JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בפרוטוקול זה תוארה שיטה לכריית גנים וניתוח רצף של נוקלאוזידאז פורין (PN, EC:3.2.2.1) המבוססת על RNA-Seq. ניתוח ProtProm יושם כדי להראות את המבנים המשניים והשלישוניים הייחודיים של PN. יתר על כן, הגן PN שובט מטרנסקריפטום כדי לאמת את האמינות של תוצאות RNA-Seq.

Abstract

פטריית זחל (Ophiocordyceps sinensis) היא אחת הרפואה הסינית המסורתית (TCM) הפטרייתית המוערכת ביותר, והיא מכילה שפע של מרכיבים פעילים כמו אדנוזין. אדנוזין נחשב כמרכיב יעיל מבחינה ביולוגית שיש לו מגוון פעילויות אנטי-גידוליות ואימונומודולטוריות. על מנת להבהיר עוד יותר את המנגנון של פורין נוקלאוזידאז (PN) בביוסינתזה של אדנוזין, גן המקודד PN נכרה בהצלחה ונותח עוד יותר על סמך מסד הנתונים RNA-Seq של פטריית זחל. ה-cDNA באורך מלא של PN היה 855 bp, שקידד 284 חומצות אמינו. ניתוח BLAST הראה את ההומולוגיה הגבוהה ביותר של 85.06% עם נוקלאוזיד הידרולאז ב-NCBI. ניתוח ProtProm הראה שהמשקל המולקולרי היחסי היה 30.69 kDa והנקודה האיזואלקטרית הייתה 11.55. המבנה המשני של PN נחזה על ידי Predict Protein; התוצאות הראו שמבנה סליל אלפא היווה 28.17%, מבנה גדיל היווה 11.97% ומבנה לולאה היווה 59.86%. יתר על כן, גן PN שובט עוד יותר מהטרנסקריפטום וזוהה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לצורך אימות. מחקר זה מספק בסיס מדעי מספיק יותר ורעיונות חדשים לוויסות גנטי של ביוסינתזה של אדנוזין ברפואה הסינית המסורתית של פטריות.

Introduction

לרפואה הסינית המסורתית הפטרייתית (TCM) יש משאבי מינים בשפע 1,2. פטריית זחל (Ophiocordyceps sinensis) היא רפואה סינית מסורתית פטרייתית ידועה ונחשבת למקור לתרופות חדשניות 3,4. פטריית זחל היא תערובת משולבת של תולעים ופטריות הנמצאת ברמה הטיבטית בדרום מערב סין, שם Hirsutella sinensis הוא טפיל על גוף הזחל5. נכון לעכשיו, H. sinensis מדווח כאנמורף היחיד של פטריית זחל על פי עדויות ביולוגיה מולקולרית ומורפולוגית 6,7, ויש לו פחות רעילות קשורה ויעילות קלינית דומה בהשוואה לפטריית זחל בר8. התגלה כי ל-H. sinensis יש מגוון מרכיבים יעילים ביולוגית, כגון נוקלאוזידים, פוליסכרידים וארגוסטרולים, עם השפעות פרמקולוגיות נרחבות כגון תיקון פגיעה בכבד 9,10,11. אדנוזין הוא מרכיב פעיל טיפוסי המבודד מפטריית זחל, והוא סוג של אלקלואיד פורין12. לאדנוזין מגוון פעילויות ביולוגיות: פעילויות אנטי-גידוליות, אנטיבקטריאליות ואימונומודולטוריות13,14. למרבה הצער, המנגנון הביו-סינתטי של אדנוזין כמו גם הגנים המרכזיים המעורבים עדיין לא ברור15,16.

אדנוזין מראה בעיקר את השפעתו האנטי-גידולית באמצעות פעולות מדכאות חיסון במיקרו-סביבת הגידול17. דווח כי אדנוזין הראה תפקודים מדכאי חיסון, שהיה קריטי להתחלת תיקון רקמות לאחר פציעה ולהגנה על רקמות מפני דלקת מוגזמת18,19. יתר על כן, הוכח כי דיכוי חסינות בתיווך אדנוזין עלול לפגוע קשות במעקב החיסוני של הסרטן וכן לקדם את צמיחת הגידול20. לפיכך, דחוף לחקור את המנגנון של ביוסינתזה של אדנוזין ליישום הרחב שלו באנטי גידול.

דווח כי תצוגה מלאה של גנים מבוטאים ורמות הביטוי שלהם יכולה להתבצע באופן שיטתי על ידי ריצוף הדור הבא של טרנסקריפטום21. יתר על כן, ריצוף וניתוח טרנסקריפטום יושמו כדי לחזות את הגנים המעורבים במסלול הביו-סינתטי של החומרים הפעילים, ולחקור עוד יותר את האינטראקציה בין מסלולים ביוסינתטיים שונים22. פורין נוקלאוזידאז (PN, EC 3.2.2.1) הוא סוג של נוקלאוזידאז עם ספציפיות סובסטרט לנוקלאוזידים של פורין, שיכול להידרוליזה של קשרי הגליקוזידים של נוקלאוזידים של פורין לסוכרים ובסיסים23. בדרך כלל הוא ממלא תפקידים חשובים בביוסינתזה של אדנוזין. דווח כי המסלול הביו-סינתטי של אדנוזין ברפואה הסינית המסורתית של פטריות נחזה; qPCR וביטוי גנים הראו כי הצטברות אדנוזין מוגברת היא תוצאה של ויסות נמוך של גן PN , מה שמצביע על כך שגן PN עשוי למלא תפקיד חשוב בביוסינתזה של אדנוזין15. לכן, יש להבהיר בדחיפות את המנגנון של PN בביוסינתזה של אדנוזין. עם זאת, מידע הרצף ומבנה החלבון של PN כמו גם גנים מרכזיים אחרים המעורבים בביוסינתזה של אדנוזין של TCM פטרייתי לא נחקרו עוד יותר.

במחקר זה, רצף חדש של גן PN נכרה מנתוני RNA-Seq של פטריית זחל ואומת על ידי שיבוט גנים. יתר על כן, המאפיינים המולקולריים ומבנה החלבון של PN נותחו באופן מקיף, מה שיכול לספק כיוונים ורעיונות חדשים לוויסות הגנים של ביוסינתזה של אדנוזין.

Protocol

הערה: זן של אנמורף של פטריית זחל (H. sinensis) הופקד במעבדה שלנו. Escherichia coli DH5 נשמר על ידי בית החולים שנג'ן, אוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית.

1. הכנה ל-RNA-Seq

  1. קציר תפטיר
    1. הכינו אמצעי תסיסה לתסיסה של H. sinensis: אבקת קמח תירס (1%), גלמי תולעי משי (1.5%), תמצית שמרים (0.5%), טריפטון (1%), גלוקוז (1.5%), סובין (1.5%), דקסטרין (0.5%), KH2PO4 (0.02%) ו- MgSO4 (0.01%).
    2. הכן חיסון על ידי מדיום תסיסה של 10% לתרבית בקנה מידה גדול (הוסף 10 מ"ל בינוני לכל 100 מ"ל מדיום). בצע תסיסה שקועה בתנאי של 16 מעלות צלזיוס על שייקר סיבובי ב-150 סל"ד למשך 10 ימים.
    3. להתרבות ולקצור תפטיר א-מיני של האנמורף של פטריית הזחל למשך 10 ימים. צנטריפוגה את המדיום המותסס והשליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. השעו את התפטיר על ידי הוספת 100 מ"ל מים טהורים במיוחד למשך 3 פעמים והסירו את הסופרנטנט על ידי צנטריפוגה. טוחנים את התפטיר הנקי לאבקה בעזרת חנקן נוזלי.
  2. RNA-Seq
    1. חלץ את ה-RNA הכולל של האנמורף של פטריית הזחל על פי פרוטוקולי היצרן (טבלת חומרים) וטפל עוד יותר בדגימה עם DNase I ללא RNase (טבלת חומרים).
    2. בודד את ה-mRNA ממערכות בידוד mRNA של RNA PolyATtract כולל, ובודד mRNA פולי (A) באמצעות חרוזים עם אוליגו(dT) בהתאם לפרוטוקולי היצרן (טבלת חומרים).
    3. קח את השברים הקצרים כתבניות לסינתזה של ה-cDNA של הגדיל הראשון על ידי הקסמר-פריימרים אקראיים על פי פרוטוקולי היצרן (טבלת חומרים). בצע סינתזה של cDNA גדיל שני על פי פרוטוקולי היצרן.
    4. לאחר מכן, צור את ספריות הרצף באמצעות ערכת ההכנה של ספריית Ultra RNA בהתאם לפרוטוקולי היצרן (טבלת החומרים).
    5. טהר שברים קצרים על ידי ערכת מיצוי PCR על פי פרוטוקולי היצרן (טבלת חומרים) ופתור אותם על ידי מאגר EB, בהתאמה.
    6. חבר את השברים הקצרים (סף של 300 bp) עם מתאמי רצף על פי התוצאה של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
    7. לאחר מכן, בצע הגברה באמצעות PCR באמצעות התבניות שנבחרו מתוך שברים מתאימים.
    8. רצף את הספרייה על ידי Illumina HiSeq 4000 עם רצף קצה מזווג בהתאם לפרוטוקולי היצרן. סנן קריאות גולמיות מלוכלכות מנתוני הרצף הגולמי כדי לקבל נתונים נקיים. אמצו הרכבה של denovo כדי לקבל Unigenes עם הכי פחות Ns שלא ניתן להרחיב בשני הצדדים.
    9. יישר רצפי Unigene על ידי blastx למאגרי חלבונים כגון nr, Swiss-Prot, KEGG ו-COG (ערך אלקטרוני < 0.00001). אחזר חלבונים עם דמיון הרצף הגבוה ביותר עם היוניגנים הנתונים יחד עם ההערות הפונקציונליות של החלבונים שלהם. סכם את תוצאות ה-RNA-Seq (טבלת חומרים).
      הערה: ערכות מסחריות שימשו בשלבים לעיל, וכל הפעולות נעשו על פי פרוטוקול היצרן.

2. כריית גנים של פורין נוקלאוזידאז

  1. הורד את הקבצים של תוצאות RNA-Seq במחשב. מצא את קבצי תוצאות ההערות של Unigenes שהורכבו מתוצאות RNA-Seq.
    הערה: קריאות קצה מזווג שימשו שוב למילוי פערים של פיגומים כדי להשיג רצפים עם פחות Ns שלא ניתן להאריך בשני הקצוות. רצפים כאלה הוגדרו כיוניגנים. ביאור Unigene מספק מידע על ביטוי והערות פונקציונליות של Unigene.
  2. פתח את נתיב קבצי ההערות והזן מפה 00230 בשורת החיפוש; לאחר מכן חפש מטבוליזם פורין (map00230) בסיווג KEGG של קבצי ביאורים.
  3. סמן EC:3.2.2.1 (PN) אדום במפה המבוארת00230 וציין שהיו יוניגנים מורכבים שסומנו ל-PN.
    הערה: היו שלושה Unigenes (Unigene10777, Unigene14697 ו-Unigene17827) שהובאו ל-PN לאחר לחיצה על מספר EC 3.2.2.1 והוצגו במפה המבוארת00230.
  4. לחץ על מספר EC 3.2.2.1 והצג את המידע המבואר של Unigenes.
  5. פתח את תוכנת LTFViewer וייבא קובץ Unigene.fa עם קיצור דרך Ctrl-O והצג את מידע הרצף של Unigenes שהורכבו.
  6. חפש מידע על רצף של Unigene10777, Unigene14697 ו-Unigene17827 עם קיצור דרך Ctrl-F .
  7. הורד את פרטי הרצף של Unigene10777, Unigene14697 ו-Unigene17827 עם קיצורי דרך Ctrl-C ו-Ctrl-V.
  8. הסר את Unigene10777 ו-Unigene17827 עם רצפים קצרים מדי של מסגרת קריאה פתוחה (ORF).
    הערה: מידע בסיסי על הרצף הוצג בתוכנת LTFViewer.
  9. בחר Unigene14697 (גודל 1,705 bp, פער 0 0%) עם אורך מתאים של ORF למחקר נוסף.

3. ניתוח ביואינפורמטי

  1. נתח את ה-ORF של גן PN על ידי ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/).
    1. הדבק את הרצף בתיבה. בחר פרמטרים כדלקמן, אורך ORF מינימלי (nt): 75, קוד גנטי: 1. קודון התחלה סטנדרטי של ORF לשימוש: ATG בלבד. לחץ על כפתור השליחה כדי לקבל את פרטי ה-ORF.
  2. השתמש בכלי ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) כדי לחשב את המסה המולקולרית התיאורטית ואת הנקודה האיזואלקטרית.
    1. הדבק את רצף חומצות האמינו (בקוד בן אות אחת) בתיבה ולחץ על כפתור חישוב פרמטרים כדי לקבל את התוצאות.
  3. החל את שרת SignalP5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) כדי לחזות את פפטידי האות.
    1. הזן רצפי חלבון בפורמט PASTA. בחר פרמטרים כדלקמן, קבוצת אורגניזם: Eukarya, פורמט פלט: פלט ארוך. לחץ על כפתור שלח כדי לקבל את התוצאות.
  4. החל את BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) כדי לנתח את ההומולוגיה של רצפי חלבונים.
    1. לחץ על כפתור פיצוץ החלבון והזן את הרצף לתיבה. בחר פרמטרים כדלקמן, מסד נתונים: רצפי חלבון לא מיותרים (nr), אלגוריתם: blastp (חלבון-חלבון BLAST). לחץ על כפתור הפיצוץ כדי לקבל את התוצאות.
  5. החל את תוכנית Clustal X (http://www.clustal.org/) כדי ליישר את רצפי החומצה של PN מפטריות שונות.
    1. העלה קובץ או הדבק את הרצפים בתיבה. הגדר את הפרמטרים באופן הבא, פורמט פלט: ClustalW עם ספירת תווים. לחץ על כפתור שלח כדי לקבל את התוצאות. Clustal X יכול לזהות רק קבצים בפורמט FASTA, ונתיב הקבצים יכול לכלול רק שמות באנגלית.
  6. השתמש ב-MEGA 4.0 (https://www.megasoftware.net/mega4/) כדי לנהל את העץ הפילוגנטי.
    1. פתח את התוכנה ולחץ על שלח כפתור כדי להעלות את הרצפים. בחר את סוג הנתונים כרצפי חלבון, לחץ על כפתור אישור כדי להמשיך לשלב הבא. לאחר מכן, לחץ על כפתור הפילוגניה ובחר Bootstrap Test Phylogeny, ולאחר מכן לחץ על Neighbor Joining Tree. בחר את פרמטרי ברירת המחדל ולחץ על כפתור המחשוב כדי להשיג את התוצאות.
  7. החל את InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/) כדי לזהות את התחום הקטליטי של PN.
    1. הזן את הרצף לתיבה. בחר את פרמטרי ברירת המחדל ולחץ על כפתור החיפוש כדי לקבל את התוצאות.
  8. החל את Predict Protein (http://www.predictprotein.org/) באופן מקוון כדי לחזות את המבנה המשני של החלבון.
    1. הזן רצף חומצות אמינו (קוד אות אחת) לתוך התיבה, ולאחר מכן לחץ על כפתור predictProtein כדי לקבל את התוצאות.
  9. החל כלים מקוונים SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/) כדי להעריך את המבנה התלת מימדי של PN24.
    1. לחץ על כפתור התחל דוגמנות והדבק את רצף היעד בתיבה. מלא את פרטי כותרת הפרויקט והדוא"ל ולחץ על כפתור חפש תבניות כדי לקבל את התוצאות.

4. שיבוט גנים ובניית פלסמיד רקומביננטי

  1. פריימרים עיצוביים שהפריימר האחורי שלהם הכיל אתר NotI והפריימר הקדמי היה אתר EcoRI.
  2. הצג את הפריימר קדימה כ: AGAGAATTCATGACCATGCCAGATTCT (5'–3'), ואת הפריימר ההפוך כ: ATAGCGGCCGCCTAACGCGTGCCGTTAGA (5'–3') מאת Primer Express.
  3. הכן את הפריימרים כמו גם את ה- cDNA של פטריית הזחל לשיבוט גן PN . בצע PCR באופן הבא: טרום דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, רנטורציה ב-55 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, חזור על הפעולה במשך 35 מחזורים והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. השג את שברי ה-PCR וגלה אותו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לאימות. קשר את שברי ה-PCR עם pMD18-T. מערכת קשירה מוליכה של PMD18-T כדלקמן: 1 μL PMD18-T, 4 μL Solution1 ו-5 μL גן מטרה. הגדר את התנאים כדלקמן: שמירה על 16 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, השבתה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  5. העבר את הפלסמידים הרקומביננטיים לתאי E. coli JM109 המוסמכים על פי מדריך ההפעלה25.
  6. עכל את הפלסמידים הרקומביננטיים pMD18-T/PN ואת הווקטור ppic9K עם Eco RI ולא I. קשר את השברים לאחר העיכול על ידי T4 DNA ligase.
  7. בנה את הפלסמיד הרקומביננטי ppic9K/PN לביטוי הטרולוגי נוסף.

תוצאות

רצף ה-ORF של הגן PN היה באורך של 855 bp, אשר קודד 284 חומצות אמינו עם מסה מולקולרית מחושבת של 30.69 kDa ונקודה איזואלקטרית חזויה של 11.55, מה שמצביע על כך ש-PN הוא חלבון אלקליין. היישום של שרת SignalP4.0 נערך כדי לזהות פפטיד אותות, והתוצאות הצביעו על כך של-PN אין פפטידי אות. יתר על כן, תוצאות ...

Discussion

בריאות האדם מתמודדת עם סדרה של בעיות רפואיות עיקריות כגון גידולים, מחלות לב וכלי דם במוח26,27. הרפואה הסינית המסורתית נחשבת למקור המחקר והפיתוח של רפואה חדשנית, בגלל משאבי המינים העשירים שלה והמבנה והתפקודים המגוונים של החומרים הפעילים

Disclosures

המחברים לא מדווחים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31871244, 81973733, 81803652), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2019A1515011555, 2018A0303100007), קרן שנזן לבריאות ותכנון המשפחה (SZBC2018016), הקרן המיוחדת לפיתוח כלכלי וטכנולוגי של מחוז לונגגאנג בעיר שנזן (LGKCYLWS2020064, LGKCYLWS2019000361).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-free DNase ITaKaRa2270B
PolyATtract mRNA Isolation SystemsPromegaIII
Random hexamer-primersThermo ScientificSO142
NEBNext1 Ultra RNA Library Prep KitNEBE7530S
PCR extraction kitQiaQuick
AgaroseTransGen BiotechGS201-01
High-throughput sequencerIlluminaHiSeq™ 4,000
LTF ViewerLTFV5.2
ORF programNCBI
ProtParam toolSIB Swiss Institute of Bioinformatics
SignalP ServerDTU Health Tech5.0
BLASTNCBI
Clustal X programUCD Dublin
MEGACenter for Evolutionary Medicine and Informatics4.0
InterProScanEuropean Molecular Biology Laboratory
Predict ProteinTechnical University of Munich
WISS-MODELSwiss Institute of Bioinformatics
Primer ExpressApplied Biosystems3.0
EcoRINEBR0101V
NotINEBER0591
pMD18-T VectorTaKaRa6011
agaroseSigma-AldrichGS201-01
Trans2K® Plus II DNA MarkerSigma-AldrichBM121-01
6×DNA Loading BufferSigma-AldrichGH101-01
GelStainSigma-AldrichGS101-02
50 x TAESigma-AldrichT1060
Gel imaginganalysis systemSyngeneG:BOX F3
E. coli JM109Promega
T4 DNA ligaseEarthOxBE004A-02
pPIC9KGenlociGP0983

References

  1. Dong, C. J. The traditional Chinese medicine fungus Cordyceps and its biotechnological production. Research Journal of Biotechnology. 8, 1-2 (2013).
  2. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1806 (2017).
  3. Koganti, P., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  4. Shen, C. Y., Jiang, J. G., Li, Y., Wang, D. W., Wei, Z. Anti-ageing active ingredients from herbs and nutraceuticals used in traditional Chinese medicine: pharmacological mechanisms and implications for drug discovery. British Journal of Pharmacology. 174, (2017).
  5. Jiang, Y., Yao, Y. J. Names related to Cordyceps sinensis anamorph. Mycotaxon. 84, 245-254 (2002).
  6. Chen, Y. Q., Wang, N., Qu, L. H., Li, T. H., Zhang, W. M. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA. Biochemical Systematics and Ecology. 29, 597-607 (2001).
  7. Liu, Z. Y., et al. Molecular evidence for the anamorph-teleomorph connection in Cordyceps sinensis. Mycological Research. 105, 827-832 (2001).
  8. Yu, S. J., Zhang, Y., Fan, M. Z. Analysis of volatile compounds of mycelia of Hirsutella sinensis, the anamorph of Ophiocordyceps sinensis. Applied Mechanics and Materials. 140, 253-257 (2012).
  9. Singh, M., et al. Cordyceps sinensis increases hypoxia tolerance by inducing heme oxygenase-1 and metallothionein via Nrf2 activation in human lung epithelial cells. BioMed Research International. 2013, 569206 (2013).
  10. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  11. Lin, S., et al. Enhancement of cordyceps polysaccharide production via biosynthetic pathway analysis in Hirsutella sinensis. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 872-880 (2016).
  12. Xia, E. H., et al. The caterpillar fungus, Ophiocordyceps sinensis, genome provides insights into highland adaptation of fungal pathogenicity. Scientific Reports. 7, 1806 (2017).
  13. Cha, S. H., et al. Production of mycelia and exo-biopolymer from molasses by Cordyceps sinensis 16 in submerged culture. Bioresource Technology. 98, 165-168 (2007).
  14. Antonioli, L., Blandizzi, C., Pacher, P., Hasko, G. Immunity, inflammation and cancer: a leading role for adenosine. Nature Reviews. Cancer. 13, 842-857 (2013).
  15. Lin, S., Zou, Z., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Transcriptome analysis reveals the molecular mechanisms underlying adenosine biosynthesis in anamorph Strain of caterpillar fungus. BioMed Research International. 2019, 1864168 (2019).
  16. Lin, S., et al. Biosynthetic pathway analysis for improving the cordycepin and cordycepic aid production in Hirsutella sinensis. Applied Biochemistry and Biotechnology. 179, 633-649 (2016).
  17. Allard, B., Beavis, P. A., Darcy, P. K., Stagg, J. Immunosuppressive activities of adenosine in cancer. Current Opinion in Pharmacology. 29, 7-16 (2016).
  18. Fredholm, B. B. Adenosine, an endogenous distress signal, modulates tissue damage and repair. Cell Death and Differentiation. 14, 1315-1323 (2007).
  19. Ohta, A., Sitkovsky, M. Role of G-protein-coupled adenosine receptors in downregulation of inflammation and protection from tissue damage. Nature. 414, 916-920 (2001).
  20. Allard, B., Turcotte, M., Stagg, J. CD73-generated adenosine: orchestrating the tumor-stroma interplay to promote cancer growth. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012, 485156 (2012).
  21. Zhang, Y., Wang, X., Nan, P., Li, J., Jin, L. De novo transcriptome sequencing of genome analysis provides insights into Solidago canadensis invasive capability via photosynthesis. Journal of Plant Interactions. 14, 572-579 (2019).
  22. Liu, Z. Q., et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis. BMC Genomics. 16, 106 (2015).
  23. Ogawa, J., et al. Purification, characterization, and gene cloning of purine nucleosidase from Ochrobactrum anthropi. Applied and Environmental Microbiology. 67, 1783-1787 (2001).
  24. Konstantin, A., et al. The swiss-model workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics. 16, 195-201 (2006).
  25. Chung, C., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 2172-2175 (1989).
  26. Lin, S., et al. Association between aldose reductase gene C(-106)T polymorphism and diabetic retinopathy: A systematic review and Meta-Analysis. Ophthalmic Research. 63, 1-10 (2020).
  27. Peng, Y., et al. Inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT) transplantation model of murine islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), (2020).
  28. Zhang, T. T., Jiang, J. G. Active ingredients of traditional Chinese medicine in the treatment of diabetes and diabetic complications. Expert Opinion on Investigational Drugs. 21, 1625-1642 (2012).
  29. Lin, S., Zhou, C., Zhang, H., Cai, Z. Expression, purification and characterization of 5'-nucleotidase from caterpillar fungus by efficient genome-mining. Protein Expression and Purification. 168, 105566 (2020).
  30. Kinjo, N., Mu, Z. Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China. Mycoence. 42, 567-574 (2001).
  31. Xiao, J. H., Ying, Q., Xiong, Q. Nucleosides, a valuable chemical marker for quality control in traditional Chinese medicine Cordyceps. Recent Patents on Biotechnology. 7, 2 (2013).
  32. Tu, P., Yong, J., Guo, X. Discovery, research and development for innovative drug of traditional Chinese medicine under new situations. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 40, 3423-3428 (2015).
  33. Zheng, P., et al. Genome sequence of the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris, a valued traditional Chinese medicine. Genome Biology. 12, 116 (2011).
  34. Covarrubias, R., et al. Role of the CD39/CD73 purinergic pathway in modulating arterial thrombosis in mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36, 1809-1820 (2016).
  35. Ogawa, Y., Murayama, N., Yanoshita, R. Molecular cloning and characterization of ecto-5'-nucleotidase from the venoms of Gloydius blomhoffi. Toxicon. 54, 408-412 (2009).
  36. Lin, S., et al. Mining and characterization of two novel chitinases from Hirsutella sinensis using an efficient transcriptome-mining approach. Protein Expresion and Purification. 133, 81-89 (2017).
  37. Ueda, M., Hirano, Y., Fukuhara, H. Gene cloning, expression, and X-ray crystallographic analysis of a β-mannanase from Eisenia fetida. Enzyme and Microbial Technology. 117, 15-22 (2018).
  38. Rebets, Y., Kormanec, J., Luzhetskyy, A., Bernaerts, K., Anné, J. Cloning and expression of metagenomic DNA in Streptomyces lividans and subsequent fermentation for optimized production. Methods in Molecular Biology. 1539, 99 (2017).
  39. Wang, S. S., Ning, Y. J., Wang, S. N., Zhang, J., Chen, Q. J. Purification, characterization, and cloning of an extracellular laccase with potent dye decolorizing ability from white rot fungus Cerrena unicolor GSM-01. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 920-927 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

RNA SeqOphiocordyceps sinensisCDNABLASTProtProm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved