אפיון של מאפייני תחבורה תוך סחוס של ספקי פפטיד צ'ציה

Summary

פרוטוקול זה קובע ספיגת שיווי משקל, עומק חדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל עבור נשאי פפטיד cationic בסחוס. אפיון של מאפייני תחבורה הוא קריטי להבטחת תגובה ביולוגית יעילה. שיטות אלה ניתן להחיל על עיצוב נושאות סמים טעונות בצורה אופטימלית עבור מיקוד רקמות טעונות שלילית.

Abstract

מספר רקמות טעונות שלילית בגוף, כמו סחוס, להציג מחסום לאספקת סמים ממוקדת בשל הצפיפות הגבוהה שלהם של aggrecans טעונים שלילית, ולכן, דורשים שיטות פילוח משופרות כדי להגדיל את התגובה הטיפולית שלהם. בגלל סחוס יש צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה, תרופות ניתן לשנות עם נשאי סמים טעונים חיובית כדי לנצל אינטראקציות אלקטרוסטטיות, המאפשר תחבורה משופרת תוך סחוס סמים. לימוד ההובלה של נושאות סמים הוא, אם כן, חיוני לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה ביולוגית. אנו מראים את העיצוב של שלושה ניסויים אשר יכול לכמת את ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של נשאי פפטיד cationic בהסברי סחוס. ניסויי ספיגת שיווי משקל מספקים מדד של ריכוז הבדידות בתוך הסחוס בהשוואה לאמבטיה שמסביבה, אשר שימושי לחיזוי הפוטנציאל של נשא סמים בשיפור הריכוז הטיפולי של תרופות בסחוס. עומק מחקרי החדירה באמצעות מיקרוסקופית confocal לאפשר ייצוג חזותי של דיפוזיה 1D solute מן האזור שטחי עד עמוק של סחוס, אשר חשוב להעריך אם solutes להגיע מטריצה שלהם ואתרי היעד הסלולרי. מחקרי שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל באמצעות תא הובלה מותאם אישית מאפשר מדידה של חוזק של אינטראקציות מחייבות עם מטריצת הרקמה על ידי אפיון שיעורי דיפוזיה של solutes פלואורסצנטי על פני הרקמה; זה מועיל לעיצוב נשאים של כוח מחייב אופטימלי עם סחוס. יחד, התוצאות שהתקבלו משלושת ניסויי התחבורה מספקות קו מנחה לעיצוב נושאות תרופות טעונות בצורה אופטימלית המנצלות אינטראקציות טעינה חלשות והפיות עבור יישומים לאספקת תרופות. שיטות ניסיוניות אלה ניתן ליישם גם כדי להעריך את ההובלה של תרופות ותרופות סמים התייחדות. יתר על כן, שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקוד רקמות טעונות שלילית אחרים כגון מניסקוס, קרנית ואת ההומור זגוגית.

Introduction

משלוח סמים לרקמות טעונות שלילית בגוף נשאר אתגר בשל חוסר היכולת של תרופות לחדור עמוק לתוך הרקמה כדי להגיע לאתרי היעד תא^{מטריקס 1}. חלק מרקמות אלה כוללות אגרקנים צפופים, טעונים בשלילה אשר יוצרים צפיפות תשלום קבועה שלילית גבוהה (FCD)^{2 בתוך} הרקמה ולפעול כמחסום למסירה של רוב מקרומולקולות^3,,4. עם זאת, בסיוע של נושאות סמים טעונות חיובית, מחסום רקמות זה טעון שלילית למעשה ניתן להמיר למחסן סמים באמצעות אינטראקציות תשלום אלקטרוסטטי עבור משלוח סמים^{ממושך 1,,5,,6,7}(איור 1).

איור 1: תשלום משלוח מבוסס תוך סחוס של CPCs. הזרקה תוך-מפרקים של CPCs לחלל מפרק הברך. אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין CPCs טעונים חיובית וקבוצות aggrecan טעונות שלילית לאפשר חדירה מהירה ועומק מלא באמצעות סחוס. נתון זה שונה מ- Vedadghavami et al⁴. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחרונה, ספקי פפטיד cationic באורך קצר (CPCs) תוכננו במטרה ליצור תחומים cationic קטנים מסוגל לשאת טיפולים גדולים יותר בגודל למסירה סחוס^{טעון שלילית 4}. עבור משלוח תרופות יעיל לסחוס לטיפול^{נפוץ 8,9 ומחלות}ניווניות כגון דלקת מפרקים ניוונית (OA)^10,זה קריטי כי ריכוזים טיפוליים של תרופות לחדור עמוק בתוך הרקמה, שם רוב תאי הסחוס (chondrocytes)^{לשקר 11}. למרות שיש מספר מחלות פוטנציאליות שינוי תרופות זמינות, אף אחד לא קיבל אישור ה-FDA כי אלה אינם מסוגלים למקד ביעילות את הסחוס^12,13. לכן, הערכה של מאפייני התחבורה של נושאות סמים היא הכרחית לחיזוי היעילות של תרופות בגימת תגובה טיפולית. כאן, עיצבנו שלושה ניסויים נפרדים שניתן לנצל להערכת ספיגת שיווי המשקל, עומק החדירה וקצב דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs^4.

כדי להבטיח כי יש ריכוז תרופתי מספיק בתוך הסחוס שיכול לספק תגובה טיפולית אופטימלית, ניסויי ספיגה תוכננו לכמת שיווי משקל CPC ריכוז בסחוס⁴. בעיצוב זה, בעקבות שיווי משקל בין הסחוס לבין האמבטיה שמסביבו, ניתן לקבוע את הכמות הכוללת של הבדידות בתוך הסחוס (המאוגד למטריצה או בחינם) באמצעות יחס ספיגה. יחס זה מחושב על ידי נרמול הריכוז של solutes בתוך הסחוס לזה של אמבט שיווי המשקל. באופן עקרוני, solutes נייטרלי, אשר דיפוזיה דרך הסחוס אינו נעזר על ידי אינטראקציות תשלום, יהיה יחס ספיגה של פחות מ 1. לעומת זאת, solutes cationic, אשר תחבורה משופרת באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות, להראות יחס ספיגה גדול מ 1. עם זאת, כפי שהראה עם CPCs, שימוש בטען חיובי אופטימלי יכול לגרום ליחס ספיגה גבוה בהרבה (גדול מ- 300)⁴.

למרות ריכוז גבוה של סמים בתוך הסחוס חשוב להשגת תועלת טיפולית, זה גם קריטי כי תרופות לפזר דרך העובי המלא של הסחוס. לכן, מחקרים המראים את עומק החדירה נדרשים כדי להבטיח כי תרופות להגיע עמוק בתוך הסחוס, כך מטריקס ואתרי היעד הסלולרי ניתן להגיע, ובכך לספק טיפול יעיל יותר. ניסוי זה נועד להעריך את דיפוזיה חד-דרךית של solutes באמצעות סחוס, המדמה דיפוזיה של תרופות לתוך סחוס בעקבות הזרקת תוך-מתוך-פרקים ב vivo. הדמיית פלואורסץ באמצעות מיקרוסקופית confocal מאפשרת הערכה של עומק חדירה לתוך סחוס. טעינת חלקיק נטו ממלאת תפקיד מרכזי במתינות האופן שבו סמים עמוקים יכולים לפזר דרך המטריצה. טעינה נטו אופטימלית המבוססת על FCD רקמה נדרש כדי לאפשר אינטראקציות מחייבות הפיך חלש בין חלקיקים cationic מטריצת רקמות אניון. משמעות הדבר היא כי כל אינטראקציה היא חלשה מספיק, כך חלקיקים יכולים להתנתק מהמטריקס אבל הפיך בטבע, כך שהוא יכול להיקשר לאתר אחר מחייב מטריקס עמוק יותר^{בתוך הרקמה 4.} לעומת זאת, תשלום נטו חיובי מוגזם של חלקיק יכול להיות מזיק כלפי דיפוזיה, כמו איגוד מטריצה חזק מדי מונע ניתוק של חלקיקים מאתר האיגוד הראשוני באזור שטחי של סחוס. כתוצאה מכך תגובה ביולוגית לא מספקת כמו רוב אתרי היעד לשקר עמוק בתוך הרקמה^11.

כדי לכמת עוד יותר את הכוח של אינטראקציות מחייבות, ניתוח של שיעורי דיפוזיה סמים באמצעות סחוס הוא יתרון. מחקרי דיפוזיה ללא שיווי משקל מאפשרים השוואה של שיעורי דיפוזיה בזמן אמת בין solutes שונים. כמו סמים מפוזרים דרך שטחי, אמצע ועמוק אזורים של סחוס, הנוכחות של אינטראקציות מחייבות יכול לשנות מאוד את שיעורי דיפוזיה. כאשר קיימות אינטראקציות מחייבות בין תרופות למטריצת הסחוס, היא מוגדרת כדיספוסיביות יעילה (D_EFF). במקרה זה, לאחר שכל האתרים המחייבים נכבשו, שיעור דיפוזיה של תרופות נשלט על ידי דיפוזיה מצב יציב (D_SS). השוואה בין D_EFF של solute שונה קובעת את עוצמת האיגוד היחסי של solutes עם המטריצה. עבור solute נתון, אם D_{EFF ו-} D_SS הם באותו סדר גודל, זה מרמז כי יש כריכה מינימלית נוכח בין התרופה למטריצה במהלך דיפוזיה. עם זאת, אם D_EFF גדול מ- D_SS, קיים איגוד משמעותי של חלקיקים למטריקס.

הניסויים שתוכננו מאפשרים בנפרד אפיון של הובלה סולט באמצעות הסחוס, עם זאת, ניתוח הוליסטי הכולל את כל התוצאות נדרש לעיצוב נשא סמים טעון בצורה אופטימלית. האופי החלש וההפיך של אינטראקציות טעינה שולט בקצב דיפוזיה חלקיקים ומאפשר ספיגת שיווי משקל גבוהה וחדירה מהירה לעומק מלא באמצעות סחוס. באמצעות ניסויי ספיגת שיווי משקל, עלינו לחפש נשאים שמופעי ספיגה גבוהה כתוצאה מאינטראקציות טעינה שניתן לאמת באמצעות מחקרים ללא שיווי משקל קצב דיפוזיה. עם זאת, אינטראקציות מחייבות אלה צריכות להיות חלשות הפיכות בטבע כדי לאפשר חדירה בעובי מלא של הבדידות באמצעות סחוס. מוביל סמים אידיאלי יהיה בעל תשלום אופטימלי המאפשר חזק מספיק מחייב לספיגה וריכוזי סמים תוך סחוס גבוה, אבל לא חזק מדי כדי לסתר דיפוזיה^{בעובי מלא 4.} הניסויים שהוצגו יסייעו במאפייני העיצוב של רקמה מבוססת תשלום המתמקדת בנשאי סמים. פרוטוקולים אלה שימשו לאפיון הובלת CPC באמצעות סחוס^4,עם זאת, אלה יכולים להיות מיושמים גם על מגוון רחב של תרופות ונשאים סמים באמצעות סחוס ורקמות טעונות שלילית אחרים.

Protocol

אישורים באוניברסיטה הושגו לביצוע הניסויים עם רקמות מתות. מפרקים של בקרים הושגו מסחרית מבית מטבחיים.

1. חילוץ הסבר סחוס

1. באמצעות אזמל (#10), לחתוך ולהסיר שומן, שרירים, רצועות, גידים וכל רקמת חיבור אחרים כדי לחשוף את הסחוס מן גרוב הירך של מפרקים הברך בקר.
2. בעזרת אגרופים עוריים של 3 מ"מ ו-6 מ"מ, הפוך אגרופים בניצב לתוך הסחוס כדי לחלץ תקעים גליליים. מיד למקם את התקעים בארות בודדות של צלחת 48-באר המכילה 500 μL של 1x פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS) בתוספת 1% v / v אנטיביוטי אנטיביוטי אנטיביוטי.
3. מניחים את הצד שטחי של תקע סחוס פונה כלפי מטה לתוך באר במתקן חיתוך(איור 2). באמצעות סכין גילוח, חותכים את התקע לאורך פני השטח של מתקן החיתוך כדי להשיג סחוס בעובי 1 מ"מ הכולל את האזור השטחי. חזור על הפעולה עבור כל תקע סחוס.
4. לאחסן extilage experts בנפרד בצינורות פוליפרופילן המכיל 500 μL של 1x PBS בתוספת עם מעכבי פרוטאז (PBS-PI, 1 PI מיני לוח לכל 50 מ"ל 1x PBS) ב -20 °C.
5. לפני ביצוע כל אחד מניסוואת התחבורה הבאה, להפשיר את הבקבוקונים המכילים את ההסבר במשך 30 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.

איור 2: מתקן חיתוך מותאם אישית. פרמטרי עיצוב של מתקן חיתוך נירוסטה המשמש לחיתוך extilage explants של 3 ו 6 מ"מ קוטר. תוספות פלסטיק בעובי שונה הונחו בתוך בארות כדי להתאים את עובי ההסברים הפרוסים. פין גלילי נירוסטה של <1 מ"מ קוטר שימש לדחוף explant מתוך מתקן. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. ספיגת שיווי משקל של CPCs בסחוס

1. בעדינות לטבול explants סחוס (3 מ"מ dia. X 1 מ"מ עבה.) עם מחיקת משימה עדינה כדי להסיר PBS 1x עודף מפני השטח explant. באמצעות איזון, במהירות להקליט את המשקל הרטוב של כל explant ולאחר מכן מיד למקם באמבט PBS 1x כדי למנוע התייבשות.
2. הכן פתרונות μM של 30 μM (300 μL לכל הסבר) של CPCs המסויגים בנתון פלורסנט ב- PBS-PI אחד. השתמש בצינורות פוליפרופילן ללא RNase לצורך איסוף מחדש.
3. בצלחת 96-באר, פיפטה 300 μL של כל 30 μM CPC פתרון לתוך בארות נפרדות. הימנע משימוש בארות ליד קצה הצלחת כדי למנוע אידוי. באמצעות מרית, להעביר כל explant לפתרון המכיל בארות.
4. ממלאים את בארות הסובבות ב-300 μL של PBS אחד ומכסים את צלחת הבאר במכסה. אטמו את קצות הצלחת עם סרט גמיש כדי למזער את האידוי.
5. בתוך אינקובטור 37 °C, מניחים את הצלחת על שייקר צלחת כדי להגביל את משקע החלקיקים. דגירה במשך 24 שעות תחת סיבוב עדין (50 סל"ד עם מסלול של 15 מ"מ) כדי לאפשר ספיגת שיווי משקל של CPCsבסחוס (איור 3).
6. צור עקומה סטנדרטית עבור מתאם של פלואורסנס ריכוז CPC
   1. הכן דילול סדרתי של פתרונות CPC מ- 30 μM – 0 μM (10 דילול כפול כפול) ב- PBS-PI אחד בצינורות פוליפרופילן. ודא כי לפחות 500 μL של כל דילול קיים.
   2. להוסיף 200 μL של כל דילול בארות רצופות בצלחת שחור 96-באר. שכפול בשורה אחרת כדי להגדיל את גודל המדגם.
   3. השג קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם באמצעות קורא לוחות באורכי הגל של העירור והפליטה של תווית הפלורסנט באמצעות קורא לוחות.
   4. קריאת פלואורסנצט של העלילה לעומת ריכוז CPC והפיק משוואה עבור החלק ליניארי של העקומה.
      הערה: כדי להגביל את השונות בקריאות פלואורסצנטיות, דגירה פתרון המניות CPC באותם תנאים כמו לוח המדגם לפני יצירת העקומה הסטנדרטית.
7. לאחר 24 שעות של דגירה, לאסוף את אמבט שיווי המשקל מכל באר בצינורות פוליפרופילן נפרדים.
8. להעביר 200 μL של כל פתרון לתוך בארות נפרדות של צלחת 96-באר שחור. השג קריאות פלואורסצנטיות של כל מדגם תחת אותן הגדרות פלורסנט כמו עבור העקומה הסטנדרטית. במידת הצורך, תדלל את הדגימה ב- PBS-PI אחד כדי להבטיח שהקריאות ייפלו בחלק הליניארי של העקומה הסטנדרטית.

איור 3: סכמטי של ניסויי ספיגת שיווי משקל. Extilage explants (3 מ"מ dia. x 1 מ"מ עבה) הונחו בארות יחידים בצלחת 96-באר המכיל פתרון CPC מתויג פלורסנט. לאחר 24 שעות CPCs נכבשו על ידי הסחוס, ובכך להפחית את הפלואורסצסצנציה של האמבטיה שמסביב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

3. עומק החדירה של CPCs בסחוס

1. הכן פתרונות μM של 30 μM (300 μL לכל הסבר) של CPCs המסויגים בנתון פלורסנט ב- PBS-PI אחד. השתמש בצינורות פוליפרופילן ללא RNase לצורך איסוף מחדש.
2. באמצעות אזמל, פרוסות סחוס לחתוך (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) במחצית כדי להפוך חצי דיסקים. שמור את ההסבר לח עם שכבה של PBS-PI 1 תוך כדי חיתוך.
3. הדבקת חצי דיסק לאמצע באר אחת של תא תעבורה חד-ממדי שתוכנן בהתאמה אישית באמצעות אפוקסי(איור 4, איור 5). ודא אפוקסי מוחל על הצד ההיקף (מעוקל) של explant. הסר דבק עודף מהבאר כדי למנוע מגע עם שטח פני השטח של הסחוס וציין את הצד השטחי של ההסבר.
4. הוסף 80 μL של 1x PBS-PI לשני צידי ההסבר. פיפטה הנוזל למעלה ולרדת מצד אחד של explant כדי לבדוק דליפה לצד השני. אם מתרחשת דליפה, תקן מחדש את השתל ולהחיל אפוקסי במידת הצורך.
5. החלף את ה-PBS-PI 1 מהצד הפונה למשטח השטחי של הסחוס (במעלה הזרם) בפתרון CPC של 80 μL של 30 μM. לשמור על 80 μL של 1x PBS-PI בצד מול האזור העמוק של סחוס (במורד הזרם).
6. מקם בזהירות את תא ההובלה במיכל סודי. כסה את בסיס המכל בשכבה 1x PBS כדי למנוע אידוי פתרונות. ודא שאין קשר ישיר בין פתרונות מתאי במעלה הזרם ובמורד הזרם.
7. מניחים את המיכל המכוסה על שייקר צלחת כדי להגביל את מום החלקיקים. דגירה עבור 4 או 24 שעות בטמפרטורת החדר תחת סיבוב עדין (50 סל"ד עם מסלול 15 מ"מ).
8. לאחר הדגירה, הסר את ההסבר מהתא וחתכו כ-100 μm פרוסה ממרכז ההסבר.
   הערה: חתך רוחב זה כולל את האזורים שטחיים, בינוניים ועמוקים של סחוס.
9. מניחים את הפרוסה בין מגלשת זכוכית לתסם מכסה. מורטים את הפרוסה בשכבה של PBS-PI 1.
10. בהגדלה של פי 10, תמונה דרך העובי המלא של הפרוסה כדי להשיג z-stack של תמונות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ confocal.
11. שימוש ב- ImageJ מקרין את העוצמה הממוצעת של התמונות בתוך z-stack כדי לקבוע את עומק החדירה של CPCs בסחוס.
    1. פתח את מחסנית התמונה על-ידי לחיצה על קובץ | פתח את .
    2. לחץ על 'תמונה' בשורת המשימות ולחץ על תמונה | ערימות | Z Project מהתפריט הנפתח.
    3. מספרי פרוסת קלט מ- 1 לפרוסה הסופית. בחר 'עוצמה ממוצעת' תחת סוג הקרנה. לחץ על'אישור.'

איור 4: תא הובלה דו-מיו-ד שתוכנן בהתאמה אישית. פרמטרי עיצוב של תא תעבורה 1D PMMA עם 6 בארות בודדות. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: סכמטי של עומק מחקרי חדירה. Explants סחוס (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) נחתכו לשניים קבוע למרכז של בארות תחבורה 1-D מפוזר. פתרון CPC מתויג פלורסנטית נוספה לצד הבאר במגע עם האזור שטחי (SZ) של סחוס. 1x PBS-PI נוספה לצד הבאר במגע עם האזור העמוק (DZ) של סחוס. לאחר דיפוזיה, חתך רוחב של סחוס (3 מ"מ x 1 מ"מ) צולם באמצעות מיקרוסקופית confocal. נתון זה שונה מ Vedadghavami ואח^{'. 3}Please click here to view a larger version of this figure.

4. שיעור דיפוזיה ללא שיווי משקל של CPCs בסחוס

1. הביאו את שני החצאים של תא ההובלה המעוצב בהתאמה אישית (איור 6) יחד כדי להרכיב ולסגור את התא. השתמשו בדושות, אגוזים וברגים כדי לסגור בחוזקה את התא עם מפתח ברגים.
   הערה: תא התובלה חייב להיות שקוף כדי לא להפריע לקריאות פלורסנט. תאי התעבורה המשמשים בפרוטוקול זה עשויים מפולימתילמטצ'רילט (PMMA).
2. ציפוי החלל הפנימי של התא עם 0.5% w / v חלב בשר לא שומן תמיסה 1x PBS (2 מ"ל עבור כל תא) במשך 15 דקות כדי למנוע איגוד לא ספציפי של CPCs לקירות תא. לאחר מכן לשטוף את התא עם 1x PBS (2 מ"ל עבור כל תא).
3. באמצעות מתקן חיתוך מותאם אישית(איור 2) וסכין גילוח,חותכים את פרוסת סחוס בקוטר 6 מ"מ (מישור רוחבי) לעובי של 500-800 μm, כולל האזור שטחי. שמור את ההסבר לח עם PBS 1x.
4. בעזרת אגרופים מונעי פטיש ובדרמליים, צור אטמים מדפי גומי כפי שפוקד באות 7.
5. להרכיב כל תא תובלה חצי לכלול 1 אטם גומי גדול, 1 PMMA להוסיף 1 אטם גומי קטן כל אחד. מקם את ההסבר בארות של תוסף הפלסטיק, כאשר האזור שטחי פונה לתא במעלה הזרם. כריך שני חצאים יחד כדי להשלים את ההרכבה בורג בחוזקה באמצעות מפתח ברגים(איור 7).
6. מלא את התא במעלה הזרם עם 2 מ"ל של 1x PBS-PI ולצפות בתא במורד הזרם לדליפת נוזלים מהתא במעלה הזרם. אם קיימת דליפה, תכינו מחדש את התא, כוונו את תמומת האטם ואת הלחץ של הברגים. אם אין דליפה, למלא את התא במורד הזרם עם 2 mL 1x PBS-PI גם כן.
7. מוסיפים מיני-מערבבים לתאים במעלה ובמורד הזרם ומנום את התא על צלחת ערבוב. יישר את התא כך שהלייזר מהספקטרופוטומטר יתמקד לכיוון מרכז התא במורד הזרם. מקם את חלק מקלט האות של ספקטרופוטומטר מאחורי התא במורד הזרם(איור 8).
   הערה: הלייזר והמקלט של ספקטרופוטומטר חייבים להיות מצוידים במסננים המתאימים כדי לרגש, לפלוט ולשדר אותות מהחלבון המסומן בפלורסנט. הגן על תא ההובלה מפני אור באמצעות קופסה שחורה במהלך ניסויים כדי למנוע הפרעה באות פלואורסנטי. עדיף לאטום את הפתחים על גבי החדר עם סרט גמיש כדי למנוע אידוי.
8. אסוף קריאות פליטת פלואורסץ בזמן אמת במורד הזרם והבטח אות יציב למשך 5 דקות לפחות.
   הערה: ניתן להשיג את Aliquots מהתא במורד הזרם ולהעריך פלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות אם ספקטרופוטומטר או תא הובלה שקוף בהתאמה אישית אינו זמין.
9. פיפטה נפח מחושב מראש של תמיסת מניות של CPCs מתויג פלורסנטית לתוך התא במעלה הזרם כדי להבטיח ריכוז סופי של 3 μM בתוך התא במעלה הזרם. שים לב לאות הפלואורסצנס במורד הזרם ואפשר לתחבורה סוליה להגיע לעלייה מתמדת במדרון.
   הערה: הסבר סחוס עבה יותר ידרוש זמן רב יותר כדי להגיע למצב יציב.
10. לאחר שהגענו למצב יציב, לקחת 20 μL מהתא במעלה הזרם ולהוסיף לתא במורד הזרם ("מבחן ספייק").
    הערה: תיבחן עלייה חדה בפלואורסץ במורד הזרם. זה יאפשר מתאם בין קריאות פלורסנס וריכוז CPC.
11. אסוף קריאות פלואורססence בזמן אמת במורד הזרם.

איור 6: תא הובלה לא שיווי משקל שתוכנן בהתאמה אישית. פרמטרי עיצוב של תא תעבורה לא שיווי משקל PMMA. על התא להיות שקוף כדי לא להפריע לקריאות פלואורסצנטיות. תא התובלה המלא כלל שני חצאים זהים של המתקן המוצג. שני סיכות גליליות מפלדת אל-חלד (קוטר של כ-2.94 מ"מ, כ-18 מ"מ) נדרשו כדי להבטיח יישור וסגירה מלאה של חצאי התא. ארבעה חריצים זהים עבור ברגי חוט 6-32 נעשו בכל פינה של התא עבור מכלול בורג הדוק. כל הערכים המספריים מוצגים במילימטרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 7: הרכבה של תא הובלה לא שיווי משקל. פרמטרי עיצוב של (A) PMMA שחור מוסיף ו - (ב) אטמי גומי גדולים וקטנים. עובי אטמי גומי הותאם כדי להבטיח סגירה הדוקה של התא. כל הערכים המספריים מוצגים במ"מ.(ג)סכמטי המציג את סדר ההרכבה עבור שני חצאים של תא הובלה עם הסבר סחוס ממוקם במרכז. SZ מצביע על אזור שטחי של סחוס שהיה מול התא במעלה הזרם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 8: סכמטי של ניסויי דיפוזיה ללא שיווי משקל. תפוצת סחוס (6 מ"מ קוטר x 1 מ"מ עובי) הונחו במרכז תא התחבורה עם פני השטח השטחי מול התא במעלה הזרם. שני צידי המעלה והמורד של התא היו מלאים ב-PBS-PI אחד ומעורבבים באמצעות מיני בר. עם לייזר מכוון לכיוון התא במורד הזרם כדי לאסוף קריאות פלורסנט, פתרון CPC מתויג פלורסנט נוסף לתא במעלה הזרם. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות

לאחר ספיגת שיווי המשקל של CPCs על ידי סחוס, פלואורסצסצנציה אמבטיה פוחתת כאשר solute כבר נכבש על ידי הרקמה. עם זאת, אם ערך הפלואורסצנס של האמבטיה הסופית נשאר דומה להתחלה, הוא מציין כי אין / ספיגת solute מינימלית. אישור נוסף של ספיגת solute הוא אם הרקמה שינתה באופן ניכר צבע לצבע של צבע פלורסנט. הספיגה הכמו...

Discussion

השיטות והפרוטוקולים המתוארים כאן משמעותיים לתחום של אספקת סמים ממוקדת לרקמות טעונות באופן שלילי. בשל הצפיפות הגבוהה של aggrecans טעונים שלילית נוכח ברקמות אלה, נוצר מחסום, ובכך למנוע תרופות מלהגיע לאתרי היעד הסלולרי שלהם אשר נמצאים עמוק בתוך המטריצה. כדי להתמודד עם האתגר הבולט הזה, ניתן לשנות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18x18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7x2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long