אספקה תוך-תוך-קרדיאלית מושהית של תאי גזע לאחר פציעת איסכמיה רפרציה במודל מורין

Summary

תאי גזע נחקרים ללא הרף כטיפולים פוטנציאליים עבור אנשים עם נזק שריר הלב, עם זאת, הכדאיות והשמירה שלהם ירד בתוך רקמה פצועה יכול להשפיע על היעילות שלהם לטווח ארוך. בכתב יד זה אנו מתארים שיטה חלופית למשלוח תאי גזע במודל מורין של פגיעה בהתרככיה.

Abstract

יש עניין משמעותי בשימוש בתאי גזע (SCs) להתאוששות של תפקוד הלב באנשים עם פציעות שריר הלב. הנפוץ ביותר, טיפול בתאי גזע לב נחקר על ידי אספקת SCs במקביל עם האינדוקציה של פגיעה בשריר הלב. עם זאת, גישה זו מציגה שתי מגבלות משמעותיות: הסביבה האיסכמית הפרו דלקתית העוינת המוקדמת עשויה להשפיע על הישרדותם של SCs מושתלים, והיא אינה מייצגת את תרחיש האוטם subacute שבו SCs סביר להניח ישמשו. כאן אנו מתארים סדרה של שני חלקים של הליכים כירורגיים עבור אינדוקציה של פגיעה איסכמיה-reperfusion ומסירה של תאי גזע mesenchymal (MSCs). שיטה זו של ניהול תאי גזע עשויה לאפשר את הכדאיות והשמירה הארוכה יותר סביב רקמה פגומה על ידי עקיפת התגובה החיסונית הראשונית. מודל של פגיעה reperfusion איסכמיה היה מושרה בעכברים מלווה במשלוח של תאי גזע mesenchymal (3.0 x 10^{5), מבטא ב}stabing את הגן הכתב גחלילית לוציפראז תחת היזם CMV מבוטא באופן קונסטרטיבי, intramyocardially 7 ימים מאוחר יותר. בעלי החיים תדמינו באמצעות אולטרסאונד והדמיה ביו-לומסצנטית לאישור פציעה והזרקת תאים, בהתאמה. חשוב לציין, לא היה שיעור סיבוך נוסף בעת ביצוע גישה זו של שני נהלים עבור מסירה SC. שיטה זו של ניהול תאי גזע, יחד עם ניצול של גנים עיתונאי המדינה-of-the-art, עשוי לאפשר מחקר vivo של קיום ושמירה של SCs מושתלים במצב של איסכמיה כרונית נפוץ לראות קלינית, תוך עקיפת התגובה הפרו דלקתית הראשונית. לסיכום, הקמנו פרוטוקול לעיכוב במשלוח של תאי גזע לתוך שריר הלב, אשר יכול לשמש כגישה חדשה פוטנציאלית לקידום התחדשות של הרקמה הפגועה.

Introduction

מחלות לב וכלי דם נשאר הגורם הנפוץ ביותר של תחלואה ותמותה ברחבי העולם. אירועי לב איסכמי נמצאו מזיקים לתפקוד הכולל של שריר הלב והתאים שמסביב¹. רק 0.45-1.0% מקרדיומיוציטים יתחדשו מדי שנה לאחר שנזק שריר הלב^{יתרחש 2}. למרות הביקוש הגובר וההתמקדות הטבועה בפיתוח טיפולים, טיפולים המסייעים להתחדשות של רקמות פצועות היו קשים להקים ועדיין^{דורשים אופטימיזציה נוספת 3,,4,,5}. טיפולים בתאי גזע הוצגו כדרך חלופית כדי להצעיר רקמה פגומה לאחר אירוע איסכמי; עם זאת, קידום טיפולים אלה כבר אתגר על ידי הישרדות מוגבלת ושמירה של התאים לאזור^{6 פצוע.}

המיקרו-סביבה של הלב לאחר אירוע איסכמי יכולה להיות מאופיינת כ hypoxic, פרו חמצון, ופרו דלקתיות, הצגת תנאים עוינים עבור תאי גזע טיפוליים להסתגל^{להישרדות 7,,8}. כמו תגובה חיסונית מופעלת בעקבות פציעה, לימפוציטים נאיביים, מקרופאגים, נויטרופילים ותאי תורן מנסים לתקן את הנזק על ידי הסרת תאים גוססים ואיזות התהליך לשיפוץ^{רקמות 9,10,11}. בתוך 3 הימים הראשונים לאחר איסכמיה, דלקת היא בשיאה עם שחרורו של ציטוקינות פרו דלקתיות עם מספרים גבוהים של נויטרופילים ומונוציטים באזור^10,12. לאחר 7 ימים, חלק גדול מהדלקת דעך והמעבר לתאים שיפוץ מתחיל, ממשיך עד מפל השיפוץ הושלמה, כ 14 ימים בעכברים¹³. השיטה הכירורגית שלנו היא גישה חלופית פוטנציאלית להחדרת ביולוגיות לתוך שריר הלב כדי לעקוף את התגובה החיסונית המולדת שיא לאחר פגיעה איסכמיה reperfusion. במקביל, זה יאפשר את המחקר של כל טיפולים במצב של איסכמיה subacute / כרוני שבו ייתכנו משתנים שונים לשקול בהשוואה אוטם שריר הלב חריפה.

Protocol

הניסויים בוצעו על עכברי C57BL/6 נקבה, גיל 10-12 שבועות ו 20-25 גרם משקל גוף. כל ההליכים בבעלי חיים צייתו לסטנדרטים שנקבעו במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים מעבדה (המכון למשאבי בעלי חיים במעבדה, האקדמיה הלאומית למדעים, בת'סדה, MD, ארה"ב) ואושרו על ידי המכללה לרפואה של מאיו לרפואה מוסדית לטיפול בבעלי חיים וועדת שימוש (IACUC).

1. הכנה וצנרור

1. Autoclave כל כלי הניתוח לפני הניתוח. אם יש לבצע מספר ניתוחים בפגישה אחת, נקה את המכשירים לאחר כל בעל חיים ועיקור מחדש באמצעות מחטא חרוזים חם.
2. להמריד את העכברים עם 3.5-4% isoflurane ב 1 L/min O₂ בתא אינדוקציה.
3. לתת Buprenorphine SR 1 מ"ג/ק"ג (משכך כאבים) תת עורית, לשקול את החיה, ולהזין את המשקל לתוך מכונת ההנשמה.
4. לגלח את הצד השמאלי של החזה מעצם החזה לרמה של הכתף ולהחיל קרם depilatory כדי להסיר פרווה עודפת.
5. עבור הליך reperfusion איסכמיה לשמור על הלחץ הסופי החיובי (PEEP) על מכונת ההנשמה ב 2 cmH₂O. עבור הזרקה מושהית של הליך תאים לשנות את ה-PEEP ל 3 cmH₂O כדי למנוע קריסת ריאות.
6. צנרר את החיה באמצעות צינור אנדוטרצ'ל 20 G, להעביר כרית חימום מבוקרת כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 35-37 ° C.
7. מניחים את העכבר על מכונת הנשמה בהתכוויה רוחבית עם קצה גולגולתי בצד שמאל וקץ סיבתי בצד ימין.
8. לשמור על הרדמה ב 2-2.5% isoflurane ב 1 L/min O₂ למשך שארית ההליך.
9. לקרצף את האזור הכירורגי לסירוגין בין povidone-יוד ואלכוהול ספוגיות שלוש פעמים ולהחיל משחה אופטלמית על שתי העיניים.

2. פציעת איסכמיה

1. באמצעות #10 להב עשה חתך אנכי 2.5 מ"מ לימין הפטמה השמאלית ביותר בשדה התצוגה.
2. באמצעות מספריים לחתוך דרך שכבות שריר שטחי עד השרירים intercostal וצלעות גלויים.
3. בעת הרמת הצלעות והרקמה שמסביב, לחתוך דרך החלל הבין-צלבי בין הצלעות 4 ו -5, ואז להכניס את מפשק העפעפיים לחלל הפתוח.
4. משוך את החיידק באמצעות מ מפסים מעוקלים, הזזת הריאה כלפי מעלה ומחוץ לתצוגה.
5. לדמיין את עורק LAD, באמצעות תפר ניילון 9-0, לעבור דרך שריר הלב מתחת לעורק 2.5 מ"מ דיסטל לתכלת השמאלית ולקשור קשר מרובע רופף.
6. חותכים 1 ס"מ של צינורות פוליאתילן ומניחים אותו בתוך הקשר הרופף.
7. אבטחו את התפר מסביב לצינורות, אישרו איסכמיה, ואז שחררו אחרי 35 דקות.
   הערה: אשר איסכמיה באמצעות חיוורון והפרעה בקצב הלב בחדר.
8. לאחר שחרור הקשירה והסרת הצינורות, המתן 5 דקות כדי לאשר את ההתרגזות של שריר הלב.
9. שים צינור צנתר 24 ג'י.וי.
10. סגור את החתך הבין-צלבי עם תפר קליט 6-0 בתבנית פשוטה שהופסקה.
11. סגור את שכבת השריר עם תפר 6-0 נספג בתבנית תפר רציפה.
12. לאחר סגירת שכבת השריר השטחית, הסר את נקז החזה תוך משיכת האוויר מחיל בית החזה באמצעות מזרק שחפת 1 מ"ל.
13. סגור את חתך העור עם תפר קליט 6-0 בתבנית מזרן אופקית רציפה
    הערה: תפרים ניילון ודפוס תפר בלתי רציפות עשוי לשמש גם לשכבת העור.
14. לתת 1.5 מ"ל של תמיסת מלח חמה תת עורית ולהחיל משחה משולשת אנטיביוטיקה לאתר החתך כדי למנוע זיהום.
15. כבה את isoflurane ולאפשר לחיה לנשום דרך מכונת ההנשמה על 100% O 2 עד שהוא יכול_לנשום ברציפות ללא סיוע.
16. העבר את העכבר לכלוב ללא מצעים או לכלוב עם מצעים מכוסים (מגבת נייר או וילונות) על משטח חם בטמפרטורה של 35-37°C עד להחלמה מלאה.

3. משלוח תאי גזע mesenchymal עכבר

הערה: הזן של עכברים המשמשים להליך הם קו מלידה ונחשבים זהים גנטית. תאי הגזע mesenchymal הושגו מבעלי חיים מאותו זן, על ידי עיצוב פרוטוקול, דיכוי המערכת החיסונית לא היה מושרה¹.

1. השלם את שלבי ההכנה וצנרור כפי שנעשה בעבר עבור ההליך הראשון.
2. הסר את התפר משכבת העור באמצעות מספריים ומפסים.
3. עם #10 אזמל, לעשות חתך באותו מיקום כמו הניתוח הקודם.
4. המשך להשתמש באזמל כדי לחתוך דרך רקמת צלקת עד תפר שכבת שריר גלוי
5. באמצעות המספריים והמקציות להסיר את התפר ולחתוך את שכבת השריר פתוח.
6. דמיין והסר את התפרים המחזיקים את הצלעות יחד ולהמשיך לחתוך דרך השריר הבין-צלע מהחתך הקודם.
   הערה: ייתכן שהריאות דבקו בקיר החזה, אם הדבר מתרחש, השתמש במשקולות קהות או מעוקלות כדי להפריד ולשחרר אותן בזהירות.
7. מניחים את מפשק העפעפיים בחלל הבין-קוסטלי ואתרו את אזור הרצועה הקודמת.
8. טען את תאי הגזע mesenchymal (3.0 x 10^{5), מושעה}20 μL PBS, לתוך מזרק אינסולין 30 G, לכופף את המחט מעט לפי הצורך עבור הזווית הנכונה להזריק.
   הערה: תאי גזע Mesenchymal (MSCs) היו מבודדים רקמת שומן של 4-6 שבועות C56BL/6 עכברים. תאי מעבר מוקדמים (p3) הושרשו עם וקטור המבטא את הגן גחלילית לוציפראז תחת מקדם CMV כדי לאפשר ניטור הכדאיות של תאי vivo. MSC עכבר נגזר אדיפוז היו מאופיינים ציטומטריית זרימה ואת התאים היו חיוביים CD44, CD29, CD90 ו CD105 אבל שלילי עבור סמן hematopoietic CD45¹⁴. לפני הזריקה, MSCs היו תרבותיים לפחות מעבר אחד כדי למנוע אובדן של תאים מתהליך ההפשרה.
9. נע בכיוון מן apex לכיוון הבסיס של הלב להכניס את המזרק לאזור peri-אוטם עד פתיחת המחט הוא לחלוטין בתוך שריר הלב.
10. ברגע שנכנס לאט להזריק את התאים לתוך שריר הלב, לחכות 3 s, ולאחר מכן להסיר את המחט.
11. שים לב מקרוב במשך 3 דקות כדי להיות בטוח ללא תגובות חריגות לתאים כגון פתפור חדרי.
12. מניחים צינור צנתר 24 ג'י 4 בחלל בית החזה, חלל בין-תאי אחד מימין לפתיחה.
13. סגור את שכבות intercostal, שריר, ועור ולהסיר את נקז החזה באותה שיטה כמו ההליך הראשון.
14. לתת 1.5 מ"ל של תמיסת מלח חמה תת עורית ולהחיל משחה משולשת אנטיביוטיקה לאתר החתך כדי למנוע זיהום.
15. כבה את isoflurane ולאפשר לבעלי חיים לנשום דרך מכונת ההנשמה על 100% O 2 עד שהוא מסוגל_לנשום ברציפות ללא סיוע.
16. העבר את העכבר לכלוב ללא מצעים או לכלוב עם מצעים מכוסים (מגבת נייר או וילונות) על משטח חם בטמפרטורה של 35-37°C עד להחלמה מלאה.

4. טיפול לאחר הניתוח ים בעקבות שני ההליכים

1. יש להקפיד על החיה ללא הרף עד לנסימה ספונטנית, לתפיכת החזה ולתנועה נורמלית.
2. המשך תצפית כל 15-30 דקות לפחות 3 שעות ביום הניתוח.
3. בדוק את העכברים לתסיסה הפצע או כאב חריג פעם ביום במשך 5 ימים, אז 2-3 פעמים בשבוע.
4. אם בעל החיים מראה סימנים של כאב (כלומר גב מקושת, תנועה מינימלית, grimacing, או פרווה מוזנחת) לאחר 72 שעות לאחר הניתוח, לספק מנה נוספת של משכך כאבים Buprenorphine SR.

תוצאות

פציעת תפרוק איסכמיה נגרמה בעכברים ביום 0, ואחריו אקו-קרדיוגרמה ואלקטרוקרדיוגרם לאחר הניתוח ביום שלפני השתלת תאי גזע. ניתוח אולטרסאונד ואלקטרוקרדיוגרם אישר אוטם וירידה בתפקוד ההתכווצות בחדר הלב(איור 1לערך). בדיקה נוספת של הנתונים הראתה כי השבר והקיצור החלקי ירדו ?...

Discussion

מעל 85 מיליון אנשים ברחבי העולם מושפעים ממחלות לב וכלי^{דם 3}. השכיחות הגבוהה של אירועים איסכמיים אלה מצדיקה פיתוח נוסף והרחבה של טיפולים חלופיים לקידום התחדשות של רקמות פגומות. שיטות מסורתיות לנצל את הליך reperfusion איסכמיה בסביבה חריפה עם ניהול עוקב של^{טיפולית 1}. תגובות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl Irrigation, USP	Baxter	0338-0048-04
11x12" Press n' Seal surgical drape, autoclavable	SAI Infusion Technologies	PSS-SD
24G 3/4" IV catheter tube	Jelco	4053
28G x 1/2" 1mL allergy syringe	BD	305500	Injection of analgesic
30G x 1/2" 3/10cc insulin syringe	Ulticare	08222.0933.56	Injection of stem cells
6-0 S-29, 12" Vicryl suture	Ethicon	J556G	Intercostal, superficial muscle and skin layer incision closure
9-0 BV100-4, 5" Ethilon suture	Ethicon	2829G	Ligation of the LAD artery
Absorbent underpad	Thermo Fischer Scientific	14-206-64	For underneath the animal
Alcohol prep pads, 2 ply, medium	Coviden	6818
Anti-fog face mask	Halyard	49235
Bonn Strabismus scissors, curved, blunt	Fine Science Tools	14085-09
Buprenorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 ml	ZooPharm Pharmacy		Buprenorphine narcotic analgesic formulated in a polymer that slows absorption extending duration of action (72 hours duration of activity).
Castroviejo needle holders, curved	Fine Science Tools	12061-01
Curity sterile gauze sponges	Coviden	397310
Delicate suture tying forceps, 45 angle bent	Fine Science Tools	11063-07
Electric Razor	Wahl		Fur removal
Isoflurane 100 ml	Cardinal Health	PI23238	Anesthetic
Lab coat
Monoject 1 mL hypodermic syringe	Coviden	8881501400
Moria iris forceps, curved, serrated (x2)	Fine Science Tools	11370-31
Moria speculum retractor	Fine Science Tools	17370-53
Mouse endotracheal intubation kit	Kent Scientific
Nair depilatory cream	Johnson & Johnson		Fur removal
Optixcare eye lube plus	Aventix		Sterile ocular lubricant
Physiosuite ventilator	Kent Scientific
PolyE Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	72-0191	Temporary compression of LAD artery
Povidone-iodine swabs	PDI	S41125
Scalpel, 10-blade	Bard-Parker	371610
Sterile 3" cotton tipped applicators	Cardinal Health	C15055-003
Sterile 6" tapered cotton tip applicators	Puritan	25-826-5WC
Sterile gloves	Cardinal Health	N8830
Sterilization pouches	Medline	MPP100525GS
Surgery cap
Surgical Microscope	Leica	M125
Suture tying forceps, straight (x2)	Fine Science Tools	10825-10
Transpore surgical tape	3M	1527-1
Triple antibiotic ointment	G&W Laboratories	11-2683ILNC2	Topical application to prevent infection
Vannas-Tübingen Spring Scissors, curved	Fine Science Tools	15004-08
Vetflo vaporizer	Kent Scientific