הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

Abstract

זה זמן רב יש החלפה מכרעת בין רזולוציה מרחבית וטמפורלית בהדמיה. הדמיה מעבר למגבלת עקיפה של אור הוגבלה באופן מסורתי לשימוש רק על דגימות קבועות או תאים חיים מחוץ לרקמה המסומנת באות פלואורסצנטי חזק. טכניקות הדמיית תאים חיים ברזולוציית-על הנוכחית דורשות שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות מיוחדות, תאורה גבוהה, רכישות מרובות של תמונות עם עיבוד לאחר הרכישה, או לעתים קרובות שילוב של תהליכים אלה. תנאים מוקדמים אלה מגבילים באופן משמעותי את הדגימות וההקשרים הביולוגיים שניתן ליישם טכניקה זו.

כאן אנו מתארים שיטה לביצוע רזולוציית-על (~ 140 ננומטר XY-רזולוציה) זמן לשגות הדמיית תאים חיים במקום. טכניקה זו תואמת גם עם עוצמה פלואורסצנטית נמוכה, למשל, EGFP או mCherry אנדוגנית מתויגת בגנים בעלי ביטוי נמוך. כהוכחה לעיקרון, השתמשנו בשיטה זו כדי לדמיין מבנים תת-תאיים מרובים באשך Drosophila. במהלך הכנת הרקמה, הן המבנה התאי והן מורפולוגיה של הרקמות נשמרים בתוך האשכים הניתחו. כאן, אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמיין דינמיקה microtubule, האינטראקציות בין microtubules ואת הממברנה הגרעינית, כמו גם את החיבור של microtubules כדי centromeres.

טכניקה זו דורשת הליכים מיוחדים בהכנת מדגם, הרכבה מדגם ושתקה של דגימות. בנוסף, יש לשמור על הדגימות מספר שעות לאחר הניתוח מבלי להתפשר על תפקוד ופעילות התא. בעוד שיש לנו אופטימיזציה התנאים עבור הדמיה ברזולוציה סופר חי במיוחד בתאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs) ותאי נבט אבות ברקמת האשכים ניתחו, טכניקה זו חלה באופן כללי על מגוון סוגי תאים שונים. היכולת להתבונן בתאים בתנאים הפיזיולוגיים שלהם מבלי להקריב רזולוציה מרחבית או זמנית תשמש ככלי רב ערך לחוקרים המבקשים לטפל בשאלות מכריעות בביולוגיה של התא.

Introduction

הדמיית מבנים תת-תאיים ודינמיקת חלבונים בתאים חיים עם רזולוציה מעבר למגבלת עקיפה של האור היא בדרך כלל מאתגרת מאוד^1-3. בעוד טכניקות סופר-רזולוציה מרובות כגון סטוכוסטיק-אופטי-שחזור-מיקרוסקופיה (STORM), פוטו-מופעל-לוקליזציה-מיקרוסקופיה (PALM) ו-Stimulated-Emission-דלדול (STED)^4,5,6 מיקרוסקופיה פותחו, סיבוכים בהכנת הדגימה כמו גם הצורך לשמור על כדאיות ופעילות ex vivo, להגביל את השימוש במיקרוסקופיה סופר-רזולוציה קונבנציונלית עבור דגימות חיות הדמיה. מיקרוסקופיה קונפוקלית קונבנציונלית אינה יכולה להגיע לרזולוציה מרחבית מעבר לרזולוציית XY של ~ 230 ננומטר ולעתים קרובות אינה מספיקה כדי לצפות במת-מבנים תאיים מורכבים^5,6. עם זאת, פיתוח לאחרונה במיקרוסקופיה קונפוקלית, הדמיה סופר-רזולוציית Airyscan, הוא מסוגל להשיג כ 140 ננומטר (XY-רזולוציה)^7,8 ויש לו הכנת מדגם פשוטה יחסית התואמת הדמיה חיה. מאז מערכת זיהוי הדמיה זו דורשת זמן רכישה ארוך, הרזולוציה המרחבית הגבוהה שלה באה במחיר של רזולוציה זמנית⁹. לכן, דרושה שיטה כדי להבטיח כי הדמיית תאים חיים מורחבת עם רזולוציה מרחבית גבוהה.

כאן, פיתחנו שיטה להתבוננות בתאים חיים ברקמה שלמה ברזולוציה האופטימלית שלה לפענוח מבנים תת-תאיים עם מידע מרחבי מפורט. שיטה זו מתוכננת כך שניתן להרכיב דגימות ביציבות במשך תקופה ארוכה של זמן (~ 10 שעות) מבלי לזוז או להתנוון. המדיה התאית החיה המשמשת בטכניקה זו יכולה לתמוך בתפקוד התאי ולהימנע מהלבנת תמונות עד 10 שעות תחת מיקרוסקופ ברזולוציה סופר. לבסוף, פרוטוקול זה ממזער את רוב הלחצים הנגרמים על ידי תאורה מתמדת של לייזרים על פני פרקי זמן ממושכים כגון היפוקסיה, שינויים בלחות וטמפרטורה, כמו גם תשישות תזונתית.

באמצעות פרוטוקול זה כדי לדמיין תאי גזע נבט זכר Drosophila (GSCs), הצלחנו לראות כיצד הפעילות האסימטרית של microtubules מאפשר אינטראקציה מועדפת עם כרומטידים אחות ייחודית אפיגנטית^10,11,12,13. סוגים אלה של אירועים תאיים הם דינמיים מאוד וקשה מאוד לדמיין אותם בתאים חיים באמצעות שיטות הדמיה אחרות ברזולוציית-על כגון STORM, PALM או STED. אנו צופים כי שיטה זו תהפוך שימושית מאוד עבור ביולוגים תא כפי שהם שואפים להבין את המבנים התת-תאיים הדינמיים של תאים חיים המתגוררים ברקמות. ישנם תחומים רבים שבהם ניתן ליישם שיטה זו, כגון לימוד הדינמיקה של חלבונים; הבנת תנועת התאים; ותהליכי מעקב אחר שושלת שושלתיים ובידול סלולרי, בין יישומים אפשריים אחרים.

Protocol

1. הכנת קוקטייל הדמיה של תאים חיים (מדיה סלולרית חיה)

1. תוספת מדיום הדרוזופילה של שניידר עם 15% סרום בקר עוברי (FBS) ו 0.6x פניצילין/סטרפטומיצין. כוונן את ה- pH לכ- 7.0.
2. רגע לפני השימוש במדיום, להוסיף אינסולין לריכוז הסופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל.
   הערה: מדיה זו היא קריטית לשמירה על חלוקת תאים נורמלית ופיתוח של האשכים Drosophila במהלך הדמיה בזמן לשגות^10,14.

2. הכנת צלחת תרבות תא תחתון זכוכית

1. השתמש בצלחת תרבית תאים מצופה L-ליסין מצופה פולי עם קוטר של 35 מ"מ עבור אשכי Drosophila. בבאר הפנימית של המנה יש תחתית זכוכית בקוטר 23 מ"מ וצד עם גובה של 1 מ"מ(איור 1A-a).
   הערה: בחר מנה בתחתית זכוכית המאפשרת מרחק עבודה קצר יותר, צמצם מספרי גדול יותר ויעדת הגדלה גבוהה יותר; תכונות אלה חיוניות להשגת תמונה ברזולוציית-על.
2. השתמש קרום דיאליזה (MWCO: 12-14kD) המאפשר חילופי גזים. חותכים את הממברנה לחתיכות קטנות.
   הערה: חתיכות הממברנה צריך להיות קטן יותר מאשר אזור הזכוכית של המנה אבל גדול מספיק כדי לכסות את הדגימה.
3. להשרות את הממברנה עם 100 μL של מדיה תא חי במשך ~ 5 דקות. אין להשתמש בקרום יבש על המדגם, שכן הוא עלול להזיק לו. ממברנה מסייעת במניעת לחץ היפוקסי.
4. הכן 2-3 חתיכות זכוכית או פלסטיק קל לשים על הממברנה, כך הרקמה לא לצוף. כדי לעשות זאת, ראשית לקחת את הטבעת החיצונית של צינור צנטריפוגה 50 מ"ל לחתוך אותו לחתיכות קטנות. לאחר מכן, לחטא את החלקים עם 70% אתנול לפני השימוש.
   הערה: שלב זה מבטיח כי המדגם נשאר על פני השטח במהלך הדמיה ואינו צף, וזה חיוני להשגת תוצאות אופטימליות.
5. מכינים טבעת בקוטר של כ-25 מ"מ ומניחים אותה בצד המוגבה של המנה. שים כיסוי על זה כדי ליצור שני תאים. התא התחתון יכיל את הדגימה בעוד התא העליון ישמש כתא לחות כדי למנוע את הייבוש של הדגימה.
   1. כדי להפוך את הטבעת הזאת, לחתוך את הטבעת החיצונית מצינור צנטריפוגה 50 מ"ל, אשר יאפשר לו להתאים בבטחה בצד המוגבה של צלחת 35 מ"מ. טבעת דומה יכולה להתבצע בדרכים אחרות, למשל, באמצעות גומייה או עניבת טוויסט מפלסטיק כדי להתאים בצד המוגבה של המנה כדי להחזיק כראוי את כיסוי מבלי להפריע לדגימה.
      הערה: שלב זה הוא קריטי, במיוחד עבור דגימות רגישות ללחצים כגון תנאים היפוקסיים, ושינויים בטמפרטורה ובלחות.

3. ניתוח האשכים מזבובים זכריים והרכבה

1. קח ~ 10 זבובים זכר צעיר (בן 2-3 יום) ולנתח את האשכים בתקשורת התא החי כדי להשיג ~ 10 זוגות של אשכים בוגרים Drosophila.
   1. לנתח את הזבובים תחת מיקרוסקופ ניתוח בצלחת ניתוח באמצעות מלקחיים עדינים.
      הערה: זן Drosophila melanogaster (זבוב פירות) נושא UAS-α-טובולין-GFP טרנסג'ן מונע על ידי ננו-גל 4 נהג תא נבט מוקדם.
   2. צור את הזנים הבאים של Drosophila melanogaster באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9: לאמין-mCherry (תג C-מסוף) ו- CENP-A-Dendra2-CENP-A [תג באתר הפנימי (בין ה -118 - 119 קודון)].
      הערה: בעוד רק אשך אחד באיכות מעולה נדרש עבור כל ניסוי, הרכבה מספיק של רקמות (15-20) או תאים יבטיח כי תהיה לפחות מדגם בריא אחד עם אותות פלואורסצנטי מעולה עבור הדמיה לשגות זמן.
2. לשטוף את האשכים פעמיים במדיה סלולרית חיה בצלחת הניתוח.
   1. השתמש ב- pipette כדי להוסיף מדיה ואחריה הסרת המדיה של התא החי כשלב כביסה.
   2. הסר רקמה עודפת באמצעות מלקחיים. כל רקמה נוספת תפריע להדמיה.
      הערה: אין להשתמש מלוחים חוצצי פוספט (PBS) לשטיפה, מכיוון שהיא עשויה להשפיע על הדינמיקה של רכיבים תאיים מסוימים.
3. מוסיפים 100-150 μL של מדיה סלולרית חיה למנה (מוכנה בשלב 2.1) ומפזרים אותה על משטח הזכוכית באמצעות קצה פיפטה. הפצת המדיה על פני השטח תאפשר לרקמה להיצמד כראוי לצלחת.
4. מעבירים את האשכים לצלחת בעזרת מלקחיים עדינים ומביאים אותם למרכז המנה(איור 1A-b).
   הערה: הימנע מהעברת פסולת מכיוון שהיא תפריע להדמיה ועלול להפחית את איכות התמונה.
5. הסר מדיה סלולרית חיה עודפת (להשאיר כ 10 μL של מדיה) כדי לאפשר את הרקמה לשטח ולהיצמד כראוי לצלחת. בצע שלב זה במהירות כדי למנוע ייבוש המדגם.
6. מניחים את הממברנה הרטובה מראש (מוכנה בשלב 2.2 ו-2.3) על גבי האשכים(איור 1A-c).
7. שים 2-3 משקולות פלסטיק קטנות (שהוכנו בשלב 2.4) על הממברנה כך שהדגימה לא תצוף ותוסיף במהירות 100-150 μL של מדיה חיה של תאים(איור 1A-d).
   הערה: הוספת מדיה במהירות ובעדינות מבטיחה שהדגימה לא תתייבש או תעקור.
8. מניחים את טבעת הפלסטיק (שהוכנה בשלב 2.5) בצד המוגבה של המנה(איור 1B-a).
9. מניחים כיסוי 22 מ"מ x 22 מ"מ מעל הטבעת(איור 1B-b). זה יוצר שני תאים.
10. קחו חתיכת נייר טישו, דכאו אותה במים, ואז מערבבים אותה ושמו אותה על כיסוי, כדי ליצור תא לח(איור 1B-c). סגור את המכסה של המנה (איור 1B-d) ולהתחיל הדמיה תא חי.
    הערה: אם המדגם רגיש לאור, בצע את סעיף 3 בחושך.

4. הדמיית תאים חיים של תאי גזע זכרי Drosophila (GSC) במקום

1. מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ ברזולוציה סופר ומאבטחים אותה עם מלחצי הבמה.
   1. פתח את תוכנת ההדמיה, הפעל את האור המועבר והשתמש במטרה 63x כדי להתמקד ברקמת האשכים עם ידית המיקוד.
      הערה: אם יש קושי באיתור מדגם עם המטרה 63x, השתמש תחילה במטרה 40x או 20x לפני המעבר ל- 63x.
   2. הפעל את הלייזרים, לחץ על Liveומצא את ה- GSC עם המיקום והמצב האופטימליים. הימנע אשכים שיש להם אות פלואורסצנטיות נמוכה או יש את הרכזת (נישה) הרחק מפני השטח.
      הערה: באשכים Drosophila, GSCs מחוברים לרכזת.
2. התאם את המוקד עבור GSCs וזיהה את ההגדרות הנכונות עבור המדגם, כולל כוח לייזר, רווח הכפלת אלקטרונים (EM), ממוצע וזום עבור מצב Airyscan. השתמש בהגדרות הבאות כדוגמה עבור אשכים Drosophila מבטאים EGFP מתויג α-טובולין בתאי נבט בשלב מוקדם.
   1. הגדר את גודל המסגרת בין 512 x 512 פיקסלים ל- 1024 x 1024 פיקסלים על-ידי לחיצה על גודל מסגרת.
   2. הגדר את ממוצע המסגרת ל- 1 או 2 על-ידי לחיצהעל ממוצע .
      הערה: הגדלת גודל המסגרת (>1024 x 1024 פיקסלים) וביצוע ממוצע גדול יותר (כלומר, יותר מ- 2) עלולים לגרום להלבנה או פוטוטוקסיות.
   3. הגדר את כוח הלייזר ל- 1%-2% על-ידי לחיצה על לייזרים.
      הערה: הגברת כוח הלייזר עלולה גם להוביל להלבנה או פוטוטוקסיות.
   4. הגדר את הרווח EM מתחת לרמה המומלצת (< 800) על-ידי לחיצה על רווח מאסטר.
      הערה: רווח EM גבוה יותר עשוי ליצור חפצים.
   5. התקרב לאזור או לתא העניין כדי לקצר את זמן רכישת התמונות ולהפחית את ההלבנה לתמונות. זה גם מאפשר לדגימה לשרוד זמן רב יותר.
3. התחל את לכידת התמונה בזמן התפוגה באמצעות מצב Airyscan על-ידי לחיצה על התחל ניסוי.
   1. לפני לחיצה על התחל ניסוי, ודא שהרכישה מוגדרת בצורה אופטימלית.
   2. אם הוא מציג אזהרה עם ההודעה "רכישת Airyscan אינה מוגדרת בצורה אופטימלית", ולאחר מכן לחץ על אופטימלי בסעיף גודל מסגרת, לחץ על אופטימלי במקטע z-stack ולחץ על אופטימלי עבור אזור סריקה (מינימום של 1.3 זום נדרש עבור הדמיה ברזולוציית סופר).
4. מטב את מרווח הזמן, מספר פרוסות z ומשך הדמיית זמן לשגות על פי העיצוב הניסיוני וסוג הדגימה, כך שאיכות התמונה לא תיפגע והתאים לא ייעצרו בשלבים מסוימים של מחזור התא.
   1. כדוגמה, הפרמטרים עבור הדמיה בזמן לשגות של האשכים Drosophila מבטא EGFP מתויג α טובולין ב germline מוקדם מוצגים בשלבים הבאים.
   2. להדמיה של יותר מ-5 שעות, התמונה במרווח של 10 דקות עם עוצמה של 1% לייזר ולוקחות עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
   3. לתהליכים תאיים דינמיים ביותר, כגון דינמיקת מיקרוטובול, קבע מרווח של 2 דקות בין נקודות זמן, בצע הדמיה של 1-2 שעות בהפסקת זמן בעוצמה של 1% לייזר, וקח עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
   4. לאירועים תאיים נדירים, כגון אנאפאזה לדינמיקת כרומטין מוקדמת של טלופז (אירועים של 2-3 דקות), קבעו הדמיית תאים חיים עם מרווח של דקה אחת בין נקודות זמן, בצעו הדמיה של 30 דקות בזמן ב-1% כוח לייזר, וקח עד 30 פרוסות z בכל נקודת זמן.
      הערה: פרמטרים אלה עשויים להשתנות עבור דגימות שונות, ולכן יהיה צורך בשינוי לשימוש אופטימלי עבור המדגם הספציפי.
5. בצע הדמיה בזמן או הדמיית תמונה חיה, בהתאם לרגישות המדגם ולעיצוב הניסיוני.
   הערה: סרט קצר הוא 15-30 דקות, וסרט ארוך הוא יותר מ 5 שעות.
6. אם המדגם רגיש מאוד ולא ניתן ללמוד אותו על ידי הדמיה בזמן-לשגות עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כפי שקורה לעתים קרובות עם GSCs זכר Drosophila, לבצע תמונה חיה ברזולוציה סופר (SRLS) של המדגם בשלבי מחזור תאים שונים (כפי שמוצג באיור 2, איור 3, איור 4).
   1. אם אירוע ביולוגי נדיר של תאים נלכד או חלבון העניין יש רמת ביטוי נמוכה, אז לבצע SRLS.
   2. עבור SRLS, מצא תא בשלב מחזור התא הספציפי שבו אתה מעוניין. לדוגמה, אם מתמקדים בכריכה מיקרוטובולות-קינטוצ'ורה, יש להשתמש בתא בפרומטפאזה או במטפאזה.
      הערה: זה יעזור להבטיח כי אתה מקבל תמונה באיכות גבוהה של תא העניין בזמן הנכון מבלי להסתכן phototoxicity המדגם או להלבנה של פלואורופורים, אשר עשוי להתרחש במהלך סרט ארוך יותר.
   3. אם אתם משתמשים ב-SRLS, צלם שלבי עניין שונים של מחזור התאים בתאים מרובים וסדר תמונות אלה בסדר כרונולוגי.
      הערה: זה יכול לשמש כדי לבנות סדר זמני של אירועים תוך מקסום בריאות האות והרקמות, כדי לקבל רזולוציה זמנית מצוינת של האירוע עבור דגימות רגישות במיוחד או דגימות עם אות נמוך.

5. עיבוד Airyscan של תמונות התא החי

1. לאחר רכישת תמונה באמצעות תוכנת ההדמיה, בחר עיבוד, לחץ על אצווהולאחר מכן בחר עיבוד Airyscan.
   1. בחר את התמונות לעיבוד ולאחר מכן לחץ על הפעל/תהליך כדי להשיג את התמונות ברזולוציית-על.
   2. בצע את העיבוד באמצעות הגדרת ברירת המחדל.
      הערה: עיבוד Airyscan יפעל רק אם הגדרות ההדמיה נקבעו כראוי עבור הדמיה Airyscan.

תוצאות

הדמיית תאים חיים מעבר למגבלת עקיפה ברקמת Drosophila, במיוחד עבור GSCs, מספק הזדמנות לחקור את הדינמיקה של אירועים תת-תאיים בהקשר של התקדמות מחזור התא. לאחרונה, מחקר המשתמש בפרוטוקול זה הראה כי פעילויות microtubule במרכז האם לעומת הבת centrosome הם אסימטריים זמנית ב- GSCs¹⁰. האם צנטרוזום נובעת m...

Discussion

שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר לספק רזולוציה מרחבית גבוה ככל 10s של ננומטר^4,5,6. שיטות המיקרוסקופיה STORM ו- PALM מאפשרות רזולוציה של עד 20 עד 50 ננומטר (רזולוציית XY), בעוד שמיקרוסקופיית STED מציעה רזולוציה של 20 עד 100 ננומטר (רזולוציית XY). הרזולוציה ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A