JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

יישום Exosome הוא כלי מתפתח לפיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. אנו מקימים פרוטוקול בידוד אקסו-זמני עם טוהר גבוה כדי לבודד אקסוזומים מתאי גזע שזוהו על ידי רומן הנקראים CB-SC למחקרים מכניים. אנחנו גם coculture CB-SC נגזר אקסוזומים עם מונוציטים אנושיים, המוביל ההבדל שלהם לתוך מקרופאגים שונים phenotypically.

Abstract

טיפול במחנך תאי גזע (SCE) הוא גישה קלינית חדשנית לטיפול בסוכרת מסוג 1 ובמחלות אוטואימוניות אחרות. טיפול SCE מפיץ את תאי הדם החד-גרעיניים של המטופל המבודד (למשל, לימפוציטים ומונוציטים) באמצעות מכונת אפיה, תרבויות ותרביות תרבית הדם של המטופל mononuclear תאים עם תאי גזע טבור דבקים (CB-SC) במכשיר SCE, ולאחר מכן מחזיר תאים חיסוניים "משכילים" אלה לדם של המטופל. Exosomes הם שלל חוץ תאי בגודל ננו בין 30\u2012150 ננומטר קיים בכל מדיה ביו-נוזלים ותרבות תא. כדי להמשיך לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים טיפול SCE ולקבוע את הפעולות של exosomes שוחרר CB-SC, אנו חוקרים אילו תאים phagocytize אלה exosomes במהלך הטיפול עם CB-SC. על-ידי שיתוף culturing CB-SC-נגזר אקסוזומים עם תאים חד גרעיניים דם היקפיים אנושיים (PBMC), מצאנו כי exosomes נגזר CB-SC נלקחו בעיקר על ידי מונוציטים אנושיים CD14 חיובי, המוביל הבידול של מונוציטים לתוך סוג 2 מקרופאגים (M2), עם מורפולוגיה דמויי ציר וביטוי של סמנים מולקולריים משטח M2 הקשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ואפיון של אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC ולפרוטוקול לתרבות ההפוכחה של אקסוזומים שמקורם ב-CB-SC עם מונוציטים אנושיים וניטור בידול M2.

Introduction

תאי גזע דם טבורים (CB-SC) הם סוג ייחודי של תאי גזע המזוהים מדם טבור אנושי ומובדלים מסוגים ידועים אחרים של תאי גזע כגון תאי גזע mesenchymal (MSC) ותאי גזע hematopoietic (HSC)1. בהתבסס על המאפיינים הייחודיים שלהם של אפנון חיסוני והיכולת שלהם לדבוק בחוזקה על פני השטח של צחות פטרי, פיתחנו טכנולוגיה חדשה המוגדרת כטיפול מחנך תאי גזע (SCE) בניסוייםקליניים 2,3. במהלך טיפול SCE, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של המטופל (PBMC) נאספים ומופצים דרך מפריד תאים ויתורות בהתרבות עם CB-SC דבק במבחנה. תאים "משכילים" אלה (PBMC שטופלו ב-CB-SC) מוחזרים לאחר מכן למחזור הדם של המטופל במערכת סגורה. ניסויים קליניים כבר הוכיחו את הבטיחות הקלינית ואת היעילות של טיפול SCE לטיפול במחלות אוטואימוניות כולל סוכרת סוג 1 (T1D)2,4 והתקרחות areata (AA)5.

Exosomes הם משפחה של חלקיקים עם קטרים הנעים 30\u2012150 nm והם קיימים בכל biofluid ומדיה תרבות תא6. אקסוזומים מועשרים מולקולות ביואקטיביות רבות כולל שומנים, mRNAs, חלבונים, microRNAs (miRNA), ולשחק תפקיד חשוב בתקשורת תא לתא. לאחרונה, exosomes הפכו אטרקטיביים יותר עבור חוקרים וחברות תרופות בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהםבמרפאות 7,8,9. לאחרונה, המחקרים המכניים שלנו הראו כי exosomes CB-SC שפורסמו לתרום אפנון חיסוני של טיפול SCE10.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול כדי לחקור את המנגנון של טיפול SCE מיקוד מונוציטים על ידי exosomes CB-SC שפורסמו. ראשית, exosomes CB-SC שוחררו היו מבודדים מ CB-SC נגזר מדיה מותנית באמצעות שיטות ultracentrifugation ואומתו על ידי ציטומטריה זרימה, כתם מערבי (WB) ופיזור אור דינמי (DLS). שנית, אקסוזומים נגזר CB-SC סומנו עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק: דיו. שלישית, הם היו שיתוף תרבות עם PBMC כדי לבחון את האחוזים החיוביים של exosomes CB-SC-מתויג בתת-אוכלוסיות שונות של PBMC על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מספק הדרכה ללמוד את הפעולה של exosomes הבסיסית אפנון חיסוני של תאי גזע.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי המוסדי במרכז לגילוי וחדשנות, Hackensack Meridian Health. יחידות דם של מעיל באפי אנושי נרכשו ממרכז הדם של ניו יורק (ניו יורק, ניו יורק). יחידות דם טבור אנושי נאספו מתורמים בריאים ונרכשו מבנק הדם הבינלאומי Cryo-Cell (Oldsmar, FL). הן מרכז הדם של ניו יורק והן קריו-תא קיבלו את כל ההסמכה לאוספים והפצות דם, באישור IRB וטפסי הסכמה חתומים מתורמים.

1. תרבות תאים והכנת CB-SC נגזר בינוני מותן

  1. להעביר 25 מ"ל של דם טבור (טבלת חומרים) מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתי בינוני (γ = 1.077) לתוך צינור חסין 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס ברוטור דלי מתנדנד ללא בלם.
  3. מעבירים בזהירות את שכבת התא המונו-נו-נו-קלר (מעיל באפי) לצינור חרסי חדש של 50 מ"ל. מלא את הצינור החמור עם תמיסת מלח פוספט אגירה (PBS) עד 40 מ"ל. מערבבים וצנטריפוגה לתאי כדוריות ב-751 x g למשך 10 דקות ב-20°C.
  4. השליכו את הסופרנט והוספו 15 מ"ל שלמאגר ACK lysis ( טבלת חומרים ) לתא. להשעות מחדש תאים באמצעות צנרת. לאחר מכן דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: שלב זה מסיר את תאי הדם האדומים.
  5. מלא את הצינור חסני עם 25 מ"ל של PBS. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant כדי להשיג תאים מונו-קלריים כדוריים.
  6. לשטוף 2x עם 40 מ"ל של PBS כדי להסיר את מאגר lysis הנותרים.
  7. צנטריפוגה ב 751 x g עבור 5 דקות כדי גלולות התאים.
  8. השליכו את תאי הדם המונו-גרעיניים של הדם המותאם-גרעיני עם 10 מ"ל של מדיום ללא סרום המוגדר כימי(טבלת חומרים)לכל שפופרת.
  9. שלב תאים חד-קוטביים בדם טבור לצינור אחד.
  10. קח 20 μL התא מתלה ולערבב עם 20 μL של 0.4% פתרון כחול trypan(טבלת חומרים)בצינור 1.5 מ"ל.
  11. טען לתוך שקופית התא וכמת את מספר התא ואת הכדאיות בתא באמצעות מונה תא אוטומטי.
    הערה: מתלי התא מדוללים בשעה 1:10 אם ריכוז התאים הוא מעל 1 x10 7 תאים/מ"ל.
  12. זרעים חד-נשקיים בתאים חד-נשקיים ב-150 מ"מ x 15 מ"מ צ'נרי ב-1 x10 6 תאים/מ"ל, 25 מ"ל/צלחת במדיום תרבות תאים ללא סרום המוגדר כימית.
  13. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 10\u201214 ימים עד CB-SC להגיע יותר מ 80% confluence.
  14. השליכו את הסופרנטנט ושטפו 15 מ"ל PBS לכל צלחת פטרי; לאחר מכן, הסר את PBS.
    הערה: CB-SC מחוברים לצלי פטרי בחוזקה.
  15. חזור על שלב 1.14 פעמיים.
  16. מוסיפים 25 מ"ל של סרום כימי ללא מדיום לכל צלחת פטרי.
  17. דגירה ב 37 °C תחת 8% CO2 תנאים עבור 3\u20124 ימים.
  18. לאסוף את CB-SC נגזר בינוני מותנה לתוך צינורות חרליים 50 מ"ל.

2. אפיון CB-SC

  1. ניתוק CB-SC על ידי pipetting 10 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS למעלה ומטה עם קצה פיפטה 5 מ"ל(טבלת חומרים).
  2. צנטריפוגה ב 1,690 x g עבור 5 דקות לתאי כדוריות ולהשעות מחדש ב 200 μL של PBS.
  3. לתקן ולחלחל תאים עבור כתמים תאיים באמצעות ערכת הכנתהכתמה (טבלת חומרים).
  4. להוסיף 5 μL של בלוק FC (טבלת חומרים) לכל דגימה דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: חוסם Fc מעכב איגוד לא ספציפי בעת הכתמה בנוגדנים.
  5. הוסף נוגדנים חד-אנושיים נגד עכבר פלואורסצינטי, כולל CD34, CD45, SOX2, OCT3/4, CD270 ו- Galectin 9ב- 25 μg/mL (טבלת חומרים) לנפח של 100 μL של תאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
  6. לאחר הכתמה, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 751 x g עבור 10 דקות לתאי גלולה.
  7. להשעות מחדש תאים עם 200 μL של PBS ולהעביר לתוך צינור 5 מ"ל.
  8. בצע ציתום זרימה כדי לאמת את הביטוי של CB-SC המשויך מעל סמנים ספציפיים.

3. בידוד אקסוזומים הנגזרים מ-CB-SC

  1. צנטריפוגה המדיום מותן שנאסף מ שלב 1.18 ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  2. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.1 ב 2,000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
  3. צנטריפוגה supernatant שנאסף מ שלב 3.2 ב 10,000 x g עבור 30 דקות ב 4 ° C. העבר את הסופרנטנט לצינור חורט חדש של 50 מ"ל.
    הערה: הרוטור זווית קבועה משמש כך כדורי התא מואצים לצד של הצינור. סמן את צד המכסה וצייר עיגול בצד הצינור שבו צפויה הגלולה.
  4. מסנן supernatants שנאספו מ שלב 3.3 עם מסנן 0.22 μm(טבלת חומרים).
  5. העברת 15 מ"ל מדיה לכל יחידת סינון צנטריפוגלית של 10 kDa(טבלת חומרים).
  6. צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 30 דקות כדי לבודד את התקשורת אקסוזום מרוכז.
  7. מעבירים את האקסוזומים המרוכזים לצינור אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן, exosomes גלולה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C.
  8. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורי האקסוזומים ב-10 מ"ל של PBS.
  9. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את כדורי exosomes.
  10. להשעות מחדש את כדורי exosomes ב 200 μL של PBS על ידי pipetting למעלה למטה.

4. אפיון אקסוזומים נגזר CB-SC

  1. כימות ריכוז החלבון הכולל של הכנה אקסוזום על ידי ערכת תסוואי חומצה bicinchoninic (BCA)
    1. פיפט 10 μL של כל תקן אלבומין ומבודד exosome מדגם מוכן בשלב 3.10 לתוך צלחת 96-באר בכפילויות.
    2. הוסף 200 μL של reagent עובד מתוך ערכת BCA לכל באר. מערבבים את תכולת הצלחת ביסודיות על שייקר הצלחת במשך 10 שניות.
      הערה: ריאגנט עבודה (WR): ריאגנט A בן 50 חלקים עם ריאגנט B של חלק אחד.
    3. מכסים את הצלחות בנייר כסף ומדגרים אותן ב-37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    4. מצננים את הצלחות לטמפרטורת החדר (RT).
    5. מדוד ספיגה לדוגמה ב- 562 00 00 00 00:00:00,000 -
  2. הכנה והכתמה של אקסוזומים עבור ציטומטריית זרימה
    1. ללכוד exosomes על ידי הוספת 20 μL של חרוזים מגנטיים CD63 אנטי אנושי (4.5 μm גודל) (טבלת חומרים) לתוך 25 μg של exosomes נגזר CB-SC מוכן בשלב 3.10 בסך הכל 100 μL נפח של PBS.
    2. דגירה הצינור בן לילה (18\u201222 h) ב 4 ° C על שייקר ב 800 סל"ד.
    3. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g עבור 30 s לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור.
    4. הוסף 300 μL של מאגר בידוד (0.1% אלבומין סרום של נקניק (BSA) ב- PBS) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting.
      הערה: שלב זה שוטף את האקסוזומים המאוגדים בחרוזים.
    5. מניחים את הצינור על מעמד מגנט למשך דקה אחת (טבלת חומרים) וזורקים את הסופרנטנט.
    6. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    7. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול עם 400 μL של חיץ בידוד.
    8. Aliquot 100 μL של exosomes חרוזים כבולים לכל צינור.
    9. הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים (CD9-FITC, CD81-PE ו- CD63-FITC ב- 25 μg/mL, בהתאמה) לכל צינור זרימה עם exosomes חרוז CD63 שנתפסו.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    10. דגירה במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה על שייקר ב 800 סל"ד.
    11. חזור על שלבים 4.2.4\u20124.2.5.
    12. להשעות מחדש את exosomes חרוזים כבול ב 200 μL של חיץ בידוד ולהעביר צינורות זרימה 5 מ"ל.
    13. מניחים את הצינורות בהסגלה לדוגמה של ציטומטר הזרימה.
    14. פתח את הפרוטוקול לבדיקות אקסו-אקסו-סוחפת.
    15. הפעל את הדגימה באופן אוטומטי על-ידי ציטומטר זרימה.
  3. זיהוי אקסו-זו-ום על-ידי כתם מערבי
    הערה: כתם מערבי היא שיטה מבוססת היטב ולא נלך לפרטים של השיטה עצמה.
    1. Lyse כדורי exosomes נגזר CB-SC מ שלב 3.10 עם 100 μL של מאגר RIPA, פיפטה 20x, ולאחר מכן מניחים על קרח במשך 5 דקות.
    2. לכמת את ריכוז החלבון של exosome lysate על ידי ערכת BCA ולטעון 25 μg של חלבון לכל באר.
    3. הפרדו את החלבונים באמצעות אלקטרופורזה ג'ל במשך 40 דקות ב 150 V.
    4. להעביר את החלבון קרום פלואוריד פוליוינילידן (PVDF) באמצעות העברה חצי יבשה שיטה11.
    5. חוסמים את הממברנה עם 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות.
    6. דגירה עם 2 μg/mL אנטי-אנושי אליקס(טבלת חומרים)ו 1 μg / מ"ל נוגדנים קלנקסין אנטי אנושי(טבלת חומרים).
    7. זהה את החלבון באמצעות כימיומינציה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית.
  4. אימות Exosome על-ידי פיזור אור דינמי (DLS)
    1. לדלל 10 μg של דגימות exosome נגזר CB-SC ב 1 מ"ל של PBS.
    2. מעבירים את ה-1 מ"ל של מדגם מדולל למיקרו-מיקרו חד פעמי(טבלת חומרים).
    3. מניחים את ה-cuvette במכשיר DLS. הגדר את אינדקס שבירה (RI) כ- 1.39 עבור כל הצג לדוגמה.
    4. הפעל דגימות ב- 25 °C ורכוש שלוש מדידות לכל שבר כדי לקבל התפלגות גודל ממוצעת.
  5. אימות אקסו-זופי על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)
    1. מעיל formvar על 300 רשתות נחושת רשת12 (לוח חומרים).
    2. לחזק את formvar עם השכבה הנוספת של פחמן התאדה על רשתות נחושת12.
      הערה: גישת ציפוי כזו מצוינת לתמיכה בדגימות.
    3. טען 10 μL של דגימות אקסו-זום על רשתות ולהשאיר לאוויר יבש.
    4. דגימות כתם שליליות עם אצטט אורניל במשך 5 דקות.
    5. לשטוף שלוש פעמים עם מי DI ולהשאיר לייבוש אוויר.
    6. צפה וצלם את הדגימות תחת TEM. הגדר את מתח ההאצה על 200 kV וגודל ספוט ב 2.

5. למדוד Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes נלקח על ידי תת אוכלוסיות שונות של PBMC

  1. תווית CB-SC נגזר אקסוזומים עם צבע ליפופילי פלורסנט ירוק Dio
    1. להעביר 100 μg של exosomes CB-SC נגזר (מוכן בשלב 3.10) לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    2. לדלל דגימה עם PBS ל 5 מ"ל.
    3. מוסיפים צבע ליפופילי פלואורסצנטי ירוק(טבלת חומרים)עד שריכוז העבודה מגיע ל-5 μM.
    4. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.
    5. מעבירים את הדגימה לצינור אולטרה-צנטריפוגה.
    6. צנטריפוגה ב 100,000 x g עבור 80 דקות כדי כדורי CB-SC נגזר exosomes.
    7. להשעות מחדש את exosomes מתויג ב 200 μL של PBS.
  2. הכנת PBMC אנושי
    1. להעביר 25 מ"ל של מעיל באפי אנושי(טבלת חומרים)מעל 20 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית (γ = 1.077) לתוך צינור חסוני 50 מ"ל.
    2. חזור על שלבים 1.2 עד 1.11.
    3. מעבירים 1 x 106 PBMC לצלחת הידרופובית 24 באר שאינה מטופלת ברקמות (1 מ"ל/באר).
      הערה: צלחת שאינה מטופלת ברקמות שימשה כדי למנוע דבקות במונוציטים.
  3. אקסוזומים בעלי תווית של דיו עם PBMC
    1. להעביר 40 μL Dio-תווית CB-SC נגזר exosomes מוכן בשלב 5.1.7 לכל PBMC המכיל היטב בצלחת 24-באר באמצעות פיפטה 200 μL. הוסף את אותו אמצעי אחסון של PBS כדי לשלוט בארות.
    2. מערבבים על ידי התפתלות 10x. דגירה ל-4 שעות.
    3. לאסוף 200 μL exosome-מטופל PBMC ותווית עם Hoechst 33342 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 100 μL של PBS.
    5. הר תאים על שקופיות מיקרוסקופ.
    6. צפה וצלם את האינטראקציה של exosomes CB-SC-מתויג DIO עם Hoechst 33342 תווית PBMC באמצעות מיקרוסקופ.
    7. העבר את התאים הנותרים מ- 5.3.3 לצינור 1.5 מ"ל.
    8. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C. זרוק את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של PBS.
    9. הוסף 5 μL של חוסם Fc לכל דוגמה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. הוסף נוגדנים (CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14, CD19 ו- CD56 ב- 25 μg/mL) (טבלת חומרים) כדי להכתים PBMC.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    11. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם הגנה קלה.
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות התאים.
    13. להשעות מחדש את התאים עם 200 μL PBS. הוסף 5 μL של פרודיד פרופידיום.
    14. השתמש ציטומטריית זרימה כדי להעריך את רמת ספיגת exosome מתויג Dio באוכלוסיית משנה שונה של PBMC.

6. לבחון את הפעולה של exosomes נגזר CB-SC על מונוציטים

  1. בידוד מונוציטים אנושיים CD14 חיוביים
    1. להעביר 3 x 107 PBMC אנושי לתוך צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    3. מקם את עמודתההפרדה (טבלת חומרים)במפריד המגנט (טבלת חומרים).
    4. לשטוף עמודות ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה קר (טבלת חומרים).
    5. להשעות מחדש את התאים ב 300 μL של PBS קר. הוסף 60 μL של MICROBeads CD14. מערבבים היטב ותדנוד על קרח במשך 15 דקות.
    6. להוסיף 6 מ"ל של PBS קר. צנטריפוגה ב-300 x g ל-10 דקות ב-4°C.
    7. להשעות מחדש את התאים כדוריים ב 500 μL של מאגר ריצה קרה.
    8. העבר תאים לעמודת ההפרדה (שהוכן בשלב 6.14) ותן להם לעבור.
    9. שטוף את עמודת ההפרדה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של מאגר ריצה לכל שטיפה. הרם את העמודה ממפריד המגנט והמקם אותו בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
      הערה: צינור 15 מ"ל צריך להיות ממוקם על קרח בשל הדבקות של CD14 חיובי מונוציטים לצינור בטמפרטורת החדר.
    10. העבר 2 מ"ל של מאגר ריצה קר לראש העמודה ולבודד את התאים CD14 חיובי לתוך צינור 15 מ"ל.
    11. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי גלולות CD14 תאים חיוביים.
    12. להשעות מחדש את התאים עם 2 מ"ל של סרום קר מוגדר כימית חינם בינוני(טבלת חומרים).
    13. להעביר 50 μL של תאים לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    14. כתם עם 10 μL של Krome כתום-התקהלות אנטי-אדם CD14 mAb(שולחן של חומרים)במשך 20 דקות.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כפקדים שליליים.
    15. הוסף PBS 1 מ"ל לתאים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות לתאי כדורי.
    16. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS ולהעביר אותו צינור 5 מ"ל. לקבוע את הטוהר של מונוציטים CD14 חיובי על ידי ציתום זרימה.
  2. טיפול במונוציטים עם אקסוזומים מ-CB-SC
    1. זרע 1 x 106 מונוציטים מטוהרים עם אמצעי תרבות ללא סרום המוגדר כימית (טבלתחומרים)בצלחת 6-well שטופלה בתרבות הרקמות (2 מ"ל/באר).
    2. דגירה ל2 שעות ב 37 ° C תחת 5% CO2.
    3. השליכו את הסופרנטנט עם 1 מ"ל פיפטה. הוסף 2 מ"ל של 37 °C חימום מראש כימי מוגדר סרום חינם תרבות בינונית(טבלת חומרים)בעדינות.
      הערה: מונוציטים היו דבוקים לצלחת בתוך 2 שעות. תאים צפים זוהו כמתים או מזהמים תאים אחרים.
    4. הוסף 80 μg CB-SC נגזר exosomes מבודד לשלב 3.10 לתרביות monocyte בצלחת 6-באר עם נפח כולל של 2 מ"ל.
      הערה: אותו אמצעי אחסון של PBS נוסף כדי לשלוט בארות.
    5. דגירה ב 37 °C תחת 5% CO2 עבור 3\u20124 ימים.
    6. צלם את המורפולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך ב- 200× הגדלה(טבלת חומרים).
    7. ניתוק תאים על-ידי התנתקות למעלה ולמעלה ב- 1 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא מבוסס PBS עם קצה פיפטה 1 מ"ל.
    8. לקצור את התאים המצורפים הנותרים באמצעות מגרד תאים.
      הערה: מאז מונוציטים ראשיים או מקרופאגים מובדילים לצרף בחוזקה, תאים מסוימים נשארים דבודים לתחתית לאחר הטיפול עם מאגר דיסוציאציה. לכן, תאים אלה נקטפים עם מגרד תאים.
    9. לאסוף תאים ב 1,690 x g במשך 5 דקות. להשעות מחדש תאים ב 200 μL של PBS.
    10. הוסף 5 μL של חוסם Fc (25 μg/mL) כדי לחסום איגוד לא ספציפי.
    11. הוסף נוגדנים (CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209 ב- 25 μg/mL, טבלת חומרים)לתאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: IgGs תואמי Isotype משמשים כשליטה שלילית
    12. הוסף 1 מ"ל של PBS לתאים וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. היפטר מהסופרנט והשעה מחדש עם 200 μL של PBS.
    13. להוסיף 5 μL של פרודיד פרופידיום לכל מדגם (200 μL) ולהעביר תאים לצינור זרימה חדש 5 מ"ל.
    14. בצע את ציתום הזרימה והערך את רמות ביטויי CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209.

תוצאות

בתחילה, הפנוטיפ והטוהר של CB-SC נבדקו על ידי ציטומיה זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC כגון leukocyte נפוץ אנטיגן CD45, ES תא ספציפי תמלול גורמי OCT3/4, ו SOX2. CB-SC להציג רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270, ו ביטוי galectin 9, אבל אין ביטוי של CD34 (איור 1A). ניתוח ציטומטריית זרימה אישר את הביטוי של סמנים אקסוזום ס...

Discussion

יישום אקסוזומים הוא תחום מתפתח לאבחון קליני, פיתוחים תרופתיים ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לגבי הכנת exosomes CB-SC נגזר והמחקר הפונקציונלי של exosomes על ההבידול של מונוציטים אנושיים. הפרוטוקול הנוכחי הוכיח כי exosomes CB-SC פונקציונלי נגזר מבודדים על ידי צנטריפוגה רציף ultracentrifugation ע?...

Disclosures

ד"ר זאו הוא מייסד של Tianhe תאי גזע ביוטכנולוגיה Inc. ד"ר זאו הוא ממציא של טכנולוגיית מחנך תאי גזע. לכל המחברים האחרים אין אינטרסים כלכליים שעשויים להיות רלוונטיים לעבודה שהוגשה.

Acknowledgements

אנו אסירי תודה למר פודדר ולמר לודוויג על תמיכה נדיבה במימון באמצעות קרן האקנסק UMC. אנו מעריכים את לורה זאו לעריכה אנגלית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml Microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-129
15 ml conical tubeFalcon352196
24-well plateFalcon351147Non-tissue culture
plate
3,3'-Diostadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)Millipore sigmaD4292-20MGStore at 4 °C
300 Mesh GridsTed Pella1GC300
50 mL conical tubeFalcon352070
6-well plateFalcon353046Tissue culture plate
96-well plateFalcon353072Tissue culture plate
ACK Lysis BufferLonza10-548E100 ml
Amicon-15 10kDa Centrifuge Fliter UnitMillipore sigmaUFC901024
Anti-Human AlixBiolegend634501store at 4 °C, RRID: AB_2268110
Anti-Human CalnexinBiolegend699401store at 4 °C, RRID: AB_2728519
Anti-Human CD11c antibody, Pe-Cy7BD Bioscience561356store at 4 °C, RRID: AB_10611859
Anti-Human CD14 antibody, Karma OrangeBeckman CoulterB36294store at 4 °C, RRID: AB_2728099
Anti-Human CD163 antibody, PEBD Bioscience556018store at 4 °C, RRID: AB_396296
Anti-Human CD19 antibody, PC5Beckman CoulterIM2643Ustore at 4 °C, RRID: AB_131160
Anti-Human CD206 antibody, FITCBD Bioscience551135store at 4 °C, RRID: AB_394065
Anti-Human CD209 antibody, Brilliant Violet 421BD Bioscience564127store at 4 °C, RRID: AB_2738610
Anti-Human CD270 antibody, PEBiolegend318806store at 4 °C, RRID: AB_2203703
Anti-Human CD3 antibody, Pacfic BlueBiolegend300431store at 4 °C, RRID: AB_1595437
Anti-Human CD34 antibody, APCBeckman CoulterIM2427Ustore at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD4 antibody, APCBD Bioscience555349store at 4 °C, RRID: AB_398593
Anti-Human CD45 antibody, Pe-Cy7Beckman CoulterIM3548Ustore at 4 °C, RRID: AB_1575969
Anti-Human CD56 antibody, PEBeckman CoulterIM2073Ustore at 4 °C, RRID: AB_131195
Anti-Human CD63 antibody,PEBD Bioscience561925store at 4 °C, RRID: AB_10896821
Anti-Human CD8 antibody, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterA94686store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD80 antibody, APCBeckman CoulterB30642store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD81 antibody, FITCBD Bioscience561956store at 4 °C, RRID: AB_394049
Anti-Human CD86 antibody, APC-Alexa Fluor 750Beckman CoulterB30646store at 4 °C, RRID: N/A
Anti-Human CD9 antibody, FITCThermoScienticMA5-16860store at 4 °C, RRID: AB_2538339
Anti-Human Galectin 9 antibody, Brilliant Violet 421Biolegend348919store at 4 °C, RRID: AB_2716134
Anti-Human OCT3/4 antibody, eFluor660ThermoScientic50-5841-82store at 4 °C, RRID: AB_11218882
Anti-Human SOX2 antibody, Alexa Fluor 488ThermoScientic53-9811-82store at 4 °C, RRID: AB_2574479
BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA1933
Buffy coatNew York Blood Center40-60 ml/unit
Cell scraperFalcon353085
Disposable semi-micro cuvetteVWR97000590
Dissociation bufferGibco131510014100 ml
Dual-Chanber cell counting slidesBio-Rad1450015
Exosome-Human CD63 Detection reagentThermoFisher Scientific10606Dstore at 4 °C
Ficoll-Paque PLUS density grandient mediaGE Health17-1440-03500 ml
Fixed-Angle Rotor(25°)Thermo Scientifc75003698Maxium 24,700 x g
Gallios flow cytometerBeckman Coulter3 lasers
10 Color Max
Human cord bloodCryo-Cell International40-100 ml/unit
Human Fc BlockBD Bioscience564220store at 4 °C
Immun-Blot PVDF membraneBio-Rad1620177
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMillipore SigmaSLGP033RS
Optima XE-90 UltracentrigugeBeckman Coulter
Orbital Shaker MP4BioExpressS-3500-1
PBSThermoFisher Scientific10010049500 ml
Propidium IodideBD Bioscience56-66211Estore at 4 °C
Nikon Eclipse Ti2 microscopeNikon instruments IncEclipse Ti2NIS-Elements software version 5.11.02
Hochest 33342Thermo Scientifc622495 ml
Revert microsopyFisher scientific12563518
Rotor 41 TiBeckman Coulter331362Maxium 41,000 rpm
Sorvall St 16R CentrifugeThermo Scientifc75004381
Swinging Bucket RotorThermo Scientifc75003655
TC-20 cell counterBio-Rad
ThermoScientific Forma 380 Steri Cycle CO2 IncubatorThermoFisher Scientific
Transmission electron microscopyJEOLJEM-2100 PLUS
Ultracentrifuge tubeBeckman Coulter331372
X'VIVO 15 Serum-free mediumLonzaBEBP04-744Q1000 ml Culture medium, store at 4 °C

References

  1. Zhao, Y. Stem cell educator therapy and induction of immune balance. Current Diabetes Reports. 12 (5), 517-523 (2012).
  2. Zhao, Y., et al. Reversal of type 1 diabetes via islet beta cell regeneration following immune modulation by cord blood-derived multipotent stem cells. BMC Medicine. 10 (1), 3 (2012).
  3. Zhao, Y., et al. Targeting insulin resistance in type 2 diabetes via immune modulation of cord blood-derived multipotent stem cells (CB-SCs) in stem cell educator therapy: phase I/II clinical trial. BMC Medicine. 11, 160 (2013).
  4. Delgado, E., et al. Modulation of autoimmune T-cell memory by stem cell educator therapy: phase 1/2 clinical trial. EBioMedicine. 2 (12), 2024-2036 (2015).
  5. Li, Y., et al. Hair regrowth in alopecia areata patients following Stem Cell Educator therapy BMC. Medicine. 13 (1), 87 (2015).
  6. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell And Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  7. Abak, A., Abhari, A., Rahimzadeh, S. Exosomes in cancer: small vesicular transporters for cancer progression and metastasis, biomarkers in cancer therapeutics. PeerJ. 6, 4763 (2018).
  8. Adamiak, M., Sahoo, S. Exosomes in myocardial repair: advances and challenges in the development of next-generation therapeutics. Molecular Therapy. 26 (7), 1635-1643 (2018).
  9. Akyurekli, C., et al. A systematic review of preclinical studies on the therapeutic potential of mesenchymal stromal cell-derived microvesicles. Stem Cell Review and Report. 11 (1), 150-160 (2015).
  10. Hu, W., Song, X., Yu, H., Sun, J., Zhao, Y. Released exosomes contribute to the immune modulation of cord blood-derived stem cells (CB-SC). Frontiers in Immunology. (11), 165 (2020).
  11. Jacobson, G., Kårsnäs, P. Important parameters in semi-dry electrophoretic transfer. Electrophoresis. 11 (1), 46-52 (1990).
  12. Dykstra, M. J., Reuss, L. E. . Biological Electron Microscopy: Theory, Techniques, and Troubleshooting. , (2011).
  13. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  15. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1(LPS+) vs. classically and M2(LPS-) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 1084 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

165CB SCSCEexosomes2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved