צינור באמצעות אלקטרופורציה דו-צדדית ברחם כדי לחקור השפעות גנטיות על התנהגות מכרסמים

Summary

התפקיד של גנים הקשורים למחלות שהתגלו לאחרונה בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות נשאר מעורפל. דו-צדדי שונה בטכניקת אלקטרופורציה ברחם מאפשר העברת גנים באוכלוסיות גדולות של נוירונים ובחינת ההשפעות הסיבתיות של שינויים בביטוי גנים על ההתנהגות החברתית.

Abstract

כמו מחקרי עמותה הגנום כולו לשפוך אור על היסודות הגנטיים הטרוגניים של מחלות נוירולוגיות רבות, הצורך לחקור את תרומתם של גנים ספציפיים להתפתחות המוח ותפקוד עולה. הסתמכות על מודלים של עכבר כדי ללמוד את התפקיד של מניפולציות גנטיות ספציפיות לא תמיד ריאלי מאז קווי עכבר מהונדסים הם יקרים למדי גנים רבים הקשורים למחלות חדשניות עדיין אין קווים גנטיים זמינים מסחרית. בנוסף, ייתכן שידרשו שנים של פיתוח ואימות כדי ליצור קו עכבר. ב electroporation הרחם מציע שיטה מהירה יחסית וקלה לתפעל ביטוי גנים באופן ספציפי סוג התא vivo כי רק דורש פיתוח פלסמיד DNA כדי להשיג מניפולציה גנטית מסוימת. ניתן להשתמש באל-דו-צדדי באלקטרופורציה של הרחם כדי למקד אוכלוסיות גדולות של נוירונים פירמידליים בקליפת המוח הקדמית. שילוב שיטת העברת גנים זו עם גישות התנהגותיות מאפשר לחקור את ההשפעות של מניפולציות גנטיות על תפקודן של רשתות קליפת המוח הקדם-מצחית ועל ההתנהגות החברתית של עכברים צעירים ומבוגרים.

Introduction

מחקרי עמותה גנומית (GWAS) הובילו לגילוי גנים מועמדים חדשניים הקשורים לפתולוגיות במוח^1,2,3,4. מחקרים אלה היו מועילים במיוחד בהבנת הפרעות נוירופסיכיאטריות הרסניות כגון סכיזופרניה (SCZ), שם חקירת גנים חדשניים שימשה כנקודת השקה עבור קווים חדשים של מחקר והתערבות טיפולית^5,6. גנים המעניקים סיכון ל- SCZ מראים ביטוי מוטה בקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) במהלך התפתחות טרום לידתית ותחילת הלידה, אזור מעורב בפתולוגיה של מספר הפרעות נוירופסיכיאטריות⁷. בנוסף, מודלים של עכבר של הפרעות פסיכיאטריות להפגין פעילות חריגה ברשתות PFC^6,8,9. תוצאות אלה מצביעות על כך שגנים הקשורים ל- SZC עשויים לשחק תפקיד בחיווט ההתפתחותי של אזור זה. חקירה נוספת באמצעות מודלים של בעלי חיים נדרשת כדי להבין את תרומתם של גנים מועמדים אלה להקמת קשרים ב- PFC ולקבוע אם לגנים אלה יש תפקיד סיבתי בפתוגנזה של הפרעות נוירופסיכיאטריות. טכניקות מניפולציה גנטית בעכברים המאפשרות חקר שינויים בביטוי גנים במעגלים עצביים ספציפיים במהלך התפתחות טרום לידתית ותחילת הלידה הן שיטה מבטיחה להבנת המנגנונים המולקולריים המקשרים בין שינויים בביטוי הגנים לתפקוד לקוי של PFC.

קווי עכבר גנטיים מציעים שיטה לחקור את ההשפעה של גנים מסוימים על התפתחות המוח ותפקודו. עם זאת, הסתמכות על עכברים מהונדסים יכולה להיות מגבילה שכן לא תמיד יש קווים זמינים מסחרית כדי לבחון את ההשפעות של גנים ספציפיים על פיתוח מעגלים עצביים. יתר על כן, זה יכול להיות יקר מאוד זמן רב לפתח קווי עכבר מותאמים אישית. השימוש באסטרטגיות מניפולציה גנטית מצטלבות המשלבות עכברים מהונדסים עם גישות ויראליות חולל מהפכה בהבנת המוח^10,11,12. למרות התקדמות רבה, אסטרטגיות ויראליות מגיעות עם מגבלות מסוימות בהתאם לסוג הווקטור הנגיפי, כולל מגבלות ביכולת האריזה שיכולות להגביל ביטוי ויראלי¹³ ורעילות תאים הקשורים לביטוי ויראלי¹⁴. יתר על כן, ברוב התנאים הניסיוניים, ביטוי גנים חזק באמצעות וירוס הקשורים אדנו (AAVs) דורש כ 2 עד 4 שבועות¹⁵, מה שהופך אסטרטגיות ויראליות שגרתיות בלתי אפשרי לתפעל גנים במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה.

ב electroporation הרחם (IUE) היא גישה חלופית המאפשרת העברת גנים מהירה וזולה^16,17 כי, בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי וגישות פרמקוגנטיות או אופטוגנטיות, מספק פלטפורמה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של מעגלים עצביים. בנוסף, עם התפתחות הגנום CRISPR-Cas9 עריכת גנים ניתן להגזים או לשנות במדויק באמצעות סוג התא ספציפי להפיל או לדפוק מתוך גנים ספציפיים או באמצעות אפנון של מקדמים^18,19. גישות מניפולציה גנים באמצעות IUE הם יתרון במיוחד כאשר ההשפעה של גנים על מעגלים עצביים צריך להיבדק במהלך חלונות התפתחותיים צרים²⁰. IUE היא טכניקה רב-תכליתית וניתן להשיג בקלות ביטוי יתר על-ידי החדרת גן לווקטור ביטוי תחת מקדם ספציפי. שליטה נוספת של ביטוי גנים יכולה להיות מושגת על ידי הנעת ביטוי באמצעות מקדמים של עוצמות שונות או באמצעות מקדמים בלתי ניתנים להכלה המסוגלים לשלוט זמנית ביטוי גנים^21,22. בנוסף, IUE מאפשר מיקוד של תאים בתוך שכבות קליפת המוח ספציפיות, סוגי תאים ואזורי מוח, אשר לא תמיד ריאלי באמצעות גישות אחרות^5,17. ההתקדמות האחרונה בתצורת IUE המבוססת על שימוש בשלוש אלקטרודות, המייצרת התפלגות יעילה יותר של שדה חשמלי, הרחיבה את הרפרטואר הפונקציונלי של שיטה זו ואיפשרה למדענים למקד סוגי תאים חדשים ולהגדיל את היעילות, הדיוק ומספר התאים שניתן להתמקד בהם^23,24. טכניקה זו שימשה לאחרונה כדי לקבוע את התפקיד הסיבתי של רכיב משלים 4A (C4A), גן המקושר SCZ, בפונקציה PFC וקוגניציה מוקדמת⁵.

להלן צינור ניסיוני המשלב גישות להעברת גנים כדי למקד אוכלוסיות גדולות של נוירונים מעוררים בקליפת המוח הקדמית, כולל ה- PFC, עם פרדיגמות התנהגותיות שלא רק מאפשרות לימוד שינויים ברמת התא והמעגל, אלא גם מאפשרות ניטור התנהגות לאורך ההתפתחות המוקדמת לאחר הלידה והבגרות. הראשון שתואר הוא שיטה ל transfect דו צדדי אוכלוסיות גדולות של שכבות (L) 2/3 נוירונים פירמידליים באזורים קליפת המוח הקדמית. לאחר מכן, משימות כדי לתחקר התנהגות חברתית בעכברים צעירים ומבוגרים מתוארים. ספירת תאים ניתן להשיג עם השלמת משימות התנהגותיות כדי לכמת את היקף ומיקום של transfection התא. יתר על כן, מספר התאים transfected יכול להיות בקורלציה עם נתונים התנהגותיים כדי לקבוע אם מספר גדול יותר של תאים transfected מוביל הפרעות גדולות יותר בהתנהגות.

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) למחקר בבעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת בוסטון (IACUC).

1. הכנת פתרון DNA

1. לרכוש פלסמיד מסחרי או subclone גן של עניין לתוך פלסמיד עם האמרגן הרצוי. כאן נעשה שימוש בפלסמיד המכיל EGFP תחת מקדם CAG (pCAG-EGFP).
   הערה: קבע את האמרגן הרצוי בהתבסס על רמת הביטוי הדרושה. באופן כללי, פלסמידים תחת מקדם CAG יכול לשמש כדי להשיג רמות גבוהות של transgene ואילו יחצנים ספציפיים סוג התא (למשל, סינפסין עבור נוירונים) נוטים להיות פחות פעילים. על הנסיין לקבוע באופן אמפירי את רמות הביטוי המתאימות לכל פלסמיד.
2. להפוך חיידקים ולגדל מניות במדיה חיידקית עם אנטיביוטיקה המתאימה.
   1. הסר תאים מוסמכים (תאי DH5α) מ -80 מעלות צלזיוס והפשר על קרח במשך 20 דקות.
   2. מערבבים 100 pg-100 ng של DNA פלסמיד עם 30 μL של תאים מוסמכים. דגירה את התערובת על קרח במשך 20 דקות.
   3. בצע הלם חום על ידי דגירה באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 45 s ולאחר מכן להחזיר את הצינור בחזרה לקרח במשך 2 דקות.
   4. הוסף 200 - 1,000 μL של מדיה LB לתאים המוסמכים שעברו המרה ולגדול במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס על אינקובטור רועד.
   5. צלחת 200 μL של התאים שהפכו לצלחת אגר LB המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה להדגיר את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
   6. למחרת, דגירה מושבת חיידקים אחת ב 200 מ"ל של מרק LB עם אנטיביוטיקה המתאימה ב 37 מעלות צלזיוס על אינקובטור רועד לילה.
3. לטהר את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת maxiprep.
   1. בצע את ההוראות המופיעות בערכת maxiprep שהתקבלה. לשלב elution, לא לשים DNA לתוך מאגר elution. במקום זאת, דנ"א elute באמצעות או 200 μL של סטרילי 1x PBS או מים ברמה מולקולרית.
   2. ודא כי הריכוז הסופי של ה- DNA גדול מ 1 מיקרוגרם / μL. אם הפלסמיד המכיל את גן העניין אינו מכיל גן כתב, אז גם להכין פלסמיד כדי להחדיר יחד עם מולקולת כתב, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי לאפשר הדמיה של תאים transfected.
4. הכן פתרון DNA לניתוח על ידי דילול ה- DNA פלסמיד לתוך 1x PBS ל 1 מיקרוגרם / μL הריכוז הסופי של כל פלסמיד. מוסיפים צבע ירוק מהיר לתמיסת הדנ"א לריכוז סופי של 0.1%. עבור זריקות דו צדדיות, להכין 60 μL של פתרון לכל סכר (עבור כ 10 גורים).
   הערה: אם פלסמיד אינו מכיל גן כתב, שיתוף electroporate עם GFP. שיעורי האלקטרופורציה המשותפת הם בדרך כלל 95% ומעלה. בידינו, יעילות ההחלקה לא הושפעה מהתעברות משותפת. כל פלסמידים electroporated צריך להיות מדולל ל 1 מיקרוגרם / μL.

2. הזמנה או רבייה של עכברים מתוזמן בהריון

1. אם אתם מזמינים עכברים בהריון מתוזמן, הזמינו עכברים להגיע ביום העוברי (ה) 13 או מוקדם יותר כדי לאפשר לסכרים זמן מתאים להסתגל לדיור בעלי חיים.  בפרוטוקול זה, עכברים גזעיים CD-1 משמשים לכל הניסויים.
   הערה: הזמנה של כמה ימים מראש תפחית את הלחץ של בעלי החיים ותוביל לשיעור הישרדות גבוה יותר של הגורים.
2. אם הרבייה עכברים מתוזמן בהריון, זוג עכברים נקבה עם זכר לילה, פעם בשבוע. בדוק אם יש תקע נרתיקי בבוקר שלמחרת (E0.5). לקבוע הריון על ידי ניטור המשקל של העכברים הנשיים.
   הערה: זנים שונים של העכבר יש עליות משקל שונות במהלך ההריון, כדי לקבוע עלייה במשקל טיפוסי עבור זן העכבר בשימוש.
3. בין אם מזמינים או מגדלים את העכברים, כדי להפחית את הלחץ של הסכרים, מניחים כרית קינון ובית עכבר בכלוב. הפחתת מתח יכולה לעזור להגדיל את שיעור ההישרדות של הגורים.

3. תכנון והרכבה של שלוש אלקטרודות שיניים

1. השתמש יריעות טיטניום כיתה 2 עם עובי של 0.063 ב כחומר מלאי עבור מגעי אלקטרודה.
2. באמצעות טכניקות עיבוד שבבי סטנדרטיות או כלי יד מדויקים, הפוך אלקטרודות עם הממדים הבאים: 20 מ"מ x 5 מ"מ עם קצה מעוגל וגרוב בחזרה. הסר קצוות מחוספסים או burrs באמצעות נייר זכוכית חצץ עדין.
3. כדי לחבר את מגעי האלקטרודה, לעטוף 22 G חוט נחושת תקוע סביב החריצים של האלקטרודה ומאובטח על ידי הלחמה. הגן על המפרק הזה באמצעות צינורות כיווץ חום.
4. לאחר מכן, חבר את האלקטרודה המחוברת למלקחיים אוטומטיים ולא מוליכים באמצעות צינורות כיווץ חום נוספים כדי להפוך את שתי האלקטרודות השליליות. חבר את האלקטרודה החיובית היחידה לחומר אוטומטי ולא מוליך (כגון ידית מברשת שיניים עם ראש מנוסר). התאם את הקצה הפתוח של החוט עם תקע בננה סטנדרטי.

4. הכנה לניתוח

1. להביא סכרים בהריון לאזור הניתוח לפחות 30 דקות לפני הניתוח כדי לאפשר את הירידה ברמות הלחץ לאחר הובלה ממתקן בעלי החיים.
2. לעקר את כל אתר הניתוח באמצעות מגבונים germicidal מעקר ולאחר מכן 70% אתנול. החלף כפפות לפני תחילת הניתוח.
3. לעקר כלים autoclaved בסטריליזציה חרוזי זכוכית.
4. מעבירים סטרילי 1x PBS (כ 50 מ"ל לסכר) ל 50 מ"ל צינורות חרוט ומניחים במתלה צינור באמבט המים מחומם ל 38-40 מעלות צלזיוס. בדוק את טמפרטורת מלוחים סטרילית עם מדחום.
5. הפעל את משאבת זרימת חימום המים, כך שהוא מחומם ל 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת הניתוח. זה ישמור על טמפרטורת הגוף של העכבר למשך הניתוח.
6. הפעל את מזרק הלחץ ואת electroporator ולהבטיח תפקוד תקין לפני הניתוח.
7. בקצרה לסובב את פתרון DNA פלסמיד (הושג בשלב 1.4) על צנטריפוגה שולחן ומניחים אותו על קרח.
8. משוך פיפטות זכוכית על מושך פיפטה כך קצה פיפטה זכוכית משך הוא כ 50 מיקרומטר קוטר.
9. מילוי פיפטה עם 20-40 μL של פתרון DNA (הושג בשלב 1.4).
10. הגדר את כל הפריטים הדרושים לניתוח כולל קרם להסרת שיער, יוד, 70% אתנול, החלפת כותנה, משחת עיניים, תפרים, גזה וכו '.
11. הכן גיליון ניתוח ומלא את המידע הדרוש, כגון מזהה עכבר ומשקל, תאריך ניתוח, שם מנתח וכו '.

5. בניתוח אלקטרופורציה ברחם

1. שקל את העכבר לפני הניתוח ושים לב לזה על גיליון הניתוח.
2. הרדמה עכבר בהריון (E16) על ידי שאיפה בתא אינדוקציה עם 4% (v / v) תערובת חמצן-isoflurane. לאחר העכבר כבר המושרה, לעבור שאיפת מסכה ולשמור isoflurane ב 1-1.5% (v / v) ולפקח על הנשימה לאורך כל הניתוח. בדוק כי העכבר מורדם לחלוטין, קצב הנשימה צריך להיות ~ 55-65 נשימות לדקה.
3. ניהול משככי כאבים לפני הניתוח: בופרנורפין (3.25 מ"ג/ק"ג; SC) ומלוקסיקאם (1-5 מ"ג/ק"ג; SC) בנפח מרבי של 10-30 מ"ל/ק"ג.
4. השתמש קרם להסרת שיער או בזהירות להשתמש סכין גילוח כדי להסיר את הפרווה מהבטן. לעקר את הבטן על ידי טבילה עם povidone-יוד ו 70% אתנול ולחזור על זה לפחות 3 פעמים. צור שדה סטרילי סביב הבטן באמצעות גזה סטרילית, וילונות סטריליים יכולים לשמש גם.
5. בצע חתך קו האמצע (3-4 ס"מ) בעור הבטן, להיות בטוח להרים את העור עם מלקחיים, כדי למנוע חיתוך דרך השריר. ואז לחתוך דרך השריר, שוב דואג להרים את השריר כדי למנוע חיתוך איברים חיוניים.
6. מוציאים בזהירות את קרני הרחם מהסכר באמצעות מלקחיים טבעתיים ומניחים אותן בעדינות על השדה הסטרילי, מוודאים שקרן הרחם נתמכת בריפוד ואינה מושכת רחוק מדי מהסכר. מנקודה זו ואילך, לשמור על קרן הרחם לחה לאורך כל הניתוח עם PBS סטרילי מראש מחומם 1x.
7. מקם עובר באמצעות מלקחיים או אצבעות. בזהירות להכניס את פיפטה זכוכית משך בזווית של 45 מעלות ביחס למישור האופקי של הראש מוכנס לתוך החדר לרוחב, אשר ניתן לזהות חזותית בין קו האמצע של המוח לבין העין. להזריק על 2-3 μL לתוך כל החדר לרוחב על ידי החדרת פיפטה לתוך אחד ולאחר מכן את החדר השני (מומלץ) או על ידי הזרקת פתרון ה-DNA לתוך החדר אחד עד שהוא עובר לשני החדרים לרוחב. החדר כבר ממוקד בהצלחה אם צורת חצי סהר קיים לאחר הזרקה.
   הערה: קצה פיפטה זכוכית יכול לשבור במהלך הניתוח. אם זה קורה, להחליף את פיפטה זכוכית, להבטיח כי קרני הרחם נשמרים לחים בעוד פיפטה חדשה מוכנה ומלאה בתמיסת ה- DNA.
8. כדי להחדיר תאים דו-צדדיים בקליפת המוח הקדמית, מקמו את שתי האלקטרודות השליליות בצידי העוברים בראש רק לרוחב ומעט קאודלי לחדרים הצדדיים וממקמים את האלקטרודה החיובית בין העיניים, ממש מול האף המתפתח.
9. ודא שהעובר לח בנדיבות. החל ארבעה פולסים מרובעים (משך הדופק = 50 ms משך, משרעת הדופק = 36 V, מרווח interpulse = 500 אלפיות השנייה).
10. להזריק ו electroporate כל העוברים, הולך אחד אחד, כך שכל עובר הוא electroporated מיד לאחר הזרקת פתרון ה-DNA. לאחר כל העוברים כבר electroporated, בזהירות להכניס את קרני הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן. במהלך שלב זה, מעיל חלל הבטן PBS סטרילי (1x) כדי לסייע מיקום קרן הרחם.
11. מלאו את חלל הבטן ב-1x PBS סטרילי, כך שלא יישארו כיסי אוויר לאחר השלמת התפירה. לתפור את השריר עם תפרים נספגים ואת העור עם תפרים שאינם נספגים משי.
12. אפשר לסכר להתאושש באופן מלא בתא מחומם למשך שעה לפחות. ב 48 שעות הבאות, לבדוק את הסכרים באופן קבוע. כשהסכר יחלים מההרדמה ויחזור להכרה, הוא יתחיל לזוז ולהציץ.
13. נהל משככי כאבים לאחר הניתוח אם סכרים מראים סימנים של כאב, כגון כדור גופם למעלה ונשימה מהירה. רק לנהל אם יש סימנים של כאב מאז זריקות SC יכול להדגיש את הסכרים, אבל אם מנוהל לקבוצת הניסוי גם לנהל את קבוצת הביקורת, או להיפך.

6. הסתערות על התנהגות חברתית מוקדמת במשימת אינטראקציה אימהית

הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרסומים^{קודמים 5,25}. בצע משימה זו לאחר עכברים נולדו מיום לאחר הלידה (P) 18-21.

1. התנהגות ביות אימהית במשימת האינטראקציה האימהית I (MI1).
   1. ודא כי מצעי הכלוב לא ישתנו בשבוע שלפני ביצוע המשימה.
   2. השג או בנה זירת שדה פתוח (OF) שניתן לנקות בקלות (אקריליק מומלץ) עם הממדים הבאים: 50 x 50 x 30 ס"מ (רוחב-רוחב-גובה). תנאי תאורה במהלך ביצוע התנהגויות יכולים להשתנות בהתאם לשאלה ניסיונית ויכולים להשפיע על רמות של התנהגות דמוית עוררות וחרדה. הקלט ניסויים התנהגותיים תחת אור עמום (כ-20 לוקס) הממוקם מעל מרכז הזירה.
   3. במשך יומיים לפני בדיקת ההתנהגות, התאקלם בסכר לזירה על ידי הנחתו מתחת לתיל רשת (כגון עיפרון) בפינת הזירה במשך חמש דקות ביום.
   4. ביום הבדיקה, אשר יכול להיות מ P18-21, לפני עכברים נגמלו, לנקות את הזירה ביסודיות עם מגבונים חיטוי 70% אתנול.
   5. הקימו את הזירה עם שתי פינות מנוגדות, שתיהן מכילות מצעים נקיים ופינה אחת המכילה מצעי קן מלוכלכים מכלוב הבית של הגור.
   6. אפשר לכל גור לחקור את הזירה במשך 3 דקות, הצבת כל גור בפינה ניטרלית, ריקה בהתחלה.
      הערה: רשום את אופן הפעולה באמצעות מצלמת וידאו במהירות של 30 fps. לנקות ביסודיות את הזירה בין כל גור ולהחליף את המצעים הטריים. החלף איזו פינה היא מצעים טריים לעומת קינים כפקד כדי למנוע העדפה פינתית מסיבות אחרות (כלומר, רעשי סביבה או אור). אם מפעילים מספר פסולת לאורך החלון ההתפתחותי P18-21, הפעל ניסויים התנהגותיים בו-זמנית בין ימים. כמו כן, ודא כי במהלך יום נתון, קבוצות בקרה וניסיון מופעלות במקביל.
2. אינטראקציה חברתית אימהית במשימת האינטראקציה האימהית II (MI2)
   1. בצע משימה זו מיד לאחר משימת MI1.
   2. הקימו את הזירה כך שפינה אחת תכיל רשת תיל ריקה והפינה היריבה מכילה את הסכר מתחת לתיל רשת. אם עכברים מסוגלים להזיז את הגביע, לשקול את הכיפה למטה עם משקל שניתן להדביק לחלק העליון של הכור כדי למנוע תנועה. שים מצעי קן מלוכלכים מכלוב ביתי בפינה אחרת.
   3. הפעל את משימת ה- MI2. מקם את הגור בפינה הריקה ובצע אופן פעולה של הקלטה למשך חמש דקות ב- 30 fps, דבר המאפשר לגור לחקור. הפעל כל גור בנפרד ביסודיות לנקות את הזירה כולה ואת כוסות רשת תיל בין כל גור.

7. ביצוע משימת התנהגות חברתית למבוגרים

1. הפעל התנהגות חברתית של מבוגרים באותם עכברים שהופעלו במשימת MI1 ו- MI2 ברגע שהם מבוגרים (P60-P70 ומעלה). הנתונים שנאספו כאן נעשו בקבוצה נפרדת.
2. טפל בעכברים הבוגרים במשך 3 ימים רצופים כדי לאפשר מגורים לנסיין. ודא שרק ניסויים שהכירו את העכברים עורכים ניסויי התנהגות, באופן אידיאלי, שאותו אדם יפעיל את כל המשימות.
3. הרגל עכברים לזירת OF במשך 3 ימים במשך 5 דקות בכל יום.
4. התנהגות מבחנים במשימה חדשנית לזיהוי אובייקטים כדי למדוד תנועה כללית ועניין באובייקט חדשני. זה יאפשר פרשנות משמעותית יותר של התנהגות חברתית אם לעכברים יש גירעון מסוים באינטראקציות חברתיות.
   1. מניחים עכברים בזירה במשך 5 דקות עם חפץ חדשני (צעצוע פלסטיק קטן עם משטחים חלקים ונקיים) בפינה אחת של הזירה. לנקות את הזירה ביסודיות בין עכברים עם 70% אתנול.
   2. לזיהוי אובייקטים חדשניים, הניחו את 'האובייקט החדש' שנחשף בעבר, המוכר כיום, בפינה אחת והניחו חפץ חדש בפינה הנגדית. עבור כל המשימות, העבר את הפינות בין גירסאות ניסיון כפקד.
   3. עבור אינטראקציה חברתית חדשנית, ודא כי העכברים הרומן הם גיל, מתח ומין תואם והם התאקלמו תיל רשת במשך 2 ימים רצופים במשך 5 דקות בכל יום. עבור כל משפט, מניחים עכבר רומן מתחת לתיל רשת ובפינה הנגדית מניחים תיל רשת ריקה. תן לעכברים לחקור את הזירה במשך 5 דקות תוך כדי הקלטת התנהגות. נקה את הזירה ואת כוסות תיל רשת ביסודיות בין כל משפט.

8. ניתוח נתונים התנהגותיים

1. השתמש DeepLabCut (https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut) כדי לבצע מעקב חלקי גוף בסיסי). הערות מפורטות על איך להתקין ולהשתמש DeepLabCut ניתן למצוא בדף GitHub שלה. כמו כן זמין ספריה מותאמת אישית המבוססת על פיתון 'dlc_utils' (https://github.com/balajisriram/dlc_utils) לניתוח נוסף של הנתונים לאחר השלמת המעקב הבסיסי אחר חלקי גוף. פרטים נוספים על אופן השימוש בספריה זו ניתן למצוא בדף GitHub.
   1. התקן DeepLabCut באמצעות תהליך ההתקנה אנקונדה. התקן גירסת CPU בלבד בעלת יכולת ממשק משתמש גרפי של DeepLabCut וכן את הגירסה המותאמת למעבד הגרפי להכשרת הרשת.
   2. בצע את ההוראות הזמינות בקישור שלהלן כדי ליצור פרוייקט למעקב אחר חלקי גוף. בריפי, בחר דוגמה של מסגרות מערכת הנתונים שלך וסמן ידנית את חלקי הגוף הרלוונטיים במסגרות אלה שנדגמו. לאמן את הרשת DeepLabCut לחזות את חלקי הגוף ולוודא כי הרשת מאומנת מבצעת כראוי.
      https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut/blob/master/examples/Demo_yourowndata.ipynb
   3. לצורך מעקב אחר מיקום הגוף וזיהוי אינטראקציות פשוטות בשדה פתוח, זהה את מרכז החיה, את הראש (המוגדר מבחינה מבצעית כנקודת האמצע בין האוזניים), את האוזניים השמאלית והימנית, כמו גם את האף ואת בסיס הזנב. לאחר מספר חלקי גוף במעקב מאפשר את ההחלפה המתאימה כאשר חלקים מסוימים בגוף חסרים במסגרת עקב חסימה.
   4. מלבד חלקי גוף של בעלי חיים, עקוב אחר מגוון נקודות הקשורות לסביבה: כגון הקצוות של תיבות התנהגות. אלה מאפשרים הערכה חוזרת של נקודות כאלה על פני הפעלות מרובות - גם אם המיקום של ההתקנה ההתנהגותית משתנה מעט ביחס למצלמה בין המפגשים.
   5. לאחר מעקב אחר חלקי הגוף מנתוני ההתנהגות, הקפיד לסנן את מיקומי חלקי הגוף החזויים בהתבסס על הביטחון המשויך לחיזוי בכל פריים של הסרטון. תחזיות ביטחון נמוך קשורות בדרך כלל עם חלקי גוף occluded. עבור תחזיות כאלה, להחליף חלק גוף נתון עם אחר (אם החלפה כזו מתאימה) או להשתמש במיקומים של חלקי גוף אחרים כדי לחזות היכן חלק הגוף הרלוונטי עשוי להיות. עבור רוב יישומי השדה הפתוח, מרכז הגוף של המכרסמים הוא רק לעתים נדירות occluded וניתן לחזות עם דיוק גבוה ודיוק.
   6. השתמש במיקום החזוי של centroid, כמו גם את המיקום של נקודות במעקב בסביבה כדי להעריך מספר תכונות של התנהגות החיה. לדוגמה, בנתוני השדה הפתוח, ניתן להשתמש בנגזרת הזמן של המיקום כדי לחשב את מהירות החיה.
2. כדי למנוע הטיה, לבצע את כל הניסויים "עיוור" ביחס לקבוצת הניסוי כאשר הדבר אפשרי, במיוחד כאשר יש אלמנט סובייקטיבי בהערכת התוצאות. בדוק את ההשפעה של הבדלי מין על התוצאות הניסיוניות העיקריות על ידי איגום נתונים לקבוצות זכר ונקבה. כל הבדיקות הסטטיסטיות נועדו לבחון מספר שווה של בעלי חיים בין קבוצות.

9. לאחר ספירת תאים הוק כדי לאפיין את היקף transfection התא

1. קבע את מספר התאים המוחצנים לכל עכבר מכיוון שלא כל העכברים יקבלו הדבקה מוצלחת ויהיה שינוי במספר התאים החודרים. שיטה אחת להשגת זה כרוכה בספירת מספר הנוירונים החודרים בקטעי קורונה מתחלפים ואחריו אינטרפולציה כדי להעריך את המספר הכולל של תאים שנדבקו. בשביל זה, תמונה ולספור כל קטע coronal אחר (50 מיקרומטר).
   1. השתמש perfusions transcardial עם 4% PFA כדי לתקן רקמה ולאחר מכן לנתח את המוח. לאחר cryoprotection, קטע את המוח בחלקי coronal ב 50 מיקרומטר.
   2. עבור קליפת המוח הקדמית, לספור תאים בתוך +2.75 ו + 1.35 מ"מ מ Bregma. קואורדינטות אלה מכילות אזורים קליפתיים קדמיים וכוללות חלק מקליפת המוח הסומטו-סנטורית (S1).  בשיטה זו, לא נצפו תאים שנדבקו באזורים קליפתיים קאודלים יותר או באזורים תת-קליפתיים.
   3. הקפד לציין את השמאלי מחצי הכדור הימני, כגון סימון חצי כדור אחד עם חור מחט במהלך חתך, ולספור תאים דו-צדדית. השתמש בתוכנה אוטומטית לספירת תאים או ספירת תאים באופן ידני, המאשרת את נוכחותו של גוף תא באמצעות DAPI.
2. לאחר ספירת תאים מתקבלים, להגדיר סף להכללה. לדוגמה, כוללים רק עכברים שעברו אלקטרופופורה דו-צדדית בניתוח. לצורך ניתוח נוסף, לתאם את מספר התאים transfected עם תגובות התנהגותיות כדי לראות אם יש שיוך. טכניקה זו תתמקד באזורי מוח מרובים, ולכן יש צורך לספק מידע על אילו אזורי מוח עברו מניפולציה גנטית.
   הערה: ייתכן כי מניפולציה של גנים מסוימים יכולה לשנות הגירה עצבית, מפרט ו/או מוות. ודא במהלך ספירת תאים כי האנטומיה במוח נבדקת וכל נוירון חתוך נמצא בתוך השכבה שלכאורה נחתכה (כלומר L2/3). מדידות אנטומיות ברוטו כגון עובי קליפת המוח ניתן לכמת גם על ידי מדידת המרחק מן הפיה כדי L6 קליפת המוח.

תוצאות

פיתוח ויישום מוצלחים של אלקטרופורטור שנבנה בהתאמה אישית ושלושה שיניים- אלקטרודה.
עבור IUEs, אלקטרופורטור זול שנבנה בהתאמה אישית נבנה על בסיס עיצוב שתואר קודם לכן²⁷ (איור 1A ואיור 2). אלקטרודה בעלת שלושה שיניים נוצרה^23,

Discussion

בזאת, צינור מתואר המשלב מניפולציה של גנים חדשים של עניין באוכלוסיות גדולות של נוירונים קליפת המוח הקדמית עם מבחנים התנהגותיים בעכברים. יתר על כן, צינור זה מאפשר מחקר אורך של התנהגות באותם עכברים הן במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה והן בבגרות. טכניקה זו עוקפת את הצורך להסתמך על מודלים גנטיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
13mm Silk Black Braided Suture	Havel's	SB77D	Suture skin
Adson Forceps	F.S.T.	11006-12	IUE
C270 Webcam	Logitech	N/A	Record behavior
Electroporator	Custom-built	N/A	See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015
EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps	Bio Basic Inc.	BS466	Pladmid preparation
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G	Dye for DNA solution
Fine scissors- sharp	F.S.T.	14060-09	IUE
Fisherbrand Gauze Sponges	Fisher Scientific	1376152	IUE
Gaymar Heating/Cooling	Braintree	TP-700	Heating Pad
Glass pipette puller	Sutter Instrument,	P-97	IUE
Glass pipettes	Sutter Instrument,	BF150-117-10	IUE
Hair Removal Lotion	Nair	N/A	Hair removal
Hartman Hemostats	F.S.T.	13002-10	IUE
Open field maze- homemade acrylic arena	Custom-built	N/A	50 × 50 × 30 cm length-width-height
pCAG-GFP	Addgene	11150	Mammalian expression vector for expression of GFP
Picospritzer III	Parker Hannifin	N/A	pressure injector
Retractor - 2 Pronged Blunt	F.S.T.	17023-13	IUE
Ring forceps	F.S.T.	11103-09	IUE
Sterilizer, dry bead	Sigma	Z378569	sterelize surgical tools
SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY	Havel's	HJ398	Suture muscle
Water bath	Cole-Parmer	EW-12105-84	warming sterile saline