ניתוח מערכות של התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטות לאפיון התגובה הנוירו-דלקתית וההמודינמית לפגיעה מוחית טראומטית קלה ולשילוב נתונים אלה כחלק מניתוח מערכות רב-משתניות תוך שימוש ברגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים.

Abstract

פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) הן בעיה משמעותית בבריאות הציבור. חשיפה חוזרת ונשנית ל-mTBI עלולה להוביל לליקויים תפקודיים מצטברים ועמידים לאורך זמן. מחקרים רבים של הקבוצה שלנו ושל אחרים הראו כי mTBI מגרה ביטוי ציטוקינים ומפעיל מיקרוגליה, מפחית את זרימת הדם המוחי ואת חילוף החומרים, ופוגע בתגובתיות כלי הדם במוח. יתר על כן, מספר עבודות דיווחו על קשר בין derangements בסמנים נוירו-דלקתיים והמודינמיים אלה לבין ליקויים קוגניטיביים. כאן נפרט שיטות לאפיון תגובת הרקמה הנוירו-דלקתית וההמודינמית ל-mTBI בעכברים. באופן ספציפי, אנו מתארים כיצד לבצע מודל ירידת משקל של mTBI, כיצד למדוד באופן אורכי את זרימת הדם במוח באמצעות טכניקה אופטית לא פולשנית הנקראת ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר, וכיצד לבצע בדיקה חיסונית מרובת Luminex על דגימות רקמת מוח כדי לכמת ציטוקינים וחלבוני פוספו-חלבונים אימונומודולטוריים (למשל, בתוך מסלולי MAPK ו- NFκB) המגיבים ומווסתים את הפעילות של מיקרוגליה ותאי חיסון עצביים אחרים. לבסוף, אנו מפרטים כיצד לשלב נתונים אלה באמצעות גישת ניתוח מערכות רב משתניות כדי להבין את הקשרים בין כל המשתנים הללו. הבנת הקשרים בין משתנים פיזיולוגיים ומולקולריים אלה תאפשר לנו בסופו של דבר לזהות מנגנונים האחראים על mTBI.

Introduction

סקירה
פגיעות מוח טראומטיות קלות (mTBIs) משפיעות על כ-1.6-3.8 מיליון ספורטאים בשנה¹. פציעות אלה, כולל פגיעות תת-זעזוע מוח וזעזוע מוח, עלולות להותיר את המטופלים עם תסמינים פיזיים, רגשיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים חולפים². יתר על כן, mTBI חוזר (rmTBI) מתמשך בתוך "חלון של פגיעות" יכול להוביל לחומרה מצטברת ולמשך של השלכות קוגניטיביות שנמשכות זמן רב יותר מההשפעות של mTBI יחיד בלבד³, ובסופו של דבר אפילו לאובדן קבוע של תפקוד ^4,5,6. למרות שחולים רבים מחלימים תוך פרק זמן קצר יחסית (<1 שבוע), 10-40% מהחולים סובלים מהשפעות ארוכות טווח יותר של mTBI במשך > חודש אחד, כאשר חלקם נמשכים עד שנה 3,7,8,9. למרות השכיחות הגבוהה וההשלכות המתמשכות של פציעות אלה, מנגנוני הפציעה אינם מובנים היטב ואין אסטרטגיות טיפול יעילות.

בהתחשב בשונות הגבוהה בתוצאות לאחר mTBI/rmTBI, אחד האתגרים בזיהוי טריגרים מולקולריים בשלב מוקדם מרקמה המתקבלים במחקרי mTBI/rmTBI סופניים הוא היעדר נתונים אורכיים המדגימים "קשרים מולקולריים חריפים" סופיים של טריגרים מולקולריים אלה לתוצאות ארוכות טווח יותר. כדי להתגבר על האתגר הזה, הקבוצה שלנו גילתה שזרימת דם מוחית מופחתת באופן חריף שנמדדה באופן חריף באמצעות כלי אופטי שנקרא ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר (DCS), מתואמת מאוד עם תוצאה קוגניטיבית ארוכת טווח יותר במודל עכבר של rmTBI¹⁰. באמצעות סמן ביולוגי המודינמי זה, הראינו כי לעכברים עם זרימת דם מוחית נמוכה באופן חריף (ובהרחבה, לתוצאה ארוכת טווח חזויה גרועה יותר) יש עליות חריפות במקביל באיתות פוספו עצבי הן במסלולי MAPK והן במסלולים NFκB, עלייה בביטוי העצבי של ציטוקינים פרו-דלקתיים, ועליות בביטוי של הסמן הפאגוציטים/מיקרוגליאליים Iba1¹¹ . נתונים אלה מצביעים על תפקיד אפשרי לאיתות פוספו-איתות עצבי, ביטוי ציטוקינים והפעלה מיקרוגליאלית הן בוויסות החריף של זרימת הדם במוח לאחר הפגיעה והן בהפעלת מפל איתות שמוביל לתפקוד לקוי של מערכת העצבים ולתוצאה קוגניטיבית גרועה יותר. להלן, אנו מפרטים את הגישה שלנו לחקור בו זמנית הן את הסביבה ההמודינמית והן את הסביבה הנוירו-דלקתית לאחר rmTBI וכיצד לשלב את מערכי הנתונים המורכבים הללו. באופן ספציפי, אנו מתארים נהלים לארבעה שלבים מרכזיים לגישה מקיפה זו: (1) מודל ירידת משקל של פגיעה מוחית טראומטית קלה, (2) הערכה של זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת, (3) כימות של הסביבה הנוירו-דלקתית, ו-(4) שילוב נתונים (איור 1). להלן, אנו מספקים מבוא קצר לכל אחד מהשלבים המרכזיים הללו כדי לעזור להנחות את הקוראים דרך הרציונל שמאחורי השיטות שלנו. שארית כתב היד מספקת פרוטוקול מפורט לכל אחד מהשלבים המרכזיים הללו.

מודל ירידת משקל של פגיעה מוחית טראומטית קלה
למרות שמודלים פרה-קליניים מצוינים רבים של פגיעה מוחית טראומטית קלה חוזרת על עצמה קיימים 12,13,14,15,16,17,18, אנו משתמשים במודל מבוסס ורלוונטי מבחינה קלינית של פגיעת ראש סגורה עם ירידת משקל. המאפיינים העיקריים של מודל זה כוללים (1) השפעה קהה של הגולגולת/הקרקפת השלמה ואחריה סיבוב בלתי מוגבל של הראש סביב הצוואר, (2) ללא פגיעה מוחית מבנית גלויה, בצקת, נזק למחסום דם-מוח, מוות חריף בתאים או אובדן כרוני של רקמת המוח, ו-(3) ליקויים קוגניטיביים מתמשכים (עד שנה) המופיעים רק לאחר פגיעות מרובות¹⁹ (איור 2).

הערכת זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת
ספקטרוסקופיית מתאם מפוזר (DCS) היא טכניקה אופטית לא פולשנית המודדת את זרימת הדם ^5,20,21. ב- DCS, מקור אור אינפרה-אדום קרוב ממוקם על משטח הרקמה. גלאי ממוקם במרחק קבוע מהמקור על פני השטח של הרקמה כדי לזהות אור שהתפזר ברקמה (איור 3). פיזור תאי דם אדומים נעים גורם לעוצמת האור שזוהתה להשתנות עם הזמן. מודל אנליטי פשוט המכונה תאוריית דיפוזיית המתאם משמש כדי לקשר את תנודות העוצמה האלה למדד של זרימת הדם (CBF_i, איור 4). למרות שיחידות ה-CBF_i (ס"מ²/s) אינן יחידות הזרימה המסורתיות (mL/min/100 g), מחקר קודם שנערך בעכברים הראה כי CBF_i נמצא בקורלציה חזקה לזרימת דם מוחית הנמדדת על ידי ספין עורקי שכותרתו MRI²¹.

לשם השוואה, מכשיר ה- DCS המשמש כאן נבנה בתוך הבית והוא מורכב מלייזר באורך קוהרנטיות באורך 852 ננומטר, מערך של 4 פוטודיודות מפולת ספירת פוטונים, ולוח מתאם אוטומטי בחומרה (טאו יחיד, 8 ערוצים, 100 ns זמן דגימה מינימלי)^21,22. הנתונים נרכשים באמצעות תוכנה תוצרת בית שנכתבה ב- LabView. ממשק החיות של המכשיר מורכב מסיבי מקור מרובי-מודים של 400 מיקרומטר (טווח אורכי גל של 400-2200 ננומטר, ליבת סיליקה טהורה, חיפוי קשיח של TECS) וסיבי גל של 780 ננומטר במצב יחיד (טווח אורכי גל של 780-970 ננומטר, ליבת סיליקה טהורה, חיפוי קשיח של TECS, 730 ± 30 ננומטר ניתוק מצב שני) במרווחים של 6 מ"מ זה מזה ומוטמעים בחיישן שחור מודפס בתלת-ממד (4 מ"מ x 8 מ"מ, איור 3).

כימות הסביבה הנוירו-דלקתית
אף על פי שדלקת עצבית מווסתת על ידי תהליכים תאיים מגוונים, שני מנגנונים רלוונטיים מרכזיים הם איתות חוץ-תאי על ידי ציטוקינים/כימוקינים ואיתות תוך-תאי על-ידי חלבוני פוספו. כדי לחקור את הסביבה הנוירו-דלקתית של המוח לאחר פגיעה, המוחות מופקים מעכברים, מיקרו-דיסקים, וציטוקינים/כימוקינים וחלבוני פוספו-חלבונים מכמתים באמצעות Luminex (איור 5, איור 6, איור 7). בדיקות אימונו-אסות משולבות של Luminex מאפשרות כימות סימולטני של אוסף מגוון של חלבונים אלה על-ידי צימוד של בדיקות אימונו-סורבנטיות הקשורות לאנזים (ELISAs) לחרוזים מגנטיים המתויגים באופן פלואורסצנטי. תגים פלואורסצנטיים מובהקים משמשים עבור כל חלבון בעל עניין, וחרוזים של כל תג מתפקדים עם נוגדן לכידה כנגד אותו חלבון מסוים. מאות חרוזים ללכידת כל חלבון מעורבבים יחד, מונחים בצלחת 96 באר, ודגירה עם דגימה. לאחר הדגירה לדוגמה, נעשה שימוש במגנט כדי ללכוד את החרוזים בבאר בזמן שהדגימה נשטפת החוצה. לאחר מכן, נוגדן לזיהוי ביוטינילציה נקשר לאנליט המעניין כדי ליצור כריך נוגדן-אנטיגן הדומה ל-ELISA מסורתי, אך כאשר ה-ELISA עבור כל חלבון מופיע על חרוז אחר המתויג באופן פלואורסצנטי. הוספת סטרפטווידין מצומד לפיקואריתרין (SAPE) משלימה כל תגובה. לאחר מכן, מכשיר לומינקס קורא את החרוזים ומפריד את האות לפי כל תג/חלבון פלואורסצנטי.

שילוב נתונים
בגלל המספר הגדול של אנליטים (למשל, ציטוקינים) שנמדדו במבחן לומינקס, ניתוח נתונים יכול להיות קשה לפענוח אם כל חלבון מכמת מנותח בנפרד. כדי לפשט את הניתוח וללכוד מגמות שנצפו בקרב אנליטים, אנו משתמשים בשיטת ניתוח רב-משתנית הנקראת רגרסיה של ריבועים מזעריים חלקיים (PLSR, איור 8)²³. PLSR פועל על ידי זיהוי ציר של משקלים המתאימים לכל חלבון שנמדד (כלומר, ציטוקינים או חלבוני פוספו, המכונים "משתנים מנבאים") המסבירים יחד בצורה אופטימלית את השונות המשותפת של החלבונים שנמדדו עם משתנה תגובה (למשל, זרימת דם מוחית). המשקולות מכונות "טעינות" ומורכבות לווקטור המכונה משתנה סמוי (LV). על ידי הקרנת (המכונה "ניקוד") של נתוני החלבון הנמדדים על כל אחד משני רכבי LVs, ניתן להתוות מחדש את הנתונים במונחים של רכבי LVs אלה. לאחר חישוב ה-PLSR, אנו משתמשים בסיבוב varimax כדי לזהות LV חדש שממקסם את השונות המשותפת בין תחזיות המדגם ל-LV ולמשתנה המנבא²⁴. גישה זו מאפשרת לנו להגדיר את LV1 כציר שעבורו מוסברת השונות הטובה ביותר של משתנה התגובה. LV2 ממקסם את השונות המשותפת בין משתנה התגובה לבין הנתונים השיוריים של LV1, שעשויים להיות קשורים לשונות ביולוגית או טכנית בין דגימות. לבסוף, אנו מבצעים אימות Cross Leave One Out (LOOCV) כדי להבטיח שמודל PLSR אינו תלוי במידה רבה בדגימה אחת²³.

בפרוטוקול זה, אנו מפרטים שיטות לאפיון תגובת הרקמה הנוירו-דלקתית וההמודינמית ל-mTBI. זרימת העבודה הכללית מתוארת באיור 1. בפרוטוקול זה, עכברים כפופים ל-mTBIs אחד או יותר באמצעות מודל של פגיעת ראש סגורה עם ירידה במשקל. זרימת הדם המוחית נמדדת לאורך לפני ובמספר נקודות זמן לאחר הפציעה. בנקודת הזמן של עניין לחקירת שינויים נוירו-דלקתיים, החיה מורדמת, והמוח מופק. אזורים מעניינים במוח מבודדים באמצעות מיקרו-דיסקציה ואז משקרים אותם כדי לחלץ חלבון. לאחר מכן משתמשים ב-Lysates הן עבור אימונו-אסים מרובבים של Luminex של ציטוקינים וביטוי פוספו-חלבון והן עבור כתם מערבי. לבסוף, מערך נתונים הוליסטי זה משולב באמצעות ניתוח רגרסיה חלקי של ריבועים לפחות.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי (IACUC) ופעלו בהתאם להנחיות NIH לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.

1. מודל ירידת משקל של פגיעה מוחית טראומטית קלה

1. הכן את הגדרת ירידת המשקל. הרכיבו מגן על משטח שטוח עם צינור מנחה באורך 1 מ' (קוטר פנימי של 2.54 ס"מ) מיושר אנכית (בדוק באמצעות רמה). השתמשו בבריח של 54 גרם (קוטר גוף בסיסי של 0.95 ס"מ, קוטר ראש של 2 ס"מ, אורך 10.2 ס"מ) לפגיעה.
2. מרדים עכבר בקצרה. לגרום לעכבר עם 4.5% איזופלורן ב-100% חמצן למשך 45 שניות. אשרו עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר תגובת צביטה בבוהן.
3. לגרום לפציעה.
   1. הסר במהירות את העכבר מהרדמה והנח את העכבר הנוטה למרכז קרום דק (11.2 ס"מ x 21.3 ס"מ רקמה).
   2. השתמש בשתי הידיים כדי להחזיק את הרקמה מתוחה עם העכבר נוטה על המרכז. אבטח את זנב העכבר מתחת לאגודל. מקם את ראש העכבר מתחת לצינור ההנחיה (איור 2).
   3. שחררו את הבריח מהחלק העליון של צינור ההנחיה אל ההיבט הגבי של ראש העכבר, במטרה לפגוע בין החלק האחורי של העיניים לקדמת האוזניים. עם הפגיעה, העכבר יחדור לרקמה, מה שיאפשר תאוצה מהירה של הראש סביב הצוואר (איור 2).
4. שחזור
   1. לאחר הפגיעה, הניחו את שכיבת העכבר על משטח חימום של 37 מעלות צלזיוס באוויר החדר. עקוב אחר ההחלמה במשך שעה אחת לאחר הפציעה. תוך שעה אחת, עכברים אמורים להיות מסוגלים לעשות אמבולציה כרגיל, למצוא מזון ומים, ולא להפגין ליקויים מוטוריים גסים.
      הערה: משככי כאבים אינם משמשים לאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים, אשר מוצדקת בשל ההשפעה המבלבלת של משכך כאבים על הפרמטרים של העניין (כלומר, זרימת דם מוחית, סמנים של דלקת). אובדן הכרה, המוגדר כזמן מההסרה מהרדמה ועד לזמן להחזרת רפלקס הימין, צפוי ונמשך בדרך כלל בין 20 שניות ל-3 דקות (טבלה משלימה 1). ניתן להבחין בפרקים קצרים (<30 שניות) של דום נשימה ו/או פעילות דמוית פרכוס, במיוחד לאחר פגיעות ראש חוזרות ונשנות במרווחים פעם ביום.
5. חזור על הפעולה לפי הצורך. פציעה זו עשויה לחזור על עצמה פעם ביום, בשבוע או בחודש. מספר הפציעות וריווח הפציעות תלויים בחומרת הפציעה הרצויה. בדרך כלל, אנו משתמשים בחמישה להיטים במרווחים פעם ביום כדי לגרום לליקויים חזקים בלמידה מרחבית ובזיכרון.
   הערה: מחקרים קודמים הראו כי חמש פגיעות במרווחים פעם ביום מספיקות כדי לגרום לליקויים בלמידה מרחבית ובזיכרון הנמשכים יותר משנה לאחר הפציעה ללא בצקת, דימום או פגיעה מבנית גלויה במוח¹⁹. עכברים נשקלים מדי יום ונמצאים במעקב צמוד אחר סימנים של התייבשות, ליקויים מוטוריים ואובדן תיאבון. אם מיובשים, עכברים מקבלים צ'או לח וזריקה תת עורית של 1 מ"ל של מלח פעם ביום. על מנת למנוע סבל מיותר וכדי להבטיח נקודת קצה הומאנית, עכברים מורדמים אם: התייבשות נמשכת או מחמירה >24 שעות טיפול מלוחים לאחר תת עורית, משקל הגוף יורד ביותר מ -20% מקו הבסיס שלפני הפציעה, ליקויים מוטוריים כגון סיבוב או גרירת כפות מופיעים ונמשכים >1 שעות לאחר הפציעה.

2. הערכת זרימת הדם המוחית באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת

1. רכישת נתונים של DCS
   1. מסירים שיער על הקרקפת. מכיוון ש- DCS עובד בצורה הטובה ביותר בהיעדר שיער, יש צורך להסיר פרווה על הראש לפני תחילת הניסויים. בדרך כלל, הסרת שיער נעשית 1-3 ימים לפני תחילת המחקר.
      1. לגרום לעכברים עם 4.5% איזופלורן ב-100% חמצן למשך 45 שניות ולשמור עם 1-2% איזופלורן ב-100% חמצן.
      2. לגלח את הראש בין העיניים לאוזניים. לאחר מכן, השתמשו בקרם דפילטורי כדי להסיר פרווה על הראש כמו באיור 3.
      3. אפשרו לבעל החיים להתאושש מהרדמה על כרית חימום ואז לחזור לכלוב.
   2. מדוד את זרימת הדם המוחית באמצעות DCS. כדי למזער ממצאי תנועה במהלך המדידה, חקור עכברים בהרדמה קצרה של איזופלורן.
      הערה: נטר באופן חזותי את הנשימה ואת תגובת הצביטה של הבוהן לאורך כל המדידות והתאים את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך כדי להבטיח עומק הרדמה עקבי. שינויים משמעותיים בעומק ההרדמה עשויים לשנות את זרימת הדם בהתחשב בהשפעות הווסמודולטוריות הידועות של איזופלורן²⁵.
      1. משרים עם 4.5% איזופלורן ב-100% חמצן למשך 45 שניות, ולאחר מכן שומרים עם 1.0-1.75% איזופלורן ב-100% חמצן. אשרו עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר תגובת צביטה בבוהן ונשימה תקינה (בין כ-60-80 נשימות לדקה).
      2. לאחר תקופה של 2 דקות של ייצוב, הניחו בעדינות את חיישן ה-DCS מעל ההמיספרה הימנית כך שהקצה העליון של החיישן האופטי יתיישר עם החלק האחורי של העין וצד החיישן יתיישר לאורך קו האמצע (איור 3). הניח יד על החיישן כדי להתגונן מפני אור החדר. רכוש 5 שניות של נתונים (רכישת 1 הרץ).
      3. מקם מחדש את החיישן מעל ההמיספרה השמאלית, וקבל 5 שניות של נתונים.
      4. חזרו על הפעולה 3 פעמים/המיספרה כדי להסביר את ההטרוגניות המקומית מתחת לפני השטח של הרקמה.
   3. שחזור
      1. מוציאים את העכבר מהרדמה ומניחים על כרית חימום.
      2. לאחר שהעכבר חוזר לרפלקס הימני שלו מחזירים אותו לכלוב.
2. ניתוח נתוני DCS
   1. בצע בקרת איכות ראשונית. כל מסגרת של נתוני DCS מורכבת מפונקציית תיקון אוטומטי בעוצמה מנורמלת שנמדדה (איור 4A) ומקצב ספירת פוטונים (kHz).
      1. כדי להסיר מסגרות נתונים עם תוצר תנועה משמעותי, בטל מסגרות נתונים שעבורן הערך הממוצע של זנב העקומה (כלומר, ) הוא > 1.005.
      2. כדי להסיר מסגרות נתונים עם יחס אות לרעש גרוע, בטלו מסגרות נתונים אם קצב ספירת הפוטונים שזוהו <-20 קילוהרץ.
   2. מיצוי מדד זרימת הדם במוח. באמצעות חיפוש fminsearch ב- Matlab, התאם כל מסגרת נתונים^{שנמדדה ב- i th} עבור CBF_i(i). הגבל את ההתאמות ל- , ומצא את הערך של CBF_i הממזער את פונקציית העלות הבאה:
      
      כאשר הסכום הוא מעל כל זמני ההשהיה הנמדדים, ו - הוא הפתרון ההומוגני האינסופי למחצה של משוואת דיפוזיית המתאם (איור 4B):
      
      כאן β הוא גורם קוהרנטיות שנקבע על ידי המערך הניסיוני, , , , , , R_eff = 0.493 עבור מדד רקמה משוער של שבירה של 1.4, ρ הוא 6 מ"מ, ו- μ_a ו- μ ^הם מקדם הספיגה והפיזור המופחת של הרקמה (ההנחה היא 0.25 ו- 9.4 לס"מ, בהתאמה^10,26,27).
      הערה: מכיוון β יכולים להשתנות כ- 10% לאורך זמן, התאם כל מסגרת נתונים עבור β ו- CBF_i בו-זמנית.
   3. בצע בקרת איכות משנית. בתוך כל חזרה (המורכבת מ-5 מסגרות נתונים), יש להשליך חריגות. חריגות מוגדרות כערכים אלה של CBF_i החורגים מ-1.5 סטיות תקן של ה-CBF_i הממוצע עבור חזרה זו. אם מזוהה יותר מנקודת נתונים אחת כחריגה, בטל את החזרה כולה.
   4. הערך את מדד זרימת הדם המוחית הממוצע: הערך ממוצע של CBF_i לחצי כדור על-ידי לקיחת הממוצע בכל מסגרות הנתונים עבור כל החזרות (איור 4C). אם לא נצפו הבדלים משמעותיים בהמיספריה, ממוצע על פני חצי כדור כדי לקבל הערכה של CBF_i גלובלי ממוצע.

3. כימות מרובה של ציטוקינים וחלבוני פוספו באמצעות מבחני לומינקס

1. מיצוי רקמות
   הערה: כימות של ציטוקינים במוח וחלבוני איתות פוספו באמצעות Luminex דורש מיצוי רקמות.
   1. מרדים עכבר באמצעות 4.5% איזופלורן ב-100% חמצן למשך 1-2 דקות. בדוק אם יש מישור עמוק של הרדמה באמצעות היעדר תגובת צביטה בבוהן. המתת חסד באמצעות עריפת ראשים.
   2. לקצור את הרקמה.
      1. הסר את המוח. בדרך כלל, קבעו את ההמיספרה השמאלית עבור היסטולוגיה וחתכו כמה אזורים מההמיספרה הימנית בתוך קליפת המוח וההיפוקמפוס (איור 5).
      2. מניחים דגימות מנותחות בצינורות מיקרו-סנטריפוג', קופאים בהבזק בחנקן נוזלי. לצורך ניתוח של חלבונים רגישים להקפאה, מומלץ לחלק את מקטעי הרקמות לפני הקפאת הבזק כדי למנוע הפשרה מאוחרת יותר של הקפאה.
         הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול, ולאחסן דגימות רקמות בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עד שהן מוכנות לדגימות. לחלופין, ניתן לשקר דגימות ולאחר מכן לאחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   3. דוגמאות ליזה.
      1. הכינו את מאגר הליזיס על ידי הוספת מעכב פרוטאז ו-2 mM פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד למאגר הליזיס.
      2. הוסיפו 150 μL של מאגר הליזיס המעורב לכל כ-3 מיקרוגרם של רקמת בעלי חיים. לשם השוואה, דגימות רקמת קליפת המוח הראייתית של העכבר הן כ-3 מיקרוגרם.
      3. כדי להפוך את הרקמה להומוגנית, טריטורציה מכנית של הרקמה על ידי צנרת למעלה ולמטה ~ 15-20 פעמים באמצעות פיפטה של 1000 μL. עבור טריטורציה מדגם אופטימלי, ניתן להשתמש במזיק הומוגנייזר.
      4. הניחו את צינורות הדגימה על מסובב למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
      5. צנטריפוגה של הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בערך 15,000 x g, ואסוף את הסופרנטנט. ניתן לעבד דגימות באופן מיידי או לאחסן אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח נוסף.
         הערה: ליזטים לדוגמה שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה תואמים לכתם מערבי, שממנו ניתן לנתח את הסמן הפאגוציטים/מיקרוגליאלי Iba1 ו/או את סמן הפעלת האסטרוציטים GFAP כדי להשלים את ניתוח הציטוקינים והפוספו-חלבונים למחקרי דלקת עצבית¹¹.
2. פרוטוקול בדיקה חיסונית מולטיפלקס עבור ציטוקינים וחלבוני פוספו
   הערה: למרות שהם דומים באופן כללי, ישנם כמה הבדלים קלים בפרוטוקולים לערכות ציטוקינים ופוספו-חלבונים. הבדלים מצוינים בכל שלב. השלבים להכנת דוגמאות למבחן Luminex מתוארים להלן.
   1. הכנת ריאגנטים (יום 1, זהה לגבי ציטוקינים וחלבוני פוספו)
      1. אפשרו לריאגנטים להתחמם לטמפרטורת החדר (כ-30 דקות).
      2. בקבוק חרוזים מגנטיים של סוניקט מולטיפלקס למשך 30 שניות ואחריו דקה אחת של מערבולת. ודא שחרוזים מגנטיים מרובי מולטיפלקס מוגנים מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום או השתמש בבקבוקי מגן קלים המסופקים.
      3. הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב של 0.1% Tween20 ב-1xPBS או לחלופין השתמשו במאגר הכביסה המסופק בערכה.
   2. הכנת דגימות רקמה שעברו ליזוז (יום 1, אותו הדבר לגבי ציטוקינים וחלבוני פוספו)
      1. אם הוקפאו בעבר, הסירו דגימות רקמות שוכבות מהמקפיא ואפשרו להפשיר על קרח (כ-20 דקות). דגימות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 9,167 x g כדי להסיר משקע.
      2. הכן 25 μL של דגימה בריכוז החלבון האופטימלי שנקבע על ידי ניתוח הטווח הליניארי (ראה סעיף 3.3). כדי לנרמל את הנפח הכולל של כל הדגימות, דיללו דגימות במאגר הבדיקה המסופק בערכה.
   3. הכנת צלחת 96 באר (יום 1, זהה עבור ציטוקינים וחלבוני פוספו)
      1. השתמשו בצלחת הבאר 96 הכלולה בערכה או בצלחת עם תחתית דקה (למשל, Brand Tech).
      2. מוסיפים 200 μL של מאגר שטיפה (או 1x PBS, 0.1% Tween) לכל באר ומערבבים על שייקר צלחת במשך 10 דקות ב-750 סל"ד.
      3. יש לשטוף את המאגר ולהקיש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר שאריות.
   4. הליך אימונואסאי עבור ציטוקינים (יום 1)
      1. הוסף את הדברים הבאים לכל באר לפי הסדר.
         1. הוסף 25 μL של מאגר בדיקה לכל הבארות.
            1. הוסף 25 μL של מאגר בדיקה נוסף בלבד לבארות רקע. עבור כל ריצת ניסוי, יש לפחות שתי בארות רקע. בבארות רקע אין טעינת דגימה והן מגדירות את עוצמת הפלואורסצנט הנקראת על ידי המכשיר ללא דגימה.
            2. הוסף 25 μL מכל דגימה מדוללת לבארות דגימה מתאימות.
            3. הוסיפו 25 μL של 1x חרוזים מגנטיים מרובבים לכל הבארות (איור 6). הקפידו לסובב חרוזים במשך דקה אחת לפני שתוסיפו לבארות.
      2. אוטמים צלחת עם איטום צלחת ומכסים את הצלחת בנייר אלומיניום. אינקובציה למשך הלילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
   5. הליך בדיקה חיסונית לציטוקים (יום 2)
      1. הניחו לוחית קידוח 96 על המפריד המגנטי, וודאו שהבארות מיושרות עם המגנטים. בואו נשב 2 דקות. נקו את תכולת הבאר בזמן שהצלחת עדיין מחוברת למפריד המגנטי.
      2. יש לשטוף את הצלחת פעמיים באמצעות השלבים הבאים.
         1. הוסיפו 200 μL של חיץ שטיפה לכל באר והניחו על שייקר למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
         2. הניחו את לוחית הבאר על המפריד המגנטי למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
         3. תכולת הבאר של דקאנט בעוד לוחית הבאר עדיין מחוברת למפריד המגנטי.
      3. הוסיפו 25 μL של נוגדן זיהוי לבאר (איור 6). מכסים בנייר כסף. דגירה למשך שעה על שייקר צלחת (750 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      4. השאירו את נוגדן הגילוי בפנים והוסיפו 25 μL של סטרפטווידין-פיקוריתרין (SAPE) לכל באר (איור 6). מכסים בנייר כסף. דגירה למשך 30 דקות על שייקר צלחת (750 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      5. הניחו את צלחת הבאר על מפריד מגנטי ותנו לשבת במשך 2 דקות. דקאנט את תכולת הבאר והתנתקות מהמפריד המגנטי.
      6. יש לשטוף את הצלחת פעמיים (ראו שלב 3.2.5.2).
      7. הוסף 75 μL של נוזל כונן Luminex (אם אתה משתמש במכשיר MAGPIX) לכל באר או מאגר בדיקה (אם אתה משתמש במכשיר 200 או FlexMap 3D). להשעות מחדש חרוזים על שייקר צלחת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      8. קרא על מכשיר לומינקס (MAGPIX, 200 או FlexMap 3D), תוך התייחסות למדריך למשתמש לתפעול תקין (איור 6).
   6. הליך אימונואסאי לחלבוני פוספו (יום 1)
      1. הוסף את הדברים הבאים לכל באר לפי הסדר.
         1. הוסף 25 μL של מאגר בדיקה לכל הבארות.
            1. הוסף 25 μL של מאגר בדיקה נוסף בלבד לבארות רקע. עבור כל ריצת ניסוי, מומלץ שיהיו לפחות שתי בארות רקע. בבארות רקע אין טעינת דגימה והן מגדירות את עוצמת הפלואורסצנט הנקראת על ידי המכשיר ללא דגימה.
            2. הוסף 25 μL מכל דגימה מדוללת לכל באר דגימה.
            3. הוסיפו 25 μL של 1x חרוזים מגנטיים מרובבים לכל הבארות (איור 6).
               הערה: ערכת הבדיקה של Luminex מספקת חרוז מגנטי מולטיפלקס בתמיסת מלאי של 20x. הקפד לסובב 20x מלאי תמיסת חרוזים מגנטיים למשך 2 דקות, ולאחר מכן לדלל אותו במאגר הבדיקה לתמיסת 1x. וורטקס 1x תרחיף חרוז מגנטי מולטיפלקס למשך דקה אחת לפני הוספת בארות.
         2. אוטמים צלחת עם איטום צלחת ומכסים את הצלחת בנייר אלומיניום. דגירה למשך הלילה (12-16 שעות) בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
   7. הליך בדיקה חיסונית לחלבונים פוספו (יום 2)
      1. הניחו את לוחית הבאר על מפריד מגנטי, וודאו שצלחת הבאר מיושרת במלואה עם המפריד המגנטי. בואו נשב 2 דקות. תכולת הבאר של דקאנט בעוד לוחית הבאר עדיין מחוברת למפריד המגנטי.
      2. שטפו צלחת 2 פעמים (ראו שלב ב' בהליך החיסון של הציטוקינים ביום 2).
      3. דיללו את הנוגדן לזיהוי מלאי 20x לתמיסת 1x במאגר הבדיקה. הוסיפו 25 μL של נוגדן לזיהוי פי 1 לבאר (איור 6). מכסים בנייר כסף. דגירה למשך שעה אחת על שייקר צלחת (750 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      4. הניחו את לוחית הבאר 96 על המפריד המגנטי, והניחו לשבת במשך 2 דקות. תוכן הבאר של דקאנט, התנתק מהמפריד המגנטי.
      5. דילול 25x מניות SAPE במאגר בדיקה למאגר 1x. הוסף 25 μL של 1x SAPE (איור 6). מכסים בנייר כסף ודגירה למשך 15 דקות בשייקר צלחות (750 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      6. השאירו את ה-SAPE בבארות, והוסיפו 25 μL של מאגר הגברה לכל באר. מכסים בנייר כסף.
      7. דגירה למשך 15 דקות על שייקר צלחת (750 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
      8. הניחו את לוח הבאר על המפריד המגנטי למשך 2 דקות. דקאנט את תכולת הבאר והתנתקות מהמפריד המגנטי.
      9. הוסף 75 μL של נוזל כונן Luminex (אם אתה משתמש במכשיר MAGPIX) או מאגר בדיקה (אם אתה משתמש במכשיר 200 או FlexMap 3D). להשעות מחדש חרוזים על שייקר צלחת למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      10. קראו על מכשיר Luminex (MAGPIX, 200 או FlexMap 3D), תוך התייחסות למדריך למשתמש לתפעול תקין (איור 6).
3. ליניאריות של עקומת דילול הדגימה
   1. הכנת דגימות: דילול סדרתי של דגימות בדיקה עם ריכוז שונה של סך החלבון. עבור רקמות מוח בתפזורת, טענו דילולים סדרתיים מ-0-25 מיקרוגרם עבור ציטוקינים ו-0-12 מיקרוגרם עבור חלבוני פוספו. ניתן למדוד את ריכוז החלבון הכולל באמצעות בדיקת חומצה ביסינצ'ונינית (BCA).
   2. בדיקה חיסונית מרובת משתתפים: בצע את בדיקת לומינקס (ראה סעיף 3.2) על דגימות נבחרות.
   3. ניתוח נתונים
      1. התוויית עוצמה פלואורסצנטית עבור כל חלבון לעומת כמות החלבון הטעונה (איור 7).
      2. עבור כל אנליט, זהה טווח של סך החלבון הטעון שעבורו הקשר בין סך החלבון לבין קריאת העוצמה הפלואורסצנטית הוא ליניארי (איור 7).
      3. כדי לקבוע את כמות החלבון הכוללת שיש לטעון עבור ריצת הבדיקה המלאה, זהה את החלק הליניארי של העקומה עבור כל אנאליט ולאחר מכן בחר ריכוז חלבון שנמצא בטווח הליניארי עבור רוב האנליטים.
         הערה: למרות שרוב החלבונים חולקים טווח ליניארי דומה, ייתכן שהטווחים הליניאריים אינם חופפים לכל החלבונים. אם זה המקרה, ייתכן שיהיה צורך להריץ כל דגימה מספר פעמים עם כמויות שונות של חלבון כולל טעון. לחלופין, דגימות לא ליניאריות עשויות להישאר מחוץ לניתוח. בנוסף, ייתכן שלחלבונים מסוימים אין טווח ליניארי כלשהו.

4. רגרסיה חלקית של ריבועים לפחות

הערה: קוד R לדוגמה וגיליון אלקטרוני של נתונים לדוגמה מסופקים כדי לבצע את ניתוח הריבועים הפחות חלקיים.

1. הכנת נתונים: עצב את הנתונים כפי שמוצג בגיליון האלקטרוני של הנתונים לדוגמה שסופקו, "MyData". כלול שמות משתנים בשורה 1, שמות לדוגמה בעמודה A, משתנה התגובה בעמודה B וכל המשתנים המנבאים בעמודות C+. מלא את שתי השורות האחרונות בנתוני הרקע והגדר את שני השמות לדוגמה ל"רקע".
2. רגרסיה חלקית של ריבועים לפחות ב-RStudio
   1. התקן R מ- www.r-project.org (חינם, קוד פתוח).
   2. התקן את שולחן העבודה RStudio מ- www.rstudio.com (רישיון קוד פתוח בחינם).
   3. הורד את קוד R לדוגמה שסופק עם פרסום זה, "PLSR_Sample_Code.R" ושמור אותו באותה תיקיה המכילה את גיליון הנתונים. פתח את קובץ הקוד ב- RStudio.
   4. במקטע קלט משתמש , שנה את "dataFileName" לשם גיליון הנתונים.
   5. בצע את השלבים הבאים על-ידי הדגשת מקטע הקוד להפעלה ולחיצה על הפעל בפינה השמאלית העליונה של הסקריפט.
      1. טען חבילות R נחוצות, פונקציות, כתובת ספריית העבודה וערכי קלט משתמש ב- RStudio (תת-סעיף "ראשוניות").
      2. טען את הנתונים לתוך RStudio והכן נתונים גולמיים לעיבוד על-ידי חיסור אות רקע ממוצע מכל המדידות וניקוד z של כל אנאליט (תת-סעיף "קרא נתונים וחיסור רקע")(איור 8A).
      3. בצע רגרסיה חלקית של ריבועים לפחות ב- RStudio באמצעות חבילת plsRglm v1.2.5²⁸ הזמינה ברשת הארכיון המקיפה R (CRAN). בצע סיבוב varimax (חבילת סטטיסטיקה v3.6.2)²³ במישור LV1-LV2 כדי לזהות ציר אופקי חדש המפריד בצורה הטובה ביותר בין דגימות על ידי משתנה התגובה (תת-סעיף "PLS")(איור 8B).
      4. בצע אימות צלב השאר אחד בחוץ (LOOCV) שבו דגימה אחת נותרת באופן איטרטיבי מחוץ לנתונים ומודל PLSR מחושב מחדש. חישוב סטיית תקן עבור טעינות אנאליט בכל ריצות LOOCV (תת-סעיף "LOOCV").
3. יצירת עלילות מייצגות: הפעל את הקוד לדוגמה שסופק כמפורט לעיל כדי ליצור עלילות מייצגות המייצאות באופן אוטומטי כקבצי PDF לספריית העבודה (התיקיה המכילה את הנתונים וקבצי הקוד).
   1. צור מפת חום של הנתונים המעובדים כפי שמוצג באיור 8A (תת-סעיף "PLS"). צבע כל ערך לאורך ספקטרום המוגדר על ידי ציון z. מיון אנליטים לפי הסדר המחושב במשתנה הסמוי של הריבית.
   2. צור תרשים ניקוד עם ציוני LV1 המתווים לאורך הציר האופקי וציוני LV2 המשורטטים לאורך הציר האנכי, כפי שמוצג באיור 8B (תת-סעיף "PLS"). צבע כל נקודת נתונים בהתאם למדידת משתנה התגובה שלה כדי להמחיש את הקשר בין כל משתנה סמוי למשתנה התגובה.
   3. צור תרשים סרגל המציג טעינות עבור כל אחד ממשתני המנבא שלך כדי להמחיש כיצד כל אנאליט תורם למשתנים החבויים, כפי שמוצג באיור 8C (תת-סעיף "LOOCV").
   4. צור תרשים הנסוג של ציוני LV1 כנגד משתנה התגובה שלך כדי להמחיש עד כמה מודל PLSR מפריד בין הדגימות, כפי שמוצג באיור 8D (תת-סעיף "PLS").

תוצאות

נתונים שנאספו בעבר נלקחו מעבודות קודמות שבהן קבוצה של שמונה עכברי C57BL/6 היו נתונים לשלוש פגיעות ראש סגורות (איור 2) במרווחים של פעם ביום¹¹. בעבודה זו, זרימת הדם במוח נמדדה באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם מפוזרת 4 שעות לאחר הפציעה האחרונה (איור 3,

Discussion

כאן נפרט שיטות להערכת התגובה ההמודינמית והנוירו-דלקתית לפגיעה מוחית טראומטית קלה שחוזרת על עצמה. יתר על כן, הראינו כיצד לשלב נתונים אלה כחלק מניתוח מערכות רב משתניות באמצעות רגרסיה חלקית של ריבועים מזעריים. בטקסט שלהלן נדון בכמה מהשלבים והמגבלות המרכזיים הקשורים לפרוטוקול, כמו גם ביתרונ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjustable pipettes			any adjustable pipette
Aluminum foil	VWR	89107-726
Bio-Plex cell lysis kit	C Bio-Rad	171304012
BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile	BrandTech	781602 96
Complete mini protease inhibitor tablet	Sigma-Aldrich	11836153001
Depilatory cream	Amazon	Nair
DiH2O	VWR	VWRL0200-1000
Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates	Millipore Sigma Catalogue	40-285
Hardware Autocorrelator Board	www.correlator.com	Flex05-8ch
Isoflurane 250 mL	MED-VET INTERNATIONAL	RXISO-250
Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)	VWR	21905-026
Laboratory vortex mixer	VWR	10153-838
LabView	National Instruments	LabVIEW
Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software	Luminex Corporation
Luminex Drive Fluid	Luminex	MPXDF-4PK
Luminex sheath fluid	EMD Millipore	SHEATHFLUID
MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay	Millipore Sigma	MCYTMAG-70K-PX32
MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay	Millipore Sigma	48-660MAG
Mini LabRoller rotator	VWR	10136-084
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626-1G
Phosphate-buffered Saline (PBS)	VWR	97064-158
Plate Sealer	VWR	82050-992
Polypropylene microfuge tubes	VWR	20901-547
Mini LabRoller	Millipore Sigma	Z674591
Reagent Reservoirs	VWR	89094-668
R Programming Language
RStudio	www.rstudio.com
Sonicator
Titer plate shaker	VWR	12620-926
Tween20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
1 m acrylic guide tube	McMaster-Carr	49035K85
4 photon counting avalanche photodiode	Perkin-Elmer	SPCM-AQ4C-IO
400 um multimode source fiber	Thorlabs Inc.	FT-400-EMT
54 g bolt	Ace Hardware		0.95 cm basic body diameter, 2 cm head diameter, 10.2 cm length
780 nm single mode detector fiber	Thorlabs Inc.	780HP
852 nm long-coherence length laser	TOPTICA Photonics	iBeam smart