JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה לחימום בלסטוציטים אנושיים זגוגיים, איסוף אותם דרך תקופת ההשתלה במבחנה, לעכל אותם לתאים בודדים ואיסוף תאי trophoblast מוקדם לחקירה נוספת.

Abstract

השתלה אנושית, ההדבקה וההדבקה על אפיתליה פני הרחם והפלישה הבאה של blastocyst לתוך ההחלטה אימהית, הוא אירוע ביולוגי קריטי אך אניגמטי כי היה קשה מבחינה היסטורית ללמוד בשל מגבלות טכניות ואתיות. ההשתלה היא יזם על ידי הפיתוח של trophectoderm כדי trophoblast מוקדם ובדידול הבאים לתוך קווי משנה trophoblast ברורים. בידול trophoblast מוקדם חריג עלול להוביל לכשל השתלה, פתולוגיות שליה, חריגות עובר, הפלה. לאחרונה, פותחו שיטות המאפשרות לעוברים אנושיים לגדול עד היום ה-13 לאחר הפריה במבחנה בהיעדר רקמות אימהיות, פרק זמן המקיף את תקופת ההשתלה בבני אדם. זה נתן לחוקרים את ההזדמנות לחקור השתלה אנושית ולסיכום הדינמיקה של בידול trophoblast בתקופה קריטית זו מבלי לבלבל השפעות אימהיות והימנעות מכשולים טבועים ללמוד אירועי בידול העובר מוקדם ב vivo. כדי לאפיין תת-קוובלסטים שונים במהלך ההשתלה, אימצנו שיטות תרבות דו-ממדיות (דו-ממדיות) קיימות ופיתחו הליך לעיכול אנזימטי ולבודד סוגים שונים של תאי טרופוביסט לתאגידות במורד הזרם. עוברים תרבותיים בתנאים דו-ממדיים יש מורפולוגיה שטוחה יחסית עשוי להיות תת אופטימלי במידול בארכיטקטורות עובריות vivo תלת מימדי (3D). עם זאת, בידול trophoblast נראה פחות מושפע כפי שהוכח על ידי מורפולוגיה צפויה ושינויים ביטוי גנים במהלך תרבות מורחבת. קווי משנה שונים של trophoblast, כולל ציטוטרוהובלסט, סינכרון ו-trophoblast נודדים יכולים להיות מופרדים לפי גודל, מיקום והופעה זמנית, ולהשתמש בהם לאפיון נוסף או ניסויים. חקירה של תאים אלה trophoblast מוקדם עשוי להיות חיוני בהבנת השתלה אנושית, טיפול פתולוגיות שליה נפוצות, ולהקל על השכיחות של אובדן הריון.

Introduction

השתלה אנושית והוווים של שליה מוקדמת קשה מבחינה היסטורית לחקור ולהישאר ידוע במידה רבה כי רקמות אנושיות אינן נגישות בשלב זה כאשר ההריון הוא בלתי ניתן לגילוי קלינית. מודלים של בעלי חיים אינם מספקים, מכיוון של שליה אנושית יש מאפיינים ייחודיים משלה בהשוואה ליונקים אחרים. לדוגמה, שליה אנושית פולשת עמוק לתוך ההחלטה עם כמה תאים trophoblast להגיע לפחות את השלישי הפנימי של רירית הרחם בעוד תאים אחרים לאשט את העורקים ספירליים הרחם. אפילו אבותינו האבולוציוניים הקרובים ביותר, הפרימטים הלא אנושיים, מראים הבדלים במורפולוגיה שליה ובאינטראקציות טרופיות עם הרקמות המחליטותהאימהיות 1,,2,,3. קבלת עוברים אנושיים לפני ההשתלה במבחנה לא הייתה אפשרית עד בשנות ה-80 כאשר אדם קליני הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) התחיל כתרגול שגרתי לטיפולבפוריות 4. עכשיו, blastocysts אנושי יכול לגדול במבחנה כדי לאפשר את הבחירה של עוברים קיימא יותר להעברה, כמו גם לאפשר בדיקות גנטיות בטוחות. שיפור בטכניקות תרבות העובר, כמו גם את השימוש הגובר של הפריה חוץ גופית הניב blastocysts עודף רבים אשר נשאר לאחר מחזורי הטיפול של המטופל הושלמו. בהסכמת המטופל, אישור IRB, ועם הגבלות מסוימות, blastocysts אלה עשויים להיות מנוצלים למחקרים. הם הפכו למשאב יקר ערך ששימש לגירת תאי גזע עוברייםאנושיים 5, הבנת המעבר של מסת תאים פנימית לתאי גזעעובריים 6,7, ולאחרונה,כבר תרבותית בהצלחה עד היום (ד') 13 כדי לשפץ את ההשתלההאנושית 8,9. על ידי ניצול גישות omics תא יחיד שפותחו לאחרונה, הגישה לשלב השתלה אלה רקמות העובר האנושי הציע הזדמנויות ייחודיות לתאר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את תהליך הבידול תא דינמי מאוד זה, אשר בעבר לא ניתןהיה לחקור 10,11,12,13.

כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות בפרסום האחרון שלנו המאפיינות את הדינמיקה של בידול trophoblast במהלך השתלהאנושית 12. פרוטוקול זה כולל את ההתחממות של blastocysts זגוגית, תרבות עובר מורחבת עד D12 לאחר הפריה חוץ גופית, עיכול אנזימטי של העובר לתאים בודדים, ואיסוף תאים עבור נתונים במורד הזרם(איור 1). מערכת תרבות מורחבת זו תומכת בשלב פרי-השתלה התפתחות העובר האנושי ללא קלט אימהי וcapitulates בידול trophoblast המופיע בקנה אחד עם תצפיות שנעשו דגימות היסטולוגיות לפנישנים רבות לפני 14,15,16,17. במהלך ההשתלה, אוכלוסיית trophoblast מורכבת לפחות משני סוגי תאים: ציטורופובלסט כמו אב מונוז'יטורופובלסט (CTB) ואת הבדיל הסופני, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). עם עיכול trypsin, CTB הם קטנים, תאים עגולים כי הם מורפולוגית לא ניתן להבחין בין נסיונים אחרים של תאים(איור 2A,פאנל שמאלי). הפרדה של CTB מנושאים אחרים של תאים, כגון epiblast ו endoderm פרימיטיבי, ניתן להשיג על ידי פרופילים transcriptomic ברור שלהם גילה על ידי רצף RNA תא יחיד. ניתן לזהות בקלות תאים סנכרוניים כמבנים בעלי צורה לא סדירה, הגדולים משמעותית מסוגי התאים האחרים וממוקמים בעיקר בפריפריה של העובר (איור 2א,לוח אמצעי; איור 2ב', החלונית השמאלית). תאי טרופוביסט נודדים (MTB) הם קו משנה נוסף של trophoblast שנמצא במהלך תרבות מורחבת עובר, ניתן לזהותו כמתרחק לכאורה מן הגוף הראשי של העובר(איור 2A, פאנל ימני, איור 2B,פאנל ימני). trophoblast נודד, למרות הבעת רבים של סמנים זהה כמו trophoblast villous נוסף (EVT), לא צריך להיות מכונה EVT, מאז המבנים villous שליה לא הופיע בשלב מוקדם מאוד זה של פיתוח.

מבחינה ניסיונית, הצלחנו לאסוף CTB קטן STB גדול כי הם ניתן להבחין בקלות לאחר עוברים מתעכלים לתאים בודדים ב D8, D10, ו D12 (איור 2A,B). טרופוביסטים נודדים מתעוררים בשלבים מאוחרים יותר של תרבות העובר המורחבת ותוכל לאסוף אותם ב-D12 לפני עיכול אנזימטי של העובר כולו (איור 2א', ב). על ידי הפרדת שלוש קווי משנה אלה trophoblast לפני ניתוח תא יחיד, אנחנו יכולים לזהות סמנים תעתיק ספציפיים ולהגדיר את התפקיד הביולוגי של כל סוג תא. Cytotrophoblast הם משגשגים מאוד לפעול כתאי אב אדם באספקת תוחסין מובדיל STB ו MTB10,11,12,13. Syncytiotrophoblast מעורבים בייצור הורמוני שליה כדי לשמור על ההריון, עשוי להיות גם אחראי על העוברים חופרים לתוך ריריתהרית הים 10,,11,,12,,13. trophoblast נודד יש תכונות חזקות עוד יותר של פנוטיפ פולשני, נודד והם כנראה אחראים להתיישבות עמוקה ונרחבת יותר של ריריתהרחם הרחם 10,,11,12,,13. לאחר הגדרת החתימה transcriptomic של כל סוג תא, ניתוחי קיבוץ באשכולות חשפו גם שתי קבוצות משנה נוספות של תאים שלא ניתן להבחין מורפולוגית מ CTB והיה transcriptomes עם תכונות של STB ו MTB,בהתאמה 12. תאי שלב ביניים אלה הם כנראה בתהליך של הבדיל CTB או MTB או STB sublineages והיה להתעלם אם עוברים היו מתעכלים באופן עיוור ותאים הופרדו על ידי transcriptome לבד.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במערכת תרבות דו-ממדית (דו-ממדית) ולא יכול להיות אופטימלי לתמיכה בפיתוח מבני תלת מימדי (תלת-ממדי), כפי שהוצע בפרסום שפורסם לאחרונה המתאר מערכת תרבות תלת-ממדית שפותחהלאחרונה 13. אף על פי כן, במערכת דו-מית-מית-מית-ת- נראית כך שההבחנה של טרופהובלסט מוקדמת עולה בקנה אחד עם תצפיות שנעשו בדגימות vivo14,15,16,17. פרוטוקול זה עשוי גם להיות מותאם בקלות לשימוש במערכת תרבות 3D שתוארה לאחרונה13 עם שינויים מינימליים. כל הצעדים מתבצעים עם פיפטה מיקרו-מאניאלית ידנית עם טיפים חד-פעמיים זמינים מסחרית או פיפטת פה מפיפטת זכוכית נשלפת דק המחוברת לצינורות גומי, מסנן ופיה.

Protocol

כל העוברים האנושיים נתרמו בהסכמה לשימוש במחקר. פרוטוקולים לתרבות עובר אנושית מורחבת אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית המערבית (מחקר מס' 1179872) ובהתאם להנחיות הבינלאומיות. כל שימוש בעוברים אנושיים חייב להיבחן על ידי האתיקה המתאימה וגופים שלטוניים הקשורים למוסד המחקר באמצעות פרוטוקול זה.

1. הכנה

  1. הכן את אמצעי התקשורת והצלחות ההתאוששות יום אחד לפני התחממות העובר במכסה מנוע זרימה למינאר סטרילי.
    1. הכן 2 מ"ל של תקשורת תרבות blastocyst (BM) עם 10% v / v תחליף חלבון סרום (SPS).
      הערה: תקשורת תרבות Blastocyst עשויה להכיל או לא יכולה להכיל חלבון נוסף. כאן, השתמשנו במדיום שיש להשלים עם 10% של חלבון אלבומין שצוין. בדוק את ההנחיות של היצרן עבור וריאציה בתוסף זה. יש לסנן את כל המדיה באמצעות מסנן μM סטרילי 0.22 המחובר למזרק סטרילי לפני שיווי המשקל.
    2. מלאו שתי מנות לשטוף כלים של תרבות איברים עם 500 μL של BM עם 10% v/v SPS מכוסה ב-500 μL של שמן כיתה של תרבות העובר.
    3. בצלחת תרבות רקמות 60 מ"מ, שכבה 8 מ"ל של שמן תרבות העובר ולאחר מכן עוגן 20 μL טיפות של BM עם 10% v/v SPS לתחתית צלחת התרבות. בצע טיפה אחת עבור כל עובר חימם.
      הערה: ניתן יהיה לעשות יותר מדיה, טיפות וכלים לפי הצורך. ניתן להוסיף גם טיפות לצלחת לפני השמן הוא שכבות. עיגון טיפות תחת השמן יעזור להפחית אידוי וכל השינויים הבאים osmolality.
    4. שיוויון BM עם 10% v /v SPS לשטוף כלים וצלחת התאוששות ב אינקובטור ב 37 ° C, 6% CO2, 5% O2 עבור לפחות 4 שעות.
    5. להפשיר בקבוקון אחד של הצעד הראשון של מדיה תרבות מורחבת (IVC1) ב 4 ° C או על הספסל העליון.
    6. הכינו צלחת כביסה אחת של 500 μL של IVC1 ללא כיסוי שמן. Aliquot כ 4 מ"ל של IVC1 לתוך צינור 5 מ"ל הצמדה כובע.
    7. צלחת כביסה IVC1 Equilibrate וצינור הצמדה קטן של IVC1 ב 37 ° C, 6% CO2, ו אטמוספרי O2 לפחות 4 שעות.
  2. הכינו צלחות תרבות מורחבות יום אחד לפני התחממות העובר במכסה מנוע זרימה למינאר סטרילי.
    1. דילל פיברונקטין מנסיוב אנושי בתמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) כדי 30 μg / מ"ל. 250 μL של 30 μg / מ"ל פיברונקין לכל עובר יהיה צורך לכסות את התאים.
    2. פתח את 8 חבילת כיסויים קאמרית היטב מתחת למכסה המנוע תוך הקפיד לא לגעת בארות. בעדינות פיפטה 250 μL של 30 μg / מ"ל פיברונטין לתוך כל באר.
    3. מחזירים את המכסה לכיסויים הקאמריים וממקם ב-4°C למשך 20-24 שעות.
  3. הכינו צלחת תרבות מורחבת בבוקר של התחממות העובר.
    1. לאחזר את כיסויים קאמריים עם פיברונקטין והמקום בכיסוי המנוע זרימה למינאר. מוציאים את תערובת הפיברונקטין עם פיפטה של 1 מ"ל וזורקים לתוך מיכל הפסולת.
    2. אחזר חימום, מערך IVC1 מדיה מ קטן 5 מ"ל snap cap צינור.
    3. פיפט 300 μL של IVC1 equilibrated לתוך כל באר. היזהר לא לתת לכל נוזל לגעת במכסה כמו זה יגדיל את הסיכון לזיהום.
    4. להחזיר את הכיסויים התאים עם IVC1 כדי לדגור ב 37 °C, 6% CO2, ו אטמוספרי O2 עד להסרת zona pellucida בשלב 4.

2. התחממות עוברי D5 אנושיים זגוגיים

הערה: יצרנים אחרים עשויים להיות פרוטוקולים מעט שונים על פי טכנולוגיית זגוגית משלהם. עיין בהוראות היצרן לשימוש כאשר הדבר ישים.

  1. חם 3.0 מ"ל של פתרון הפשרה (TS) בצלחת 35 מ"מ עד 37 °C. להביא 300 μL של פתרון דילול (DS) ושתי בארות של 300 μL של תמיסת כביסה (WS) בצלחת 6 גם לטמפרטורת החדר.
  2. באמצעות מפסים, בזהירות להסיר את שרוול התקן cryo תוך הבטחה כי העובר זגוגי תמיד נשאר תחת חנקן נוזלי.
  3. הזז במהירות את התקן ההקפאה מחנקן נוזלי וצלל בקצה התקן ההקפאה ב-TS ב-37°C. הגדר טיימר למשך דקה אחת והגדר ההקפאה יהיה שקוע עד שהעובר יתנתק לתוך ה-TS.
    הערה: עוברים חמים אחד בכל פעם כדי לעקוב אחר זהויות העובר כפי שהם עשויים להתייחס למידע דמוגרפי המטופל בניתוח במורד הזרם.
  4. במהלך הדגירה של 1 דקות ב-TS, הסירו בזהירות את התקן ההקפאה והרים בעדינות את העובר ועוברים לצד הנגדי של צלחת ה-TS.
    הערה: אם תקבר עוברים מרובים, היו חרוצים כדי להפריד בין העוברים כדי להבטיח שזהויות נאותות יישמרו.
  5. לאחר 1 דקות, בעדינות להרים את העובר עם כמות קטנה של TS, כ 2 μL. להעביר את העובר לתחתית של 300 μL DS גם תוך כיסוי העובר בשכבה דקה של TS מן הפיפטה. קבעו טיימר למשך 3 דקות והיקבעו את הצלחת בעלת 6 הבארות על הספסל העליון בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר 3 דקות, להרים את העובר עם כמות קטנה של DS, כ 2 μL, ולהזיז את העובר לתחתית הבאר הבאה המכילה 300 μL של WS. שוב, בעדינות שכבה כמות קטנה של DS מן הפיפטה מעל העובר. הגדר טיימר במשך 5 דקות ולחזור לספסל העליון.
  7. לאחר 5 דקות, להרים את העובר עם נפח מינימלי של WS ולעבור לראש הבאר הסופית של 300 μL WS. העובר יפול באיטיות וישטוף את ה-WS לתחתית. לגרש כל WS נשמר מהפיפטה לבאר ריקה.
  8. להרים את העובר עם נפח מינימלי ולחזור לראש של אותו 300 μL באר של WS. העובר שוב ייפול לתחתית הבאר. הגדר טיימר למשך דקה אחת והחזר את צלחת 6-באר לראש הספסל.

3. שחזור עוברים חמים

  1. אחד בכל פעם, להעביר עוברים חמים לתוך צלחת רקמת איבר מרכז היטב המכיל 500 μL של BM שווה ערך עם 10% v/v SPS תחת 500 μL של שמן כיתה תרבות עובר שווה.
  2. לשטוף עוברים על ידי להרים כל עובר והעברתם סביב למספר אזורים בצלחת תוך פיצוץ מדיה ישנה בין מהלכים. להרים את העובר ולהזיז אותו בודדים 20 μL תרבות ירידה של BM equilibrated עם 10% v / v SPS תחת שמן.
  3. תנו לעוברים המחממים להתאושש למשך 2 שעות באינקובטור ב-37°C, 6% CO2, 5% O2.

4. הסרת

  1. לאחר החלמה של 2 שעות, להעריך עוברים להרחבה מחדש ולצלם כל עובר.
  2. להעביר עוברים בנפרד ב 500 μL של 3-(N-morpholino)-פרופנסולפונית חומצה (MOPS)-אגירה טיפול בינוני עם 5% (v /v) סרום עגל עוברי (FCS) לפני הטיפול עם הפתרון של טירוד חומצי.
  3. להעביר עובר אחד במהירות דרך 300 μL של הפתרון של טירוד חומצי חם תוך כדי צפייה פעילה דרך המיקרוסקופ. הזונה פלוצ'ידה תתחיל להתמוסס באופן חזותי. זה ייקח בערך 5 שניות.
  4. מיד להעביר את העובר עם המסת zona לתוך 300 μL של MOPS חימם אגירה בינוני כדי להרוות את הפתרון של החומצה Tyrode.
  5. להזיז את העובר עם נפח מינימלי של MOPS אגירה בינוני לתוך צלחת רקמת איברים במרכז גם המכיל 500 μL של BM equilibrated עם 10% v/v SPS תחת 500 μL של שמן כיתה תרבות עובר שיוויון לשטוף.
  6. להחזיר את העובר לירידה 20 μL התאוששות מ שלב 3.2.
    הערה: בבדיקה חזותית לאחר הסרת zona, כל עובר עם pellucidae נשמר עשוי להיות מטופל עוד יותר עם הפתרון של Tyrode חומצי במידת הצורך, על ידי חזרה על שלבים 4.2-4.6. מזעור החשיפה לפתרון של Tyrode הוא רצוי.

5. תרבות מורחבת של בלאסטוקיסט

  1. העבר את העוברים בנפרד לצלחת הכביסה עם מדיה IVC1 equilibrated מ שלב 1.1.6. בזהירות להעביר עובר אחד לבאר אחת של כיסויים קאמריים עם IVC1 equilibrated ולשמור על זיהוי העובר.
    הערה: יש לסיים שלב זה במהירות האפשרית כדי למזער אידוי בינוני.
  2. החזר כיסויים קאמריים לאקובטור המוכן ל-37°C, 6% CO2, Oאטמוספרי O 2 למשך יומיים.
    הערה: הקפד להפשיר ולהשיל מדיה ב- 37 °C, 6% CO2, Oאטמוספרי O 2 עבור חילופי מדיה 4 שעות מראש.
  3. ב outgrowth D2 (D7 לאחר הפריה), לבחון בקפידה את ההחזקה של עוברים תחת המיקרוסקופ ולבצע חילופי מדיה.
    1. שים לב איזה עובר מחובר לצלחת לפני החלפת מדיה. הקש בעדינות על הצלחת ובדוק אם העובר מחובר היטב לצלחת מתחת למיקרוסקופ.
    2. הסר את המכסה ולהסיר בזהירות 150 μL של IVC1 ולזרוק תוך כדי לא מפריע העובר המצורף. אם העובר עדיין לא מחובר לצלחת, אל תחליף את התקשורת, מכיוון שהסרום ב-IVC1 תסייע בחיבור העובר.
    3. פיפטה 150 μL של מדיה תרבות מורחבת equilibrated, IVC2, לאט לתוך כל באר ולהחזיר את המכסה כיסוי קאמרי.
      הערה: ודא שהסרת המכסה מהכיסויים הקאמריים ממוזערת כדי למנוע אידוי בינוני.
  4. החזר בזהירות את הכיסויים הקאמריים לאקובטור מבלי להתיז מדיה כלשהי על המכסה. חזור על חילופי מדיה וקובץ מצורף לבדוק כל יום של תרבות מורחבת עד העוברים מוכנים קיבעון או עיכול תא יחיד.

6. אוסף אופציונלי של מדיה שהושקעה

  1. לחלופין, לאסוף מדיה שהושקעה במהלך חילופי מדיה תרבות לאחר D7 או כל יום לאחר מכן. במהלך שלב 5.3.2, במקום להיפטר הצמד-להקפיא בינוני 150 μL של הוסר IVC1 לתוך סטרילי, נמוך לאגד 0.5 מ"ל צינור לניתוח עתידי.

7. קיבעון אופציונלי עבור אימונואורס

  1. השתמש 200 μL פיפטה לשטוף עוברים עם 1/2 חילופי מדיה של PBS עבור 3x לפני קיבעון כדי להסיר את כל פסולת חוץ תאית. שטיפת פסולת עודפת וחלבון תסייע לייעל את הבהירות ולהפחית את הרקע בתמונות המתקבלות עם חיסון.
  2. הסר את כל המדיה ולהוסיף לאט 200 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS לבאר. העובר ירצה להיצמד לפני השטח של הנוזל. 150 μL מרובים שוטפים עם 4% PFA לפני הסרת כל הנוזלים יעזור למזער כל נזק לעובר.
  3. דגירה העוברים ב 4% PFA במשך 20 דקות עבור קיבעון.
  4. לשטוף עוברים 3x במשך 10 דקות לכל שטיפה עם 200 μL של 0.1% v / v polysorbate 20 PBS טרי.
  5. לאחסן עוברים קבועים ב 0.1% v /v polysorbate 20 ב PBS ב 4 ° C לפני שנמשיך עם פרוטוקול immunofluorescence.

8. עיכול תא יחיד עם טריפסין

הערה: עוברים טריים (לא קבועים) משמשים לעיכול של תאים בודדים.

  1. לשטוף את העובר פעם אחת עם 200 μL של PBS ולהוסיף 200 μL של פתרון שלושה לכל באר. מחזירים את הכיסויים הקאמריים לאקובטור למשך 5 דקות.
  2. הסר את כיסויי הכיסוי הקאמריים מהאינקובטור ובדקו את העוברים תחת סטריאוטיפ. תאים בפריפריה של העובר יתחילו לסגת MTB עדיין צריך להיות מחובר לצלחת שבו הם ממוקמים מרחוק מן העובר.
  3. השתמש פיפטה קטנה או פיפטה פה משך דק כדי להרים MTB בודד לפני פירוק העובר כולו. דלג קדימה לשלב 9.1 כדי לשמור MTB ולחזור לשלב 8.4 לאחר שלב 9.3.
  4. השתמש פיפטה מיקרו-מאניפולציה כף יד או פיפטה הפה כדי לנתק בעדינות את העובר על ידי שאגן למעלה למטה.
  5. תאים יתחילו להתנתק מכל העובר. המשך לשאוף את העובר בעדינות ושוב ושוב באמצעות קצה פיפטה קוטר קטן יותר או פיפטה הפה עד העובר כבר דגירה במשך סך של 10 דקות ב trypsin.

9. בחירת תא יחיד ואוסף לדוגמה

  1. עם שלושה נסיפסין מינימלי, להעביר את התאים דיסוציאציה דרך שלוש טיפות לשטוף של 20 μL PBS + 0.1% polyvinylpyrrolidone (PVP) תחת שמן תרבות העובר עם טיפול לא לאבד את כל התאים.
  2. לאחר שטיפת התאים, השתמש בפיפטת זכוכית נשלפת דק כדי לבחור תא אחד. בזהירות פיפטה התא היחיד לתוך צינור סטרילי 0.2 מ"ל בכריכה נמוכה עם נפח מינימלי של PBS + 0.1% PVP.
  3. הצמדה להקפיא תאים בודדים בחנקן נוזלי (LN2),ולאחסן ב -80 °C לשימוש עתידי.

תוצאות

עוברים בריאים הפגינו המשך התפשטות במהלך תרבות מורחבת (איור 2B). עוברים חריגים החלו לסגת מהקצוות החיצוניים שלהם והתפוררו(איור 2C). מניסיוני, כ-75% מהעוברים היו מחוברים לתחתית המנה המצופה בפיברונקטין ב-48 שעות והחיבור גדל לכ-90% ב-72 שעות בתרבות. ההצלחה של חיבור העוב?...

Discussion

התפתחות הפרוטוקול לתרבות עוברים אנושיים באמצעות השתלה אפשרה למדענים לחקור תקופה לא ממופה בעבר בפיתוח8,9. כאן, אנו משתמשים במערכת תרבות מורחבת כדי לתרבות עוברים אנושיים וללמוד בידול trophoblast מוקדם לפני היווצרות שליה villous. השיטות המתוארות כאן מאפשרות לנו לאסוף ...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להכיר בחולים הרבים במרכז קולורדו לרפואת פוריות (CCRM) שתרמו באדיבות את העוברים שלהם למחקר. ברצוננו גם להודות קארן Maruniak ואת המעבדה הקלינית ב CCRM על עזרתם בעיבוד דגימות hCG, כמו גם סו מקורמיק וצוות אמבריולוגיה הפריה חוץ גופית קלינית שלה ב CCRM על עזרתם עם איסוף עובר, אחסון, מעקב, ותרומה. המימון סופק באופן פנימי על ידי CCRM.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
NORM JECT Luer Lock sterile syringeVWR53548-019Pack of 100
3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubatorThermo Fisher Scientific13-998-078
35 mm Corning Primaria tissue culture dishVWR62406-038Case of 500
5 mL snap cap tubeVWR60819-295Pack of 25
60 mm Corning Primaria tissue culture dishVWR25382-687Case of 200
6-well dishAgtech Inc.D18Pack of 1, 10, or 50
Acidic Tyrode's solutionMillipore SigmaT1788100 mL
Biotix 1250 µL pipette tipsVWR76322-156Pack of 960
Blast, blastocyst culture mediaOrigio8306001010 mL
Dilution SolutionKitazatoVT8021 x 4 mL
Disposable Borosilicate Glass Pasteur PipetsThermo Fisher Scientific1367820D5.75 in. (146mm); 720/Cs
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineMillipore SigmaD8537
Embryo culture paraffin oil OvOilVitrolife10029100 mL
Eppendorf PCR tubes 0.2 mLVWR47730-598Pack of 1,000
Eppendorf PCR tubes 0.5 mLVWR89130-980Case of 500
Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solutionMillipore SigmaF08951 mg
Gilson 1 mL PipettemanThermo Fisher ScientificF123602G1 Pipetteman 200-1000 µL
Gilson 20 µL PipettemanThermo Fisher ScientificF123602G1 Pipetteman 2-20 µL
Gilson 200 µL PipettemanThermo Fisher ScientificF123602G1 Pipetteman 50-200 µL
G-MOPS handling mediaVitrolife10129125 mL
Handling mediaOrigio8310006060 mL
Ibidi 8 well chambered coverslipIbidi8082615 slides per box
IVC1/IVC2Cell Guidance SystemsM11-25/ M12-255-5mL aliquots
K System T47 Warming PlateCooper Surgical23054
MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD MembraneFisher ScientificSLGVR33RSPack of 50
Mouth piecesIVF StoreMP-001-Y100 pieces
Oosafe center well dishOosafeOOPW-CW05-1Case of 500
Quinn's Advantage SPSOrigioART-301012x 12 mL
Rubber latex tubing for mouth piecesIVF StoreIVFS-NRL-B-55 ft.
StereomicroscopeNikonSMZ1270
Stripper tipsCooper SurgicalMXL3-27520/pk 275 µm
Thawing SolutionKitazatoVT8022 x 4 mL
The Stripper MicropipetterCooper SurgicalMXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher Scientific126040131 x 100 mL
Tween20Millipore SigmaP1379-25ML25 mL bottle
VWR 1-20 µL pipette tipsVWR76322-134Pack of 960
VWR 1-200 µL pipette tipsVWR89174-526Pack of 960
Washing SolutionKitazatoVT8021 x 4 mL

References

  1. Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , 41-47 (2007).
  2. Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
  3. Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
  4. Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  6. O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
  7. O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
  8. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  9. Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
  10. Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
  11. Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
  12. West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
  13. Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
  14. Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
  15. Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
  16. Carnegie Institution of Washington. . Contributions to embryology. , (1915).
  17. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
  18. Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160trophoblast

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved