JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים שיטה להקלטת תגובות חשמליות אור-עורר של אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בעכברים באמצעות טכניקה המכונה DC-ERGs שתואר לראשונה על ידי מרמורשטיין, Peachey, ועמיתים בתחילת שנות ה-2000.

Abstract

אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) הוא מונו-שכבתית מיוחדת של תאים הממוקמים אסטרטגית בין הרשתית לבין choriocapillaris לשמור על הבריאות הכוללת ושלמות מבנית של photoreceptors. RPE הוא מקוטב, מציג קולטנים או ערוצים הממוקמים באופן אפי ובסיסי, ומבצע הובלה וקטורית של מים, יונים, מטבוליטים, ומפריס מספר ציטוקנים.

במדידות vivo לא פולשניות של פונקציית RPE ניתן לבצע באמצעות ERGs זהביים (DC-ERGs). המתודולוגיה שמאחורי DC-ERG הייתה חלוצה של מרמורשטיין, פיצ'י ועמיתיו באמצעות מערכת הקלטת גירויים מותאמת אישית, ומאוחר יותר הדגימה באמצעות מערכת מסחרית זמינה. טכניקת DC-ERG משתמשת נימים זכוכית מלא תמיסת מלח חוצץ של האנק (HBSS) כדי למדוד את התגובות החשמליות האיטיות יותר של RPE נבע משינויי ריכוז אור-עורר בחלל subretinal עקב פעילות פוטורסקטור. הגירוי האור הממושך והאורך של הקלטת DC-ERG הופכים אותו לפגיע להיסחף ורעש וכתוצאה מכך לתפוקה נמוכה של הקלטות שותנות. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ואמינה לשיפור היציבות של ההקלטות תוך הפחתת רעש באמצעות לחץ ואקום כדי להפחית / לחסל בועות הנובעות outgassing של HBSS ומחזיק אלקטרודה. בנוסף, חפצים של קו מתח מושטחים באמצעות מותם מתח/מרכך מתח. אנו כוללים את פרוטוקולי גירוי האור הדרושים עבור מערכת ERG זמינה מסחרית, כמו גם סקריפטים לניתוח רכיבי DC-ERG: c-wave, תנודות מהירות, שיא אור ותגובה כבויה. בשל הקלות המשופרת של הקלטות וזרימת עבודה של ניתוח מהיר, פרוטוקול פשוט זה שימושי במיוחד במדידת שינויים הקשורים לגיל בתפקוד RPE, התקדמות המחלה, ובהערכה של התערבות תרופתית.

Introduction

אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) הוא שכבת מונו-שכבתית של תאים מיוחדים הקו החלק האחורי של העין ולהפעיל פונקציות קריטיות כדי לשמור על ההונואוסטזיסרשתית 1. RPE תומך פוטורצטופטורים על ידי התחדשות פיגמנט חזותי לכידת הפוטון שלהם בתהליך שנקרא מחזורחזותי 2, על ידי השתתפות phagocytosis מיורנלה שלסככה קצוות קטע חוץ 3, ובהובלה של חומרים מזינים ומוצרי חילוף חומרים בין photoreceptors choriocapillaris4,5. חריגות בתפקוד RPE בבסיס מחלות רשתית אנושיות רבות, כגון ניוון מקולריהקשור לגיל 6, amaurosis מולד של לבר7,8 ו ניוון מקולרי vitelliform הטוב ביותר9. כמו רקמות עיניים תורם לעתים קרובות קשה להשיג אך ורק למטרות מחקר, מודלים בעלי חיים עם שינויים גנטיים יכולים לספק דרך חלופית ללמוד את הפיתוח של מחלותרשתית 10,11. בנוסף, הופעתה ויישום הטכנולוגיה CRISPR cas9 מאפשרת כעת היכרות גנומית (נוק-אין) או מחיקות (נוק-אאוט) בתהליך פשוט, צעד אחד העולה על מגבלות של טכנולוגיות פילוחגנים קודמות 12. הפריחה בזמינות של דגמי עכברחדשים 13 מחייבת פרוטוקול הקלטה יעיל יותר כדי להעריך באופן לא פולשני את פונקציית RPE.

מדידה של התגובות החשמליות מעוררות האור של RPE ניתן להשיג באמצעות אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) טכניקה. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם הקלטות ERG קונבנציונליות המודדות את הפוטורה-ceptor (גל) ותגובות תא דו קוטבי (b-wave)14, DC-ERG יכול להגדיר כיצד מאפייני התגובה של RPE לשנות עם ניווןרשתית 15,16,17 אואם תפקוד RPE מקדים אובדן photoreceptor. פרוטוקול זה מתאר שיטה המותאמת מעבודתו של מרמורשטיין, פיצ'י ועמיתיו שפיתחו לראשונה את טכניקת DC-ERG16,18,19,20 ומשפרת את הרבייה וקלות השימוש.

קשה לבצע את הקלטת DC-ERG בשל זמן הרכישה הארוך (9 דקות) שבמהלכו כל הפרעה או הקדמה של רעש יכולים לסבך את הפרשנות של הנתונים. היתרון של שיטה חדשה זו הוא שהתוכנית הבסיסית מגיעה למצב יציב בתוך פרק זמן קצר יותר ומפחיתה את הסבירות שהחיה תתעורר בטרם עת מהרדמה ונוטה פחות להיווצרות בועות באלקטרודות של נימה.

Protocol

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים המתוארות בפרוטוקול המחקר בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש של המכון הלאומי לעיניים.

1. ייבוא פרוטוקולי גירוי אור עבור DC-ERG

הערה: בצע את ההוראות שלהלן כדי לייבא את פרוטוקולי גירוי האור עבור DC-ERG לתוכנת מערכת ERG(טבלת חומרים). הפרוטוקול מורכב מרווח זמן מראש 0.5 דקות, ואחריו שלב אור (10 cd /m2) במשך7 דקות, ומסתיים במרווח של 1.5 דקות לאחר גירוי. עוצמת האור של 10 cd/m2 (1 יומן10 cd/m2)נבחרה מאחר שהיא מעוררת כמחצית מהתגובה המקסימלית עבור כל הרכיבים של DC-ERG בעכברי WT18,21. גל c ותנודות מהירות הם עניין מיוחד כמו המקורות של תגובות חשמליות אלה מאופיינים היטב ניתן לבודד ונלמד עוד יותר במבחנה RPE מודלים (למשל, iPSC-RPE). היישום של עוצמות אור אחרות יכול לחלץ מידע נוסף, למשל, התגובה כבוי עובר היפוך של קוטביות בגירויים אור בהיר יותר עשוי להראות הבדלים בעוצמה שבה היפוך זה מתרחש. המשתמש חופשי לשנות את הגדרות עוצמת האור לפי שיקול דעתו.

  1. פתח את תוכנת מערכת ERG.
  2. לחץ על מרכז מסד הנתונים.
  3. לחץ על חדש (ספק שם קובץ מסד נתונים חדש). לחץ על שמור. התיבה המוקפץ תוצג: "מסד הנתונים נוצר, האם ברצונך להתחבר לקובץ מסד הנתונים החדש." לחץ על כן. שם מסד הנתונים הנוכחי אמור לשקף כעת את שם הקובץ החדש.
  4. לחץ על העבר בחלון מרכז בקרת מסד הנתונים.
  5. בחר קובץ משלים 1: LightProtocols - TRANSFER. EXP. לחץ על פתח.
  6. לחץ על סגור (מרכז בקרת מסד נתונים) עם השלמת שורת ההתקדמות.
  7. לחץ על לחצן התחל הירוק.
  8. לחץ על חדש בחלון בחר מטופל. צור שם משפחה חדש של מטופל המתאר את מודל העכבר, הזן את תאריך הלידה (DOB, mm/dd/yyyy), החלף את לחצן המין (M/F) לתיאור המתאים. לחץ על סגור כדי לשמור את הפרטים הניסיוניים.
  9. לחץ על פרוטוקולים. פרוטוקולי ERG ו-DC-ERG המותאמים כהה צריכים להיות גלויים כעת.
  10. לבסוף, מקם את הקובץ Long Flash.col בתיקיה הבאה C:\ERG קבצי משתמש\Long Flash.col.

2. הכנת אלקטרודה נימה

  1. חותכים את נימים זכוכית 1.5 מ"מ לשניים באמצעות אריח קרמיקה(שולחן חומרים)כדי להבקיע את הזכוכית ולשבור אותם בצורה נקייה באמצעות שולחן כדי לספק כוח נגדי פיזי ולייצב את הזכוכית.
    הערה: קהה החתך מסתיים במידת הצורך.
  2. שימוש במבער בונזן(שולחן חומרים)מאפשרים לחום לעשות עיקול קטן בנימות תוך החזקתו מעל הלהבה במבערים.

3. מילוי אלקטרודות נימות

  1. חבר את מייבש הוואקום לקו הוואקום של המעבדה באמצעות מסנן בתוך השורה(Table of Materials).
  2. יוצקים 30 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) (טבלת חומרים) לתוך צינור חרוכי פתוח של 50 מ"ל והניחתו (עם המכסה הוסר) לתוך תא הוואקום.
  3. הפעל את הוואקום ותגה את ה-HBSS בעת הפעלת המחשב וציוד ההקלטה.
  4. לאחר 5\u201210 דקות לכבות את הוואקום ולהשתמש HBSS degassed למלא מזרק 12 מ"ל באמצעות מחט מחוברת 25 G. השתמש בו כדי למלא את הבסיסים של מחזיקי האלקטרודה לנקוט באמצעי זהירות נוספים לא להציג בועות.
    1. כך, הסר את מכסה הברגים המשופר והחלק בזהירות את מחט המזרק דרך אטם הגומי מסיליקון כדי להגיע לקיר האחורי (גלולת כלוריד כסופה/כסף) של המחזיק.
      הערה: כדורי כלוריד כסף/כסף הם יתרון על פני מחזיקים המשתמשים חוט כסף כפי שהם מספקים שטח פני השטח יותר וכתוצאה מכך קו בסיס יציב רעש נמוך. עם זאת, כדורי כלוריד כסף/כסף דורשים ממשק נוזלי ללא בועות אוויר כדי להשיג חיבור טוב. לכן, הקמרץ מאוד לא להציג בועות אוויר במהלך תהליך זה.
    2. בהדרגה להזריק HBSS למלא את כל microelectrode תוך נסיגה איטית של מחט המזרק. לחבר מחדש את המכסה משורשרש אך לא להדק. הכנס מחדש את מחט המזרק כדי למלא את החלל הריק בתוך המכסה עם HBSS. לאחר מכן מלא את נמת הזכוכית תוך החזקתו אופקית כדי למנוע פתרון לברוח מהצף השני.
    3. החזק את נמת הזכוכית מהקצוות הכפופים והכנס באיטיות את הקצה הנגדי דרך המכסה המשוחרר ולאחר מכן הדק את מכסה הבורג למקומו.
      הערה: אלקטרודות זכוכית מלאות HBSS לשמור על סיכוך של עין העכבר ולמנוע התייבשות קרנית שתתרחש עם השימוש אלקטרודות לולאת זהב סטנדרטית.
  5. מקם את מחזיקי האלקטרודה עם אלקטרודות נימי מוטה כלפי מעלה כדי לאפשר בועות לזרום החוצה. הפעל את הוואקום במשך 5\u201210 דקות לדגה. גז שנמלט ממשטחי הזכוכית והפלסטיק ידחוף את HBSS החוצה ממחזיקי האלקטרודה.
  6. עצור ולאחר מכן שחרר לאט את הוואקום. למלא מחדש את מחזיקי האלקטרודה ונימים זכוכית כמתואר קודם לכן.
    הערה: בועות נוטות לאסוף על או ליד אטם גומי סיליקון והוא יכול גם להסתיר חריצים של הכובע משורשר, ולכן יש לשלם תשומת לב מיוחדת כדי לשמור על אזורים אלה ללא בועות.
  7. התקן ואבטח את מחזיק המיקרואלקטרודה לתוך מעמד משותף T-clip/Magnetic מפרק בהתאמה אישית(איור 1A,inset). כדי להפוך את מעמד מותאם אישית עבור מחזיק microelectrode, לשנות T-clip (5/16"-11/32"צינורות OD) #8 (טבלת חומרים) על ידי הסרת קליפים polyacetal שחור בצד אחד. יש בסיס הצילינדר של מפרקים הכדור המגנטי במכונה לשניים כדי להתאים את הגובה(טבלת חומרים). אבטחו את ה-T-קליפים ששונו לברגי ההרכבה של הכדור המגנטי עם אגוזים בגודל M3.
  8. מניחים את מחזיק המיקרואלקטרודה בתוך ה-T-clip ששונה והחזקו אותו בחוזקה על-ידי החלקה בידית עץ מחודדת בגודל 1 אינץ' עשויה כתוצאה מבליל ניקוי מכותנה(Table of Materials)בזווית. השתמש בבסיס הצילינדר הנדיר של מגנט כדור הארץ כדי למקם באופן מאובטח את מעמד מחזיק האלקטרודה המותאם אישית על לוח המתכת של הבמה ומאפשר סיבוב של 360° על ציר של 180°.

4. אלקטרודות בדיקה

  1. יוצקים HBSS לתוך מיכל קטן (למשל, הכובע של צינור חרלי 50 מ"ל).
  2. מנמיכים בעדינות את המיקרואלקטרודות המורכבות במלואן, מלאות HBSS לתוך המכסה המכילה HBSS כדי לזן מראש את האלקטרודות ולמקם את האלקטרודה הקרקעית של המחט (זנב/רגל אחורית) ואת אלקטרודה ההפניה של Ag/AgCl (פה) באותו HBSS כדילהשלים את המעגל (איור 1A).
    הערה: בצע את כל השלבים הבאים תחת אור אדום עמום. השתמש בפנס באור אדום כדי למקם את העכבר ואלקטרודות נומי. זכור לכבות לחלוטין את כל מקורות האור לפני תחילת ההקלטה.
  3. בחר או צור מזהה מתאים (שם משפחה) כדי לתאר את העכבר לבדיקה ובחר בפרוטוקול DC-ERG שיש לבצע על-ידי השלמת הרישום בהתאם לסדר הבא.
    1. לחץ על פרוטוקולים. בחר DC-ERG. לחץ על הפעל. תיבת דו-שיח תוקפצת: "המטופל הנוכחי הוא XXX [DOB: XX/XX/XX) האם זה נכון עבור הבדיקה המבוצעת?" לחץ על כן. ואז המשך ל"שלב 1/6".
  4. סגור את הדלתות לכלוב פאראדיי.
  5. הצג מצב מכשול על-ידי לחיצה על מכשול וודא כי הערכים עבור הפניה הפה, זנב הקרקע, ואלקטרודות הקלטה מקובלים (ראה איור 1B).
  6. בדוק את היציבות הבסיסית (רעש והיסחף) על-ידי לחיצה על צעד (חץ קדימה) כדי לבחור שלב 4/6 "הבזק ארוך ללא אור".
    הערה: כמות הסחף שנצפתה כאשר האלקטרודות ממוקמות באמבט HBSS היא בדרך כלל פחות מ 500 μV לכל 80 s לאחר שהם התייצבו והוא שווה ערך להיסחף שנצפה כאשר האלקטרודות מחוברות לעכבר. לכן, הקריאה החשמלית של האלקטרודות באמבט HBSS היא אינדיקטור חשוב למצב האלקטרודות. הרעש, הנמדד כשיא לשיא, הוא בדרך כלל ~ 10\u201215% גדול יותר בעכבר מאשר באמבט HBSS. זה כנראה בשל תוספת של חפצי תנועה מלנשום.
  7. התחל להציג את המעקבים על-ידי לחיצה על תצוגה מקדימה. העקבות צריכות להיות רעש נמוך עם משרעת שיא לשיא <200 μV. סחיפה קלה (<500 μV/80 s) הדועכת בהדרגה לקו הבסיס מקובלת(איור 1C).

5. מיקום עכבר ואלקטרודה

  1. שמור את העכברים ללילה בקופסה מאווררת היטב עם תאורה הדוקה לעיבוד כהה.
  2. להניחות את בעלי החיים על ידי הזרקת תוך אפרטונל של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וxylazine (8 מ"ג/ ק"ג).
  3. להחיל ירידה של 0.5% proparacaine HCl topically כדי להרדים את הקרנית, כמו גם ירידה של 2.5% פנילפרין HCl ו 0.5% טרופיקמיד כדי להעכל את האישונים.
  4. לקצץ את שפם העכבר עם מספריים כדי למנוע עוויתות בשוגג מלהפריע אלקטרודות נומי הזכוכית במהלך ההקלטה.
    הערה: פרוטוקול הגירוי DC-ERG בתוך מערכת ERG כולל מספר שגרות גירוי מובנות שניתן לבחור על-ידי לחיצה על צעד (חץ קדימה) או על Step (חץ אחורה). רק שלבים 1, 4 ו- 5 בתוכנה נדרשים כדי להכין ולבצע את הקלטת DC-ERG.
  5. בתוכנה של מערכת ERG ודא שהמטופל הנכון נבחר. לחץ על הכפתור הירוק פרוטוקולים. תחת תיאור פרוטוקול בחר DC-ERG. לאחר מכן לחץ על הפעל. ודא כי זהו הבדיקה הנכונה המבוצעת על-ידי לחיצה על כן.
  6. השתמש שלב 1/6 ייעודי אור אדום גירוי כדי להפעיל את האור האדום בתוך הכיפה כדי לעזור למקם את העכבר אלקטרודות תוך התבוננות בשינויים במכשול.
  7. מניחים את העכבר על שולחן הקלטה מחומם ומטהר בזהירות את עור הרגל האחורית באמצעות מפלצות. החזק את האלקטרודה של המחט בחוזקה ביד אחת והכנס אותה בתת עורות לתוך הרגל האחורית כדי לאבטח אותה למקומו.
  8. מניחים את האלקטרודה Ag/AgCl(טבלת חומרים)בתוך הפה, כך שהכתול המנוסס מונח לאורך הלחי האחורית ומוחזק במקום מאחורי השיניים.
    הערה: אלקטרודות חוט זהב לא צריך לשמש אלקטרודה התייחסות הפה כפי שיש להם מאפייני מכשול שונים ולהגדיל את רעש השיא לשיא.
  9. לפני הצבת אלקטרודות הנימים לעין העכבר, החזק את מחזיק האלקטרודה עם נימים זכוכית אנכי, הניף את מחזיק האלקטרודה עם האצבע המורה כדי להסיר את כל הבועות שאולי הוצגו. מלא את הקצה ב-HBSS באמצעות מחט 25 G המחוברת למזרק ובדוק כדי לוודא שאין בועת אוויר לכודה בקצה. מקם את מעמד מחזיק האלקטרודה כך שהקצה הפתוח של הנימים המלאים ב-HBSS יהיה במגע עדין עם הקרנית.
  10. השתמש באמצעי זהירות מיוחדים כדי להימנע מהחדרת בועות אוויר על-ידי החזקת מתקן הג'ל לעין הסיכה הפוך ולהיפטר הטיפות הראשוניות. מניחים טיפה של ג'ל עיניים סיכה על כל עין כדי לשמור על מוליכות ולמנוע הישבות במהלך ההקלטה.

6. הקלטת DC-ERG

  1. לחץ על צעד (חץ קדימה) כדי לבחור שלב 4/6 "פלאש ארוך ללא Li".
  2. לחץ על מכשול. השתמש במסך בדיקת מכשול כדי לבחון את ההתנגדות של העיניים השמאליות והיניות. ערכי המכשול עבור אלקטרודות ההקלטה בכל עין צפויים להיות דומים (~ 39 kΩ). ערכי המכשול הן עבור האלקטרודות הקרקע והן עבור אלקטרודות הפניה צפויים להיות פחות מ- 10 kΩ).
  3. לחץ על תצוגה מקדימה כדי להציג את העקבות עבור העין השמאלית והימנית. המתן להשגת תוכנית בסיסית יציבה (<10 דקות). לחץ על עצור כדי לצאת מתצוגה מקדימה של מעקב.
    הערה: שינויים פתאומיים בכיוון הסחף או רעש חריג בהקלטה לא ישתפרו עם הזמן וידרשו זיהוי האלקטרודה הנימה הדורשת תשומת לב. הסיבה הסבירה ביותר היא בועה שהוצגה לקצה האלקטרודה. למלא את הקצה עם HBSS. לחץ שוב על תצוגה מקדימה כדי לבדוק את התוכנית הבסיסית.
  4. לחץ על צעד (חץ קדימה) כדי לבחור שלב 5/6 "פלאש ארוך 10 cd 7 דקות."
  5. לחץ על הפעל כדי להתחיל את ההקלטה (איור 1D).

7. ייצוא נתונים

  1. בחר את "מטופל" (שם משפחה) המתאר את הקלטת העכבר שיש לייצא.
  2. לחץ על בדיקות ישנות.
  3. תחת תיאור פרוטוקול בחר DC-ERG. לחץ על לחצן עומס ירוק כדי לטעון את הנתונים שנרכשו בעבר.
  4. לחץ על צעד (חץ קדימה) כדי להתקדם לשלב 5/6 "פלאש ארוך 10 cd 7 דקות."
  5. לחץ על ייצוא.
  6. ספק את שם הקובץ (לדוגמה, שם קובץ.csv). שם קובץ חוקי חייב להתחיל באות, ואחריו אותיות, מספרים או מקפים תחתונים. אין להשתמש בתווים מיוחדים או במקף. תוכנית ניתוח הנתונים (DCERG_Analysis.exe) דורשת שערכי טבלה יעמוד בדרישות עבור שמות משתנים.
  7. מקם סימן ביקורת לצד טבלת נתונים. לצד מפריד, בחר כרטיסיה. מקם סימני ביקורת לצד אפשרויות (כותרות, אנכי), כלול הכל(שלבים, Chans, תוצאות), עמודות נתונים(תוכן, תוצאות, סריקות)ותבנית (קובץ).
  8. לאחר מכן לחץ על ייצוא (איור 1E). אפשרות זו שומרת את .csv הקובץ בתיקיה C:\Multifocal.

8. ניתוח נתונים

  1. הורד והתקן את מתקין זמן הריצה המתאים (טבלת חומרים)
  2. הורד והתקן את DCERG_Analysis.exe ההתקנה.
    הערה: פעולה זו מתקינה את קובץ ה-script שיבצע את הניתוח של רכיבי DC-ERG ויוצר קיצור דרך כדי להפעיל את התוכנית בתיקיה תפריט התחלה.
  3. לחץ על קיצור הדרך שנוצר בתפריט התחלה > תיקיה תוכניות.
  4. בחר את קובץ הנתונים או הקבצים המיוצאים (*.csv) לניתוח. השתמש Ctrl + לחץ שמאלה על העכבר כדי לבחור יותר מקובץ אחד.
    הערה: קובץ ההפעלה יוצר שני סוגים של התוויות: 1) הנתונים הגולמיים מתווים עם קו התאמה הטוב ביותר המציין את הסחף שנמדד; 2) התגובה הנסחיפה מתוקנת מתווה לאחר החלקה עם ממוצע נע (עם טווח של ~ 5 s). מתוך חלקה זו מזוהים המשרעתים והזמן לשיא של רכיבי DC-ERG: c-wave, תנודות מהירות, שיא אור ותגובה כבויה. לאחר מכן הנתונים מיוצאים בתבנית טבלה כדי להצטיין כאשר כל גיליון מתאים להקלטת עכבר אחרת. גליונות אלה הולכים אחרי שני גליונות סיכום: (i) משרעת DC-ERG מהודרת (mV); (ii) די.סי.אי.ג'י-ERG מורכב מזמן-לפסגות (תחילת אור, t = 0 דקות).

תוצאות

איור 2 הוא ערכת נתונים לדוגמה מעכברי miR-204 ko/ko cre/+ (KO מותנה) וסוג פראי (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ הם עכברים עם נוקאאוט מותנה של microRNA 204 באפיתל פיגמנט רשתית. עכברים אלה נוצרים על ידי חציית עכברי miR-204 (המיוצרים על ידי NEIGEF)22 עם עכברי VMD2-CRE23. MiR-204 מתבטא מאוד RPE שבו הוא מסדי...

Discussion

שלבים קריטיים

הקלטה טובה של DC-ERG דורשת אלקטרודות יציבות ללא בועות שיוצרות חפצים והסחף לא רצוי מכיוון שהן רגישות מאוד לשינויי חוץ וטמפרטורה. חיוני שערך בסיסי יציב יושג כאשר האלקטרודות ממוקמות בתמיסת האמבטיה של HBSS לפני שימשיך קדימה עם הקלטת העכבר. בועות קטנות נוטות ?...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות תוך-ממורל של NEI. המחברים מכירים בכנות את ד"ר שלדון מילר על ההדרכה המדעית שלו, ייעוץ טכני, ומומחיות בפיזיולוגיה ומחלות RPE. המחברים מודים למייגן Kopera וצוות טיפול בבעלי חיים לניהול מושבות העכבר, וד"ר Tarun בנסל, ריימונד ז'או, ויואן וואנג לתמיכה טכנית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ag/AgCl (mouth) ElectrodeWPI IncEP1Mouth reference electrode for mouse
Ceramic TileSutter InstrumentCTSUsed to cut the glass capillary tube to an appropriate size
Cotton Tipped Cleaning StickPuritan Medical Products867-WC No GlueTo be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly
Electroretinogram (ERG) SystemDiagnosys LLCE3 SystemVisual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials
Bunsen BurnerArgos TechnologiesBW20002460Or equivlaent to shape glass under flame
Glass Capillary Tube (1.5 mm)Sutter InstrumentsBF150-75For filling with HBSS and making contact to the cornea
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS)Thermo Fisher Scientific Inc14175-095Commercially available. Maintain at RT
In-Line FilterWhatman6722-5001To protect vacuum pump from aerosols
Low Noise Cable for Microelectrode HoldersWPI Inc5372Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies
Magnetic Ball JointWPI Inc500871For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage
MatLabMathworksMatLab: For editing the analysis software
MatLab Curvefit ToolboxMathworksToolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)
MatLab CompilerMathworksToolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)
MatLab Runtime version 9.5MathworksR2018b (9.5)Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html
Microelectrode Holders (45 degrees)WPI IncMEH345-15For holding the capillaries
Needle (25 ga)Covidien8881250313For filling the capillary tubes with HBSS
Needle (ground) ElectrodeRhythmlink13mm - one elctrodeSubdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)
Regulator/Power ConditionerFurmanP-1800Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line
Syringe (12 mL)Monoject1181200777For filling the capillary tubes with HBSS
T-clipCole-Parmer06852-20For electrode holder assembly
Vacuum DesiccatorBel-Art420120000Clear polycarbonate bottom & cover
Pharmacological treatment
Lubricant eye gelAlcon0078-0429-47Helps lubricate corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes
Phenylephrine Hydrochloride 2.5%Akorn17478-201-15Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
Proparacaine Hydrochloride 0.5%Akorn17478-263-12Local anesthetic for ophthalmic instillation
Tropicamide 0.5%Akorn17478-101-12Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)
XylazineAnaSedsc-362949RxAnalgesic and muscle relaxant
Zetamine (Ketamine HCl)VetOne501072Anesthetic for intramuscular injections

References

  1. Steinberg, R. H. Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina. Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).
  2. Sahu, B., Maeda, A. RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models. Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).
  3. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).
  4. Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. Ion channels in the RPE. Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).
  5. Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).
  6. Fletcher, E. L., et al. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).
  7. Gu, S. M., et al. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).
  8. Marlhens, F., et al. Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis. Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).
  9. Marmorstein, A. D., et al. the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Chang, B. Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases. Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).
  11. Collin, G. B., et al. Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss. Cells. 9 (4), (2020).
  12. Shrock, E., Güell, M. CRISPR in Animals and Animal Models. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).
  13. Smalley, E. CRISPR mouse model boom, rat model renaissance. Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).
  14. Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography. Bio Protocol. 7 (7), (2017).
  15. Zhang, C., et al. Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).
  16. Samuels, I. S., et al. Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse. Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).
  17. Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice. Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).
  18. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).
  19. Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram. Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).
  20. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  21. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).
  22. Zhang, C., et al. Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).
  23. Iacovelli, J., et al. Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).
  24. Wang, F. E., et al. MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology. FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).
  25. He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).
  26. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  27. Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR. Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).
  28. Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance". Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).
  29. Shahi, P. K., et al. Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology. Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).
  30. Li, Y., et al. Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage. Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

161DC ERGc wave

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved