבור H3K27ac אם הנוגדן הראשון בשימוש היה H3K18ac) ולנער לילה ב 4 ° C. חזור על שלבים 1.3.4-1.3.17 עד השלמת כל בדיקות הנוגדנים.

2. תסה ChHAI

במבחנה טיפולים תרופתיים וניתוח של היסטון אצטילט
הערה: A-485 הוא p300 HATi חזק ומאופיין היטב²^,⁴ . מעכב זה יהיה מנוצל בssays הנותרים בשל יעילותו וספגם בתרבות התא. MS-275 (נטינוסטט)²⁴ הוא HDACi אשר מגדיל באופן ניכר את רמות האצטילציה histone והוא משמש כדי להקל על זיהוי קל יותר של בדיקות אצטילציה עם immunoblotting סטנדרטי. לראות פרוטוקול משלים (סכמטי 2), עבור סכמטי של דילול התרופה בשימוש בשלב 2.1.
1. זרע 100,000 תאי MCF-7 בצלחת 12 באר ולאפשר לתאים לגדול 80-90% confluency ב 1 מ"ל של תא תרבות בינונית. סמן את הבארים עבור העיצוב הניסיוני הבא: טוב 1: בקרת DMSO (נקודת התייחסות); טוב 2: A-485 (3 μM); טוב 3: A-485 (10 μM); ובכן 4: MS-275 (3 μM); גם 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μM); גם 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
  הערה: עבור culturing תאי MCF-7, השתמש במדיה DMEM מלאה ואפשר לתאים לגדול ב- 37 °C עם 5% CO₂. ראה טבלה 1 לקבלת מתכון DMEM מלא.
2. בשעה 24 שעות לאחר זריעה, פיפטה 4 מ"ל של מדיה DMEM מלאה לצינור סטרילי 15 מ"ל חמור. פיפטה 2 μL של MS-275 (6 mM ב DMSO) כדי 4 מ"ל של בינוני עבור ריכוז סופי של 3 μM MS-275.
3. פיפטה 2 μL של DMSO כדי 4 מ"ל של בינוני בצינור סטרילי נפרד 15 מ"ל חסה.
  התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות לקבלת טיפול נכון ב- DMSO. סוגי כפפות מסוימים אינם מדורגים לטיפול ב- DMSO.
4. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 4-6 ו פיפטה 1 מ"ל של 3 μM MS-275 במדיום (שלב 2.1.2) לכל באר. בטל MS-275 מדולל שלא נו.ח.
5. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-3 ו פיפטה 1 מ"ל של DMSO מדולל (שלב 2.1.3) לכל באר. בטל DMSO מדולל שלא נו.סי.
6. להחזיר את התאים אינקובטור דגירה במשך 4 שעות כדי לאפשר הצטברות של היסטונים אצטילאט בתאים חשופים MS-275 (בארות 4-6).
  הערה: MS-275 הוא HDACi ו יגרום היפראצטילציה histone²⁴. זה 4 שעות לפני הדגירה יש צורך לאפשר MS-275 לגרום היפראצטיילציה לפני התוספת של A-485, אשר מפחית אצטילציה histone^2,^,⁴.
7. לאחר 4 שעות של דגירה עם MS-275, להכין את דילולות הבאות בצינורות סטריליים נפרדים 1.5 מ"ל על ידי pipetting: 1.0 μL של DMSO כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו 0.5 μL A-485 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו 0.5 μL של A-485 (20 mM) כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של DMSO ו- 0.5 μL של MS-275 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של A-485 (6 mM) ו 0.5 μL של MS-275 (6 mM) עד 1 מ"ל של מדיה DMEM; 0.5 μL של A-485 (20 mM) ו 0.5 μL של MS-275 (6 mM) כדי 1 מ"ל של מדיה DMEM.
8. לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-6 ופיפטה 1 מ"ל של דילול 1 לבאר 1, דילול 2 לבאר 2, דילול 3 לבאר 3, דילול 4 לבאר 4, דילול 5 לבאר 5, ו דילול 6 לבאר 6.
  הערה: כלל כללי הוא לאזן תוכן DMSO (ממס) בין קבוצות ניסיוניות ולא לחרוג 0.1% תוכן DMSO בתרבות התא כדי למנוע רעילות תאית ושינויים בהתפשטות.
9. מחזירים את התאים לאקובטור ולתרבות למשך 20 שעות.
10. לאחר 20 שעות, לשאוף את מדיום תרבות התא מבארות 1-6.
11. לשטוף את התאים על ידי pipetting 1 מ"ל של PBS לבארות 1-6. לשאוף את PBS.
12. הוסף 100 μL של מאגר 1x lysis פסיבי (ראה טבלה 1)לבארות 1-6. לאחסן את לוח התרבות התא (עם דגימות במאגר lysis פסיבי) ב -80 °C לילה להקפאת וליזה של תאים.
  התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים לפני יצירת מאגרים. CDTA יכול לגרום נזק רציני לעיניים וגירוי.
13. להפשיר דגימות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין במשך 10 דקות. מעבירים דגימות לצינורות 1.5 מ"ל נפרדים ומעבירים מיד על הקרח.
14. למדוד ריכוז חלבון של כל מדגם. ריכוז חלבון ניתן לקבוע באמצעות מספר פרוטוקולים מבוססים^{היטב 34}.
15. ריכוז חלבון שווה בין דגימות 1-6 (בנפח שווה) באמצעות מאגר 1x פסיבי לדילול, במידת הצורך.
16. הוסף 2-mercaptoethanol ביחס 1:10 למאגר מדגם SDS 6x.
17. הוסף מאגר מדגם SDS 6x עם 2-mercaptoethanol לדגימות 1-6 לריכוז הסופי של מאגר מדגם SDS 1x.
18. מחממים דגימות ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על בלוק חום ומצננים על קרח. ניתן לאחסן דגימות ב- -20°C או -80 °C עד לשלב 2.1.19.
19. פיפט נפח המכיל 30 μg של חלבון עבור דגימות 1-6 לבארות בג'ל פוליקרילמיד הדרגתי 4-20%. בצע הליך אימונובולטינג לפי פרוטוקול המתואר בפרוטוקול 1.

3. ChIP-qPCR

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתואר עבור מעכבי p300 כדוגמה.

הכנת מאגר
הערה: ראה טבלה 1 לקבלת מתכוני מאגר. השלבים הכלליים של פרוטוקול ChIP (למשל מתכוני מאגר, זמני שטיפה ושנות צנטריפוגציה) להלן משתנים ומותאמות מהמלצות היצרן של ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים)^{ומהספרות 35}^,³⁶.
1. הכן מאגר דילול ChIP, מאגר נפיחות גרעין, מאגר שטיפת מלח נמוך, מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפה LiCl ומאגר TE. לאחסן ב-4°C.
2. הכן מאגר פירוק SDS, מאגר גלצין 10x ומאגר חומת ChIP. לאחסן בטמפרטורת החדר.
  התראה: נא בדוק את גליון נתוני הבטיחות עבור כל הכימיקלים לפני יצירת מאגרים כדי להבטיח טיפול נכון.
טיפול תרופתי
הערה: ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 3) לקבלת תרשים של דילול התרופה המשמש בשלב 3.2.
1. זרעי תאי MCF-7 בשתי מנות תרבות של 15 ס"מ ותאי הגדלים תאים ל-90% קונפלואנציות ב-12 מ"ל של מדיום DMEM השלם. סמן את הכלים עבור העיצוב הניסיוני הבא: Dish 1: בקרת DMSO (נקודת התייחסות); מנה 2: A-485 (3 μM).
  הערה: עבור תאי MCF-7, השתמש במדיה DMEM מלאה ולגדול ב- 37 °C עם 5% CO₂. ראה טבלה 1 לקבלת מתכון DMEM מלא.
2. בצינור סטרילי 15 מ"ל חמור, פיפטה 12 מ"ל של מדיה DMEM ופיפטה 6 μL של DMSO. מערבבים היטב.
3. בצינור 15 מ"ל נפרד, פיפטה 12 מ"ל של מדיה DMEM ופיפטה 6 μL של A-485 (6 mM ב DMSO) כדי לקבל ריכוז סופי של 3 μM A-485. מערבבים היטב.
4. שאף את התקשורת מצלחת 1 ו-2.
5. הוסף את 12 מ"ל DMSO מדולל ב- DMEM (שלב 3.2.2.) לצלחת 1.
6. הוסף את 12 מ"ל של 3 μM A-485 ב- DMEM (שלב 3.2.3.) לצלחת 2.
7. מחזירים את מנות תא האינקובטור ותו לא במשך 24 שעות.
קיבעון תאים
1. פיפט 330 μL (27.5 μL לכל מ"ל) של 37% פורמלדהיד למדיה המלאה ומערבבים בעדינות את הצלחת לערבב.
  זהירות: פורמלדהיד רעיל. נא עיין בגיליון נתוני בטיחות לקבלת הליכי טיפול נאותים.
2. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. פיפט 2 מ"ל של גלצין 10x לצלחת ומערבול לערבב.
4. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לאחר הדגירה, מניחים כלים על קרח ומפשירים את הקוקטייל של מעכב פרוטאז.
6. הכן את הפתרונות הבאים הן עבור דוגמאות DMSO והן עבור A-485 באמצעות המאגרים שהוכנו בשלב 3.1.
  1. 2 מ"ל של PBS עם דילול 1:1,000 של קוקטייל מעכב פרוטאז
  2. 1 מ"ל של גרעין נפיחות מאגר עם 1:1,000 דילול של קוקטייל מעכב פרוטאז
  3. 0.5 מ"ל של מאגר lysis SDS עם דילול 1:1,000 של קוקטייל מעכב פרוטאז
7. לשאוף את התקשורת מכלי תרבות התא ולשטוף את התאים פעמיים עם 15 מ"ל של PBS קר.
8. פיפט 2 מ"ל של PBS עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.1) לכלי תרבות התא. הרם את התאים לפתרון באמצעות מגרד תאים.
9. העבר את מתלה התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה. אסוף תאים נותרים עם PBS נוספים במידת הצורך.
10. צינורות ספין ב 800 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי גלולות התאים.
11. לשאוף את supernatant ופיפטה 1 מ"ל של גרעין נפיחות מאגר עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.2) אל הכדור. תוסתו מחדש את הכדור ותדגירה על קרח במשך 10 דקות.
12. צנטריפוגה הצינורות ב 2,700 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות כדי גרעין גלולה.
13. שאיפה supernatant ופיפטה 0.5 מ"ל של מאגר lysis SDS עם קוקטייל מעכב פרוטאז (שלב 3.3.6.3) אל הכדור. תוסתו מחדש את הכדור ותדגירה על קרח במשך 10 דקות.
14. אחסן את דגימות הכרומטין ב- -80 °C עד לשלב 3.4.1 או המשך מיד לשלב 3.4.
sonication DNA
1. להעביר 130 μL של כרומטין מדגימת DMSO (שלב 3.3.14) לשני צינורות sonication DNA באמצעות פיפטה (130 μL כל אחד).
2. להעביר 130 μL של כרומטין מדגימת A-485 (שלב 3.3.14) לשני צינורות sonication DNA באמצעות פיפטה (130 μL כל אחד).
3. Sonicate את ה-DNA בערך 150-200 שברי זוג בסיס באמצעות הגדרות sonicator הבאות: שיא אירוע כוח (W) של 175, מקדם חובה של 10%, 200 מחזורים לכל פרץ ו 430 s זמן טיפול.
  הערה: הגדרות Sonication עשויות להיות שונות בין מודלים והגדרות ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להשיג גודל שבר מתאים עבור קווי תא שונים.
4. שמור דגימות על קרח לאחר sonication.
5. להעביר את הכרומטין sonicated לצינור 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה וצנטריפוגה ב 10,000 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי פסולת כדורית.
6. פיפט הסופרנטנט (מכיל כרומטין sonicated) לצינור חדש ולזרוק את ההריסות. כרומטין Sonicated ניתן לאחסן ב -80 °C.
פירוק כרומטין (ChIP)
הערה: ראה פרוטוקול משלים (סכמטי 3) לקבלת תרשים של קבוצות IP בשלב 3.5.
1. למדוד את תכולת החלבון של כרומטין sonicated עבור DMSO ו- A-485 דגימות מ שלב 3.4.6. ניתן למדוד תכולת חלבון באמצעות פרוטוקולים מבוססים^{היטב 34}.
  הערה: עבור פשטות, פרוטוקול זה יניח תוכן חלבון שווה 100 μL של כרומטין sonicated ישמש. אחרת, תוכן חלבון יצטרך להיות שווה בין כל הדגימות בנפח שווה.
2. פיפטה 100 μL של DMSO sonicated כרומטין לשני צינורות 1.5 מ"ל (100 μL כל אחד). פיפטה 400 μL של מאגר דילול ChIP (המכיל 1:1,000 דילול של קוקטייל מעכב פרוטאז) לכל צינור כדי להביא נפח כולל עד 500 μL. להסיר 5 μL של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן ב -20 °C כמו קלט DMSO.
3. פיפטה 100 μL של A-485 sonicated כרומטין לשני צינורות 1.5 מ"ל (100 μL כל אחד). פיפטה 400 μL של מאגר דילול ChIP (המכיל דילול 1:1000 של קוקטייל מעכב פרוטאז) לכל שפופרת כדי להביא נפח כולל עד 500 μL. להסיר 5 μL של הפתרון מאחד הצינורות ולאחסן ב -20 ° C כמו קלט A-485.
4. באמצעות פיפטה, הוסף את נוגדן immunoprecipitation (IP) (למשל בקרת IgG לא ספציפית או נוגדן ספציפי H3K27ac) לצינורות המתאימים עבור DMSO ו- A-485 דגימות: IP #1 כרומטין DMSO עם נוגדן IgG (5-10 μg); IP #2 כרומטין DMSO עם נוגדן H3K27ac (5-10 μg); IP #3 כרומטין A-485 עם נוגדן IgG (5-10 μg); IP #4 כרומטין A-485 עם נוגדן H3K27ac (5-10 μg).
5. להוסיף 20 μL של חלבון חרוזים מגנטיים לכל צינור. ודא שהחרוזים הם גם מחדש.
6. סובב את הדגימות למשך הלילה ב- 4 °C.
7. גלול את החלבון חרוזים מגנטיים באמצעות מפריד מגנטי ולהסיר את supernatant. נא לא להפריע לחרוזים.
8. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר שטיפת המלח הנמוך ומסתובבים במשך 5 דקות ב-4°C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
9. שוטפים את החרוזים עם 500 μL עד 1 מ"ל של מאגר שטיפת מלח גבוה ולסובב במשך 5 דקות ב 4 ° C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
10. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר השטיפה LiCl ומסתובבים במשך 5 דקות ב-4°C. לבצע ספין מהיר למטה, גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי, ולהסיר את supernatant.
11. שוטפים את החרוזים ב-500 μL עד 1 מ"ל של מאגר TE וסובבו במשך 5 דקות ב-4°C. בצע ספין-למטה מהיר. שמור את החרוזים במאגר TE עד לשלב 3.5.14.
12. הסר דגימות קלט (מ- 3.5.2 ו- 3.5.3) מהמקפיא והמשיך על הקרח.
13. הפשיר את הליקוט של חלבון K.
14. גלול את החרוזים באמצעות מפריד מגנטי והסר את מאגר TE מהחרוזים (מ- 3.5.11).
15. הוסף 100 μL ChIP חוצץ אלגנטיות + 1 μL של Proteinase K לכל דגימה, כולל דגימות קלט. דגימות דגירה עם טלטול ב 62 ° C עבור 2 שעות באמצעות תרמוצ'יקלר.
16. לאחר 2 שעות, דגימות חום 95 °C במשך 10 דקות באמצעות תרמוצ'יקלר.
17. מצננים את הדגימות לטמפרטורת החדר.
18. חרוזים מגנטיים כדוריים באמצעות מפריד מגנטי ולהעביר supernatant (מכיל את ה-DNA של עניין) צינור חדש 1.5 מ"ל.
19. טהר את הדנ"א באמצעות ערכת ניקוי PCR סטנדרטית.
20. ניתן לאחסן את ה-DNA המטוהר ב-20°C ותו לא להשתמש בו כתבנית בפרוטוקולי qPCR סטנדרטיים. פעל בהתאם לפרוטוקולי היצרן עבור הפעלת qPCR.
ניתוח נתוני ChIP-qPCR
הערה: שתי שיטות נפוצות לניתוח תוצאות ChIP-qPCR הן העשרה קיפול מעל נוגדן IgG ושיטת הקלט 1% . תבנית מצוינת עבור שתי שיטות הניתוח מסופקת על ידי מקור מסחרי יכול לשמש כדי לחשב במהירות העשרה קיפול עבור כל נוגדן IP / יעד של^{עניין 37}.
1. כדי לחשב העשרה קיפול וקלט % , העתק והדבק את ערכי ThCt מנתוני qPCR שהתקבלו עבור כל נוגדן (IgG לא ספציפי, נוגדן IP H3K27ac וקלט 1% ) לאזור המתאים בתבנית הניתוח והעשרה מתקפלת ו- Yield % קלט יאוכלסו באופן אוטומטי.

תוצאות

במבחנה היסטון אצטילטרנספראז (HAT) assay יכול לשמש כדי לבדוק עבור תרכובות לעכב את פעילות p300 HAT לכיוון היסטון. איור 1A מספק תרשים ניסיוני עבור תרשים HAT. חומצה אנאקרדית, HATi^{ידוע 3}^,³⁸, היה מנוצל בהסכם זה בטווח ריכוז של 12.5-100 μM. ב 100 μM, חומצה אנאקרדית downregulates ...

Discussion

לייסין אצטילtransferases (KATs) אצטילאט כמה שאריות ליאזין על זנבות histone ותמלול גורמים לווסת^{שעתוק גנים 2,}^,³. עבודה בשני העשורים האחרונים חשפה כי KATs, כגון CBP/p300, PCAF ו GCN5, אינטראקציה עם גורמי שעתוק oncogenic ולעזור להניע גידולים במספר סוגי^{גידול מוצק 4}^,

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים או גילויים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ג'יימס ואסתר קינג תוכנית מחקר ביו רפואי (6JK03 ו 20K07), ו Bankhead-Coley סרטן תוכנית מחקר (4BF02 ו 6BC03), פלורידה מחלקת הבריאות, פלורידה סרטן השד הקרן, ו UF בריאות סרטן מרכז. בנוסף, ברצוננו להודות לד"ר זכריה אוסקינג וד"ר אנדריאה לין על תמיכתם במהלך תהליך הפרסום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2

References

Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162 KATs CBP p300

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: