JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

רנ"א משפר (eRNAs) הם רנ"א לא מקודד המיוצר ממשפרים פעילים. גישה אופטימלית לחקר פונקציות eRNA היא לתפעל את רמותיהם באזורי הכרומטין המקומיים. כאן אנו מציגים מערכת חזקה למחקרי eRNA על ידי שימוש במפעילי שעתוק התמזגו עם CRISPR-dCas9 כדי לגרום לביטוי של eRNA מעניין.

Abstract

משפרים הם אלמנטים גנומיים מרכזיים המפוזרים בגנום היונקים ומכתיבים תוכניות ביטוי גנים ספציפיות לרקמות. עדויות הולכות וגדלות הראו כי משפרים לא רק מספקים מוטיבים של קשירת DNA לגורמי שעתוק (TFs) אלא גם מייצרים RNA לא מקודדים המכונים eRNAs. מחקרים הראו כי תעתיקי eRNA יכולים למלא תפקידים משמעותיים בוויסות גנים הן בפיזיולוגיה והן במחלות. שיטות נפוצות לחקירת תפקודם של eRNAs מוגבלות לגישות "אובדן תפקוד" על ידי הפלת eRNAs, או על ידי עיכוב כימי של שעתוק המשפר. לא הייתה שיטה חזקה לביצוע מחקרי "רווח תפקוד" של eRNA כדי לחקות מצבי מחלה ספציפיים כמו סרטן אנושי, שבו eRNA לעתים קרובות מתבטא יתר על המידה. כאן, אנו מציגים שיטה להפעלה מדויקת וחזקה של eRNAs לחקירה פונקציונלית של תפקידיהם על ידי יישום מערכת מתווכי הפעלה סינרגטיים מתווכים (SAM) dCas9. אנו מציגים את כל זרימת העבודה של הפעלת eRNA, החל מבחירת ה-eRNA, העיצוב של gRNAs ועד לאימות הפעלת ה-eRNA על ידי RT-qPCR. שיטה זו מייצגת גישה ייחודית לחקר התפקידים של eRNA מסוים בוויסות גנים והתפתחות מחלות. בנוסף, ניתן להשתמש במערכת זו לבדיקת CRISPR בלתי מוטה לזיהוי מטרות eRNA המניעות פנוטיפ בהקשר של מחלה ספציפית.

Introduction

הגנום האנושי מכיל קונסטלציה של אלמנטים רגולטוריים 1,2,3. בין אלה, משפרים מתגלים כאחת הקטגוריות הקריטיות ביותר 4,5,6. משפרים ממלאים תפקידים חיוניים בוויסות ההתפתחות, ואחראים על יצירת תוכניות ביטוי גנים מרחביות-זמניות לקביעת זהות התא 5,6,7. באופן קונבנציונלי, משפרים נחשבים רק לרכיבי DNA המספקים מוטיבים מחייבים לגורמי שעתוק (TFs), אשר לאחר מכן שולטים בביטוי גן היעד 6,8. עם זאת, סדרה של מחקרים מצאה כי משפרים פעילים רבים מתמללים גם RNA משפרים שאינם מקודדים (כלומר, eRNAs)4,9,10.

רמת שעתוק ה-eRNA נמצאה בקורלציה עם הפעילות של משפר 4,10. משפרים פעילים מייצרים יותר תעתיקי eRNA ומראים רמות גבוהות יותר של סמני אפיגנום הקשורים לשעתוק פעיל, כגון H3K27ac ו-H3K4me1 9,11,12. כמה מחקרים הראו כי תעתיקי eRNA יכולים למלא תפקידים חשובים בהפעלת שעתוק של גני מטרה10,12. מספר רב של eRNAs זוהו כבלתי מוסדרים בסרטן אנושי 13,14,15,16, שרבים מהם הפגינו ספציפיות גבוהה של סוג הסרטן ורלוונטיות קלינית. ממצאים אלה מביאים הזדמנויות לכך שהבהרת eRNAs שיכולים להניע/לקדם גידול עשויה להציע מטרות חדשות להתערבות טיפולית13,15.

השיטות הנוכחיות לחקר פונקציות eRNA מבוססות כמעט אך ורק על אסטרטגיות נוקדאון שהשתמשו ב-RNA הפרעות קטנות (siRNA), RNA סיכת ראש קצרה (shRNAs), או אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (ASOs, מתוכם חומצות גרעין נעולות (LNAs) הן הסוג הנפוץ במחקר)10,12,17. עם זאת, מחלות אנושיות כמו סרטן מראות בעיקר ביטוי יתר של eRNA בהשוואה לרקמה הנורמלית הסמוכה להן,מה שדורש כלים ל"ביטוי יתר" של eRNA כדי לחקות את דפוסי הביטוי הרלוונטיים למחלה שלהם למחקרים פונקציונליים. כדי להשיג זאת, מערכת ביטוי יתר חוץ רחמית מבוססת פלסמיד אינה אופטימלית מכיוון שאתרי התחלת השעתוק והסיום המדויקים של eRNA נותרו לא ברורים ברובם. בנוסף, מערכת ביטוי פלסמיד עשויה לשנות את מיקומם של eRNAs, ולגרום לחפצים פוטנציאליים של תפקידיהם18. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי להקל על האפיון הפונקציונלי של eRNAs על ידי אכיפת "ביטוי יתר" שלהם במיקום הגנומי המקורי של ייצורם (כלומר, באתר), המבוסס על מערכת מתווכי ההפעלה הסינרגטיים של CRISPR/dCas9 (SAM).

מערכת ה-SAM פותחה בתחילה להפעלת גנים מקודדים ורנ"א בין-גני ארוך שאינו מקודד (lincRNAs) הקשורים לעמידות למעכבי BRAF בתאי מלנומה19. בניגוד לטכנולוגיות אחרות של הפעלת CRISPR (CRISPRa), מערכת ה-SAM מורכבת משילוב של מפעילי שעתוק כדי להעניק הפעלת שעתוק חזקה של אזורי מטרה. מפעילים אלה כוללים: Cas9 מת אנזימטית (dCas9) המותך עם VP64 (כלומר, dCas9-VP64); RNA מנחה המכיל שני אפטמרים של MS2 RNA, וחלבון מפעיל היתוך MS2-p65-HSF1. נוכחותם של אפטמרים MS2 ב-gRNA יכולה לגייס את חלבון ההיתוך MS2-p65-HSF1 לקרבת אתרי הקישור של dCas9/gRNA. בין אלה, VP64 הוא טטרמר מהונדס של תחום מפעיל השעתוק VP16 של הרפס סימפלקס, שהוכח כמפעיל חזק את שעתוק הגנים על ידי גיוס גורמי שעתוק כלליים 20,21,22. חלבון ההיתוך MS2-p65-HSF1 מורכב משלושה חלקים. החלק הראשון, MS2-N55K, הוא צורה מוטנטית של חלבון קושר MS2 בעל זיקה חזקה יותר23; שני החלקים האחרים של חלבון היתוך זה הם תחום הטרנסאקטיביות של P65 וגורם הלם חום 1 (HSF1), שניהם גורמי שעתוק בעלי תחומי טרנסאקטיביות חזקים ויכולים לגרום לתוכניות שעתוק חזקות24,25. לכן, מערכת ה-SAM יצרה למעשה קומפלקס אקטיבטור חזק ביותר להפעלת שעתוק של גנים מקודדים ייעודיים ו-lincRNAs19.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור 1.

1. בחירת RNA משפר (eRNA).

  1. זהה אזור אינטרסים משפר משוער על ידי שימוש בשיאי קשירה של נתוני ריצוף חיסוני של כרומטין (ChIP-Seq), כלומר של שינויים בהיסטון (למשל, H3K4me1 ו-H3K27ac), או של קו-אקטיביטורים של שעתוק (למשל, p300).
  2. זהה את ה-eRNA המעניין על ידי הצטלבות שיא ה-ChIP-Seq עם אותות RNA-seq (למשל, מ-RNA-seq הכולל או מ-RNA-seq מתהווה כגון Global Run-On Sequencing (GRO-Seq).
    הערה: האזור שנבחר לתכנון gRNAs צריך להיות מוגבל בדרך כלל לאזור "ליבת המשפר", שבו TFs או קו-אקטיבטורים (למשל, p300) הראו שיאי ChIP-seq ברורים (איור 2A). ה-dCas9 והקו-אקטיביטורים שלו יגויסו על ידי gRNA לאזור זה כדי לחקות את הקישור המקורי של קו-אקטיבטורים (איור 2A). אם מערכי נתונים ספציפיים כגון ניתוח כובע של ביטוי גנים (CAGE)4 או GRO-cap26 זמינים, ניתן להשתמש בהם כדי לקבוע במדויק את "ליבת המשפר", האזור בין שני אתרי התחלת שעתוק של ה-eRNAs המתועתקים לכיוונים מנוגדים 4,10,26.

2. עיצוב gRNA

  1. השתמש בכלי תכנון נפוצים של CRISPR gRNA כגון CRISPOR27 כדי לבחור gRNAs עם פוטנציאל כיבוי (http://crispor.tefor.net/) נמוך.
    הערה: כלים אחרים כמו Benchling28 או CHOPCHOP29 יכולים לשמש גם כאפשרויות נוספות לעיצוב gRNA.
  2. הדבק את רצף ה-DNA של ליבת המשפר בעמודה שלב 1 באתר CRISPOR, ולאחר מכן לחץ על הלחצן הנפתח כדי לבחור את הגנום המתאים (למשל, אנושי) בעמודה שלב 2 . לחץ על כפתור התפריט הנפתח כדי להגדיר את רצף המוטיב הסמוך של Protospacer (PAM) כ-"NGG" בעמודה שלב 3 ולאחר מכן לחץ על כפתור "שלח" כדי ליצור רצפי מדריך באורך של 20 bp.
  3. בחר מדריכים עם ציוני הספציפיות הגבוהים ביותר בכלי CRISPOR, כלומר, פוטנציאל נמוך מחוץ למטרה, ולאחר מכן הוסף "CACCG" לקצה 5', ו-"C" לקצה 3', בהתאמה.
    הערה: בחר את המדריכים עם ציוני הספציפיות הגבוהים ביותר (עדיף >85 ב-CRISPOR).
  4. הזמינו אוליגונוקלאוטידים לכל רצף חושים ואנטי-סנס ממקורות מסחריים.
    הערה: הוראות נוספות על עיצוב CRISPR/Cas9 gRNA ניתן למצוא במחקרים אחרים30,31. התלויות בשלב 2.2 יהפכו את ה-gRNA לתואם לעמוד השדרה של SAM gRNA (Addgene #61427), המשתמש באנזים ההגבלה BsmBI.

3. שיבוט gRNAs למבנה לנטי-ויראלי

  1. כדי לחסל אוליגוס מערבבים 1 מיקרוליטר מכל אוליגו מזווג ב -100 מיקרומטר, 1 מיקרוליטר של מאגר קשירה 10x T4, 0.5 מיקרוליטר של T4 DNA Ligase (400,000 יחידות/מ"ל) ו-6.5 מיקרוליטר של H2O כדי להגיע לנפח כולל של 10 מיקרוליטר. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ואז 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולרדת ל-25 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס לדקה. יש לדלל ל-100 מיקרוליטר באמצעות H2O.
  2. עכל את עמוד השדרה של gRNA על ידי ערבוב של 2 מיקרוליטר של מאגר אנזים הגבלה (RE) פי 10, 300 ננוגרם של lenti_gRNA(MS2)_zeo פלסמיד עמוד השדרה (Addgene #61427) ב-1 מיקרוליטר, 1 מיקרוליטר של אנזים BsmBI ו-16 מיקרוליטר של H2O כדי להגיע לנפח כולל של 20 מיקרוליטר דגירה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  3. מערבבים רכיבי קשירה עם מוצר עיכול של 20 מיקרוליטר על ידי הוספת 2.5 מיקרוליטר של מאגר קשירה 10x T4, 1 מיקרוליטר של מוצר חישול מדולל ו-1.5 מיקרוליטר של T4 DNA ליגאז (400,000 יחידות/מ"ל) למערכת של 25 מיקרוליטר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
  4. הפוך 2 מיקרוליטר מתערובת הקשירה משלב 3.3 לתאי E.coli מוכשרים Stbl3. צלחת אותם על צלחת אמפיצילין LB-agar ודגירה למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  5. בחר וחסן מושבת חיידקים בודדת וחלץ פלסמיד. שלח אותו לריצוף Sanger כדי לאשר שרצף ה-gRNA הוכנס כהלכה.
    הערה: רצפים עבור הפריימרים וה-gRNAs זמינים בטבלה משלימה 1. מומלץ להשתמש כאן בתאי E.coli מוכשרים כימית Stbl3 מכיוון שיש להם תפוקת DNA פלסמיד גבוהה יותר ויציבות פלסמיד גבוהה יותר בעת יצירת פלסמידים המועדים לחוסר יציבות32.

4. מבחן יעילות gRNA

הערה: למרות שייתכן שזה לא הכרחי עבור כל gRNA, מומלץ לחוקרים לבחון את איכות ה-gRNA על ידי ביצוע בדיקת Surveyor (כלומר, בדיקת מחשוף אי-התאמה) כדי לזהות אינדלים או מוטציות שניתן לייצר ביעילות רק על ידי gRNAs באיכות טובה33,34. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מעקב אחר אינדל על ידי פירוק (TIDE) כדי לקבוע את יעילות ה-gRNA 30,35. Surveyor nuclease הוא חבר במשפחה של אנדונוקלאזות ספציפיות לאי-התאמה שיכולות לחתוך דנ"א דו-גדילי עם אי-התאמות (איור 3A). האיכות של gRNAs יכולה להתגלות על ידי היעילות של ייצור מיני DNA קטנים יותר. מבחינה מעשית, יעילות חיתוך המודדים יכולה להיות מושפעת גם מיעילות הטרנספקציה של gRNAs ו-Cas9.

  1. Transfect gRNA יחד עם הפלסמיד pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene #62988) המבטא את חלבון Cas9 לתאי 293T באמצעות מגיב טרנספקציה מבוסס שומנים. השתמש ב-1.2 מיקרוגרם/מ"ל עבור כל פלסמיד לבאר בצלחת של 6 בארות. המשך לתרבית התאים במשך 3 ימים לאחר הטרנספקציה. קציר וחילוץ DNA גנומי לפי פרוטוקולהיצרן 36.
  2. השתמש בתגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את אזור המשפר הממוקד מה-DNA הגנומי. השתמש בתנאי PCR המוצגים בטבלה משלימה 2. השתמש בפריימרים בטבלה משלימה 1 למשפר לדוגמה, NET1e. דנטורציה של תוצרי ה-PCR על ידי דגירה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, והכלאה מחדש שלהם על ידי ירידה מ-95 מעלות צלזיוס ל-25 מעלות צלזיוס במהירות של -0.3 מעלות צלזיוס לשנייה כדי לאפשר ל-DNA החד-גדילי (ssDNA) עם ובלי אינדל או מוטציות המושרות על ידי gRNA לחשל זה לזה.
  3. עכל את ה-DNA ההיברידי על ידי נוקלאז ה-Surveyor (איור 3A) בהתאם לפרוטוקולהיצרן 37. מערבבים 400 ננוגרם של DNA היברידי משלב 4.2, 1 מיקרוליטר של נוקלאז Surveyor, 1 מיקרוליטר של משפר Surveyor ו-5 מיקרוליטר של 0.15 M MgCl2 במערכת של 50 מיקרוליטר. יש לדגור בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. נתח את ה- DNA על ג'ל אגרוז. השתמש בבקרה שלילית, כגון תאים עם Cas9 בלבד אך ללא התמקדות ב-gRNAs, בבדיקה ובאלקטרופורזה של הג'ל (איור 3B).

5. יצירת Lentivirus

  1. הוסף psPAX2, pMD2.G ופלסמיד יעד (למשל, lenti_dCas9-VP64_Blast, Addgene #61425; או lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro, Addgene #61426) ביחס של 3 מיקרוגרם: 1 מיקרוגרם: 4 מיקרוגרם בצינור פוליפרופילן של 1.5 מ"ל. מערבבים אותם עם 500 מיקרוליטר של Opti-MEM ודוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. בשפופרת נפרדת, הכניסו 10 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה מבוסס השומנים ל-500 מיקרוליטר של Opti-MEM, ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שלב את המוצרים משלבים 5.1 ו -5.2 ודגר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. צלחת תאי 293T יום אחד לפני הטרנספקציה ותן להם להגיע למפגש של ~30% בצלחת של 10 ס"מ בזמן הטרנספקציה. הוסף 4 מ"ל של מדיום רגיל (DMEM עם 10% FBS), ולאחר מכן הוסף את הקומפלקס משלב 5.3 טיפתית לתאים. הוסף DMEM עם 10% FBS כדי להפוך את הנפח הסופי לעד 6 מ"ל. דגירה למשך הלילה בחממת תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  5. למחרת, שנה את הבינוני ל-10 מ"ל של DMEM חדש עם 10% FBS. קצרו את המדיום 24 שעות לאחר השינוי הבינוני. השתמש במסנן מזרק (למשל, 0.45 מיקרומטר) כדי לסנן את המדיום המכיל את הנגיף ולאחר מכן המשך לשלב 6 או אחסן את הנגיף ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: פעולות לנטי-וירוס דורשות ארון בטיחות ביולוגית ברמה II. יש לנקוט משנה זהירות כדי לטפל בבטחה בניסויים הקשורים לנגיף; ואם למיכל כלשהו יש מגע ישיר עם המדיום הנגיפי, יש להלבין אותו במשך יותר מ-20 דקות לפני סילוקו כסכנה ביולוגית.

6. תרבית תאים

  1. שמור על תאים בחממת תרבית תאים CO2 ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. תרבית תאי MCF7 ו-293T במדיום Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco עם 10% FBS.
  3. לגדל תאים בכלים של 10 ס"מ ולפצל ביחס של 1:3 עד 1:5 כאשר הם מתכנסים.

7. זיהום תאים ובחירה

  1. זרע את תאי המטרה (למשל, MCF7) ישירות בתערובת מדיום ויראלית המכילה 0.5 מ"ל של lenti_dCas9-VP64_Blast (Addgene #61425) ו-0.5 מ"ל lenti_MS2-p65-HSF1_Hygro (Addgene #61426). הוסף 8 מיקרוגרם/מ"ל Hexadimethrine bromide כדי להגביר את יעילות הזיהום. השתמש בבאר של תאים לא נגועים כבקרה שלילית לבחינת יעילות בחירת האנטיביוטיקה.
    הערה: כמות המדיום הנגיפי מומלצת כדלקמן: 6 מ"ל מדיום ויראלי לצלחת 10 ס"מ, 1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות, ו-0.5 מ"ל לבאר של צלחת 12 בארות.
  2. לאחר 24 שעות לאחר ההדבקה, הוסף לתאים מדיום טרי המכיל בלסטיצידין (5 מיקרוגרם/מ"ל לתאי MCF7) והיגרומיצין (200 מיקרוגרם/מ"ל לתאי MCF7).
  3. שמור את התאים במדיום הברירה האנטיביוטית עד שתאי הבקרה השליליים מתים.
    הערה: הזמן עשוי להשתנות עד שקווי תאים שונים יתייצבו. עבור MCF7, בדרך כלל לוקח 5-7 ימים עד שתאים לא נגועים מתים לחלוטין. יש לבדוק עקומת הרג באמצעות מגוון ריכוזי אנטיביוטיקה עבור קו תאים חדש לפני הניסויים. מקובל להשתמש בתערובת תאים לשלבים הבאים, אך חלופה היא לבחור מושבות חד-תאיות הומוגניות מבחינת ביטוי שני חלבוני האפקטור. הקו היציב המתקבל מכונה קו ההורים של אפקטור SAM (למשל, קו אפקטור SAM MCF7) במאמר זה. מומלץ להשתמש בקו תאים הורי משותף של אפקטור SAM להדבקה על ידי gRNA מכוונים או לא מכוונים, במיוחד אם ההשפעות שלהם יושוו.
  4. השתמש בכתמים מערביים כדי לקבוע אם התאים מבטאים ביציבות את שני חלבוני האפקטור (דוגמה מוצגת באיור 4A). השתמש בשעתוק הפוך של סך ה-RNA ואחריו PCR כמותי (RT-qPCR) כשיטה חלופית לבחינת רמות הביטוי של שני ה-mRNA (dCas9-VP64 ו-MS2-p65-HSF1, איור 4B).
    הערה: פריימרים לבחינת רמות ה-mRNA של שני אפקטורי dCas9 זמינים בטבלה משלימה 1.
  5. צור lentivirus של gRNAs שנבנו בשלב 3.5 והדביק את קו תאי ה-SAM היציב המבטא באופן כפול dCas9-VP64 ו-MS2-p65-HSF1 עם gRNA lentivirus בודד. הוסף זאוצין (100 מיקרוגרם/מ"ל לתאי MCF7) למדיום 24 שעות לאחר התמרה נגיפית. צור בקרה שלילית המבטאת gRNA שאינו ממוקד (NT-gRNA) בקו תאי ה-SAM ההורי.
    הערה: ודא שתרופת הבחירה היא ספציפית למבנה המבוקש.

8. מיצוי RNA ו-RT-PCR כמותי לבחינת רמות eRNA

  1. חלץ את סך ה-RNA משורות תאי SAM המבטאות NT-gRNA או מכוונות ל-gRNA באמצעות ערכת מיצוי RNA38, או שיטה אחרת המבוססת על פנול כלורופורם. השתמש בתאים של ~80% מפגש בבאר אחת של צלחת שש בארות למיצוי RNA.
    הערה: לא נצפה הבדל משמעותי בפרקטיקה שלנו לזיהוי eRNA כאשר RNA מופקים על ידי עמודות קשירה מסחריות או על ידי ריאגנטים של פנול כלורופורם.
  2. צור DNA משלים (cDNA) מה-RNA המטוהר על ידי תגובת שעתוק הפוך עם הקסמר אקראי, בהתאם לפרוטוקולהיצרן 39. תנאי שימוש בטבלה משלימה 2.
    הערה: מכיוון שרוב ה-eRNAs הם 1,2,4,9,10 שאינם פוליאדניליים, הקסמר אקראי משמש באופן שגרתי ליצירת cDNA.
  3. תכנן פריימרים למדידת eRNA יעד RT-qPCR באמצעות כלי תכנון פריימר מכובד (למשל, פריימר 3). בדוק את ליניאריות ההגברה של זוגות הפריימר על ידי בחינה אם הפריימרים יגבירו באופן ליניארי cDNA מדולל סדרתי ויציגו הבדלי מחזור qPCR צפויים. תנאי שימוש בטבלה משלימה 2.
    הערה: הפריימרים עבור RT-qPCR צריכים להתמקד באזור המתועתק מאוד ברצף ה-RNA המתהווה, ובדיקת הליניאריות של פריימרים צריכה לכלול מגוון רחב של דילול cDNA כדי להבטיח שכל רמות ה-eRNA האפשריות נבדקות. דוגמה לבדיקת ליניאריות מוצגת באיור 5A.
  4. בצע RT-qPCR ונתח את רמות ביטוי ה-eRNA בתאי בקרה (קו תאי SAM עם NT-gRNA) ובקו תאי SAM עם gRNAs מכווני eRNA (למשל, NET1e gRNA#1) (למשל, איור 6A). פריימרים ל-NET1e RNA מוצגים בטבלה משלימה 1. תנאי שימוש בטבלה משלימה 2.  

9. dCas9 ChIP ו-qPCR

הערה: שלב זה הוא ניסוי אופציונלי לאימות הקישור של קומפלקס dCas9/SAM-gRNA למשפר המטרה על ידי ה-gRNAs הספציפיים. אמנם מומלץ למשתמשים לבצע שלב זה, אך אין צורך לבדוק כל gRNA בודד. עיין בדוגמהampמוצגת באיור 5B. עיין בפריימרים המפורטים בטבלה משלימה 1.

  1. תאים מקושרים
    1. הסר את המדיום מהתאים והוסף 1% פורמלדהיד מומס במי מלח חוצץ פוספט (PBS). השאירו למשך 10 דקות.
    2. הוסף 2.5 M גליצין בנפח 1:20 כדי להרוות את התאים הצולבים ולשטוף פעמיים עם PBS קר כקרח. הוסף 700 מיקרוליטר PBS קר כקרח וגרד את התאים לצינור של 1.5 מ"ל.
    3. צנטריפוגה ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. המשך לשלב 9.2, או הצמד להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. סוניקט
    1. הכינו מאגרי LB1, LB2 ו-LB3 טריים. LB1: 50 מ"מ Hepes-KOH (pH 7.5), 140 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 10% גליצרול, 0.5% NP-40, 0.25% טריטון-X 100 ומעכב פרוטאז 1x. LB2: 10 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 200 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA ומעכב פרוטאז 1x. LB3: 10 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 100 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA, 0.5 מ"מ EGTA, 0.1% Na-דאוקסיכולאט, 0.5% N-לאורוילסרקוזין ומעכב פרוטאז 1x. תוסף מעכב פרוטאז 1x טרי למאגר לפני הניסוי.
    2. הוסף 1 מ"ל של מאגר LB1 לכדורי התא, פיפטה היטב, סובב ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, וסובב ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופרנטנט, מוסיפים 1 מ"ל של מאגר LB2, מסובבים ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וסובבים ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופרנטנט ומסירים את עודפי מאגר ה-LB2. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר LB3.
    3. סוניקט ופצל את ה-DNA של הכרומטין לגודל ממוצע של ~200-400 bp באמצעות מערכת סוניקטור מתאימה. לאחר הסוניקציה מוסיפים 30 מיקרוליטר של 10% טריטון-X 100 ומערבבים היטב. בדוק את זמן הסוניקציה המתאים אם נעשה שימוש בקו תאים חדש.
    4. צנטריפוגה ב-14,000 x גרם להסרת הגלולה. העבירו את הסופרנטנט לצינור החדש והוסיפו 630 מיקרוליטר של LB3 ו-70 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 לנפח כולל של 1 מ"ל. הוסיפו 2 מיקרוגרם של נוגדן Cas9 לסופרנטנט וסובבו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. לכידת קומפלקס חיסוני וקישור צולב הפוך
    1. הכן מאגר RIPA (50 מ"מ HEPES pH 7.6, 1 מ"מ EDTA, 0.7% Na-deoxycholate, 1% NP-40, 0.5 M LiCl) ומאגר פליטה (1% SDS ו-0.1 M NaHCO3).
    2. שטפו את דינבי חלבון G עם 1% BSA ב-PBS 3 פעמים ומאגר LB3 פעם אחת.
    3. הוסף לדגימה 30 מיקרוליטר של דינבידים של חלבון G ודגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
    4. שטפו את קומפלקס החרוזים-אימונו-קומפלקס ב-500 מיקרוליטר של מאגר RIPA פי 6. אל תתנו לחרוזים להתייבש.
    5. שטפו את קומפלקס החרוזים החיסוני פעם אחת עם מאגר TE; הסר את המאגר.
    6. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה לקומפלקס החרוזים החיסוני ולמערבולת; לאחר מכן הכניסו אותו לשייקר מחומם מתכוונן לטמפרטורה המכוון ל-65 מעלות צלזיוס עם ניעור של 600 סל"ד למשך 6-16 שעות כדי להפוך את הקישור ההפוך.
  4. מיצוי DNA
    1. הסר צינורות מהשייקר, סובב לזמן קצר את החרוזים והניח אותם על מעמד מגנטי. העבירו 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור טרי והוסיפו 200 מיקרוליטר של מאגר TE.
    2. הוסף 1 מיקרוליטר של RNase A (1 מ"ג/מ"ל) לצינור ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. לאחר שעה אחת של דגירה, הוסף לדגימה 2 מיקרוליטר של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) ודגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
    4. צנטריפוגה בקצרה והוסף 400 מיקרוליטר של תערובת אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל. מערבבים היטב, ואז צנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 10,000 x גרם.
    5. העבירו 400 מיקרוליטר מהשכבה העליונה לצינור של 1.7 מ"ל המכיל 16 מיקרוליטר של 5 M NaCl ו-1 מיקרוליטר גליקוגן (20 מיקרוגרם/מיקרוליטר) וערבבו היטב.
    6. מוסיפים 800 מיקרוליטר של 100% אתנול ומשאירים למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס.
    7. למחרת בבוקר, צנטריפוגה את הצינורות ב-4 מעלות צלזיוס ב-14,000 x גרם למשך 15 דקות.
    8. הסר את הסופרנטנט ושטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול. סובב מטה ב-14,000 x גרם למשך 10 דקות.
    9. הסר אתנול, גלולה יבשה באוויר והשהה מחדש ב-50 מיקרוליטר של TE (10 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 1 מ"מ EDTA).
  5. בצע ChIP-qPCR כדי לבחון את הגיוס של קומפלקס ה-SAM לאתר המיקוד על ידי זוג פריימר מיקוד ליבת משפר. השתמש בזוג פריימרים המכוון לאזור לא רלוונטי כפקד שלילי.

10. בדיקת צמיחת תאים ובדיקות פונקציונליות אחרות של הפעלת יתר של eRNA

  1. טריפסין קווי תאי SAM המבטאים את ה-gRNA הלא מכוון או ה-eRNA המכוונים ל-gRNA וצלחת ~3,000 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות.
  2. מדוד את צמיחת התאים באמצעות הדמיית תאים חיים או שיטות אחרות (למשל, ספירת תאים, או בדיקת מלח טטרזוליום מסיס במים-1).
  3. השתמש בריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) כדי לבדוק את התגובות התאיות לתרופות סרטן ספציפיות בתאים עם או בלי ביטוי יתר של NET1e על ידי SAM15.
    הערה: תוצאות של בדיקות גדילת תאים ובדיקות רגישות לתרופות של תאי סרטן השד מוצגות לאחר ביטוי יתר של eRNA שתועתק בסמוך לגן NET1, המכונה NET1e15. בדיקות אחרות יכולות להתבצע ברמה התאית או האורגניזמית על סמך הצורך של כל פרויקט ספציפי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 ממחיש את זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקול זה. ההתמקדות שלנו הייתה ב-eRNA מייצג, NET1e15, המתבטא יתר על המידה בסרטן השד, שעבורו נעשה שימוש במערכת SAM כדי להפעיל ולחקור את תפקידה הביולוגי בוויסות ביטוי גנים, התפשטות תאים ותגובה לתרופות לסרטן...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בהתבסס על הנתונים שלנו, אנו מסיקים שמערכת ה-SAM מתאימה לחקר תפקידם של eRNA בוויסות פנוטיפים תאיים, למשל, גדילת תאים או עמידות לתרופות. עם זאת, תכנון gRNA קפדני נדרש להפעלת eRNA חזקה, מהסיבות הבאות. קודם כל, אתר התחלת השעתוק (TSS) של eRNA בכל שורה/סוגי תאים ספציפיים נשאר פחות ברור. בשל כך...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ל-W.L (המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס, CPRIT RR160083 ו-RP180734; NCI K22CA204468; NIGMS R21GM132778; פרס הכוכבים של אוניברסיטת טקסס; וקרן וולש AU-2000-20190330) ומלגת פוסט-דוקטורט ל-J.L (UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program, CPRIT RP160015). אנו מכירים בפרסום המקורי15 שממנו אומצו חלק מהנתונים הנוכחיים שלנו (עם שינויים), העוקב אחר רישיון Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BlasticidinGoldbioB-800-100
BsmBI restriction enzymeNew England BioLabs Inc.R0580S
Cas9 mAbActive Motif61757Lot: 10216001
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BioLabs Inc.N0447S
Dulbecco’s Modified Eagle MediumCorning10-013-CM
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific65002
EDTAThermo Fisher ScientificBP118-500
EGTASigmaE3889
Fetal Bovine SerumGenDEPOTF0900-050
GlycogenThermo Fisher Scientific10814010
Hepes-KOHThermo Fisher ScientificBP310-100
Hexadimethrine BromideSigmaH9268
Hygromycin BGoldbioH-270-25
IGEPAL CA630SigmaD6750
IncuCyte live-cell imagerEssen BioScienceIncuCyte S3 Live-Cell Analysis System
lenti_dCAS-VP64_BlastAddgene61425
lenti_gRNA(MS2)_zeo backboneAddgene61427
lenti_MS2-p65-HSF1_HygroAddgene61426
LiCLSigmaL9650
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-500
NaClSigmaS3014
Na-DeoxycholateSigmaD6750
NaHCO3Thermo Fisher ScientificBP328-500
N-lauroylsarcosineSigma97-78-9
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070
PES syringe filterBASIX13-1001-07
Protease Inhibitor Cocktail TabletRoche Diagnostic11836145001
pSpCas9(BB)-2A-PuroAddgene62988
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabs Inc.M0491S
Q5 Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B9027S
Quick-DNA MiniprepZYMO ResearchD3025
Quick-RNA MiniprepZYMO ResearchR1054
Restriction enzyme bufferNew England BioLabs Inc.B7203S
RT-qPCR Detection SystemThermo Fisher ScientificQuant Studio3
SDSThermo Fisher ScientificBP359-500
SonicatorQsonicaQ800R2
Sso Advanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725274
Stbl3 competent cellThermo Fisher ScientificC7373-03
Superscript IV reverse transcriptThermo Fisher Scientific719000
Surveyor Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
T4 DNA LigaseNew England BioLabs Inc.M0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BioLabs Inc.B0202S
TE bufferThermo Fisher Scientific46009CM
Thermal cyclerBio-Rad LaboratoriesT100
ThermomixerSigma5384000020
ZeocinThermo Fisher Scientificant-zn-1p

References

  1. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  3. Kundaje, A., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  5. Heinz, S., Romanoski, C. E., Benner, C., Glass, C. K. The selection and function of cell type-specific enhancers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 144-154 (2015).
  6. Ong, C. T., Corces, V. G. Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-specific gene expression. Nature Reviews Genetics. 12 (4), 283-293 (2011).
  7. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  8. Grossman, S. R., et al. Systematic dissection of genomic features determining transcription factor binding and enhancer function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1291-1300 (2017).
  9. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  10. Li, W., Notani, D., Rosenfeld, M. G. Enhancers as non-coding RNA transcription units: recent insights and future perspectives. Nature Reviews Genetics. 17 (4), 207-223 (2016).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. Li, W., et al. Functional roles of enhancer RNAs for oestrogen-dependent transcriptional activation. Nature. 498 (7455), 516-520 (2013).
  13. Lee, J. H., Xiong, F., Li, W. Enhancer RNAs in cancer: regulation, mechanisms and therapeutic potential. RNA Biology. , 1-10 (2020).
  14. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  15. Zhang, Z., et al. Transcriptional landscape and clinical utility of enhancer RNAs for eRNA-targeted therapy in cancer. Nature Communications. 10 (1), 4562(2019).
  16. Chen, H., et al. A Pan-Cancer Analysis of Enhancer Expression in Nearly 9000 Patient Samples. Cell. 173 (2), 386-399 (2018).
  17. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  18. Lubelsky, Y., Ulitsky, I. Sequences enriched in Alu repeats drive nuclear localization of long RNAs in human cells. Nature. 555 (7694), 107-111 (2018).
  19. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  20. Beerli, R. R., Segal, D. J., Dreier, B., Barbas, C. R. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erbB-2/HER-2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14628-14633 (1995).
  21. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  22. Hirai, H., Tani, T., Kikyo, N. Structure and functions of powerful transactivators: VP16, MyoD and FoxA. International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1589-1596 (2010).
  23. Lim, F., Spingola, M., Peabody, D. S. Altering the RNA binding specificity of a translational repressor. Journal of Biological Chemistry. 269 (12), 9006-9010 (1994).
  24. Schmitz, M. L., Baeuerle, P. A. The p65 subunit is responsible for the strong transcription activating potential of NF-kappa B. EMBO Journal. 10 (12), 3805-3817 (1991).
  25. Vihervaara, A., Sistonen, L. HSF1 at a glance. Journal of Cell Science. 127, Pt 2 261-266 (2014).
  26. Core, L. J., et al. Analysis of nascent RNA identifies a unified architecture of initiation regions at mammalian promoters and enhancers. Nature Genetics. 46 (12), 1311-1320 (2014).
  27. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  28. Benchling [Biology Software]. , Available from: https://benchling.com (2020).
  29. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  30. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nature Biotechnology. , (2020).
  31. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), e57998(2018).
  32. Al-Allaf, F. A., Tolmachov, O. E., Zambetti, L. P., Tchetchelnitski, V., Mehmet, H. Remarkable stability of an instability-prone lentiviral vector plasmid in Escherichia coli Stbl3. 3 Biotech. 3 (1), 61-70 (2013).
  33. Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  34. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  35. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).
  36. Quick-DNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_d3024_d3025_quick-dna_miniprep_kit.pdf (2020).
  37. SURVEYOR Mutation Detection Kit. IDT. , Available from: https://sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/user-guide-manual/surveyor-kit-for-gel-electrophoresis-user-guide.pdf?sfvrsn=a9123407_6 (2020).
  38. Quick-RNA Miniprep Kit. ZYMO. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1054_r1055_quick_rna_miniprep_kit.pdf (2020).
  39. SuperScript IV Reverse Transcriptase Product Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/SSIV_Reverse_Transcriptase_UG.pdf (2020).
  40. Ounzain, S., et al. Functional importance of cardiac enhancer associated noncoding RNAs in heart development and disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 76, 55-70 (2014).
  41. McCleland, M. L., et al. CCAT1 is an enhancer-templated RNA that predicts BET sensitivity in colorectal cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 639-652 (2016).
  42. Miao, Y., et al. Enhancer-associated long non-coding RNA LEENE regulates endothelial nitric oxide synthase and endothelial function. Nature Communications. 9 (1), 292(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RNAERNAsDCas9CRISPRRT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved