מודל ביומימטי לסרטן הכבד לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה בסביבה תלת מימדית עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות

Summary

פרוטוקול זה מציג מודל ביומימטי תלת מימדי עם תא סטרומה פיברוטית נלווית. מוכן עם הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ביחסים המחקים את התכונות הביו-פיזיקליות של המטריצה החוץ-תאית הסטרומלית, מתווך פעיל של אינטראקציות תאיות, צמיחת גידולים וגרורות.

Abstract

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא גידול בכבד העיקרי המתפתח בעקבות מחלת כבד כרונית. מחלת כבד כרונית ודלקת מובילה לסביבה פיברוטית התומכת באופן פעיל ונהיגה hepatocarcinogenesis. תובנה לתוך hepatocarcinogenesis במונחים של יחסי הגומלין בין הגידול סטרומה מיקרו הסביבה תאים סרטניים ולכן יש חשיבות רבה. מודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) של תרבית תאים מוצעים כקישור החסר בין מודלים נוכחיים של תרבות תאים דו-ממדיים במבחנה לבין מודלים של בעלי חיים ב-vivo. מטרתנו הייתה לעצב דגם HCC ביו-מימטי תלת מימדי חדשני עם תא סטרומה פיברוטית נלווית וכלי דם. הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כגון קולגן ופיברינוגן שולבו כדי לחקות את התכונות הביו-פיזיקליות של הגידול ECM. במודל זה תאי LX2 ו- HepG2 המוטמעים במטריצת הידרוג'ל נזרעו על תוסף הטרנסממברן ההפוך. תאי HUVEC נזרעו אז לצד הנגדי של הממברנה. שלושה ניסוחים המורכבים ECM-הידרוג'לים מוטבע עם תאים הוכנו ואת המאפיינים הביו-פיזיקליים נקבעו על ידי rheology. הכדאיות של התא נקבעה על ידי מבחני הכדאיות של התא במשך 21 ימים. ההשפעה של התרופה הכימותרפית דוקסורוביצ'ין הוערכה הן בתרבות הדו-ממדית והן במודל התלת מימדי שלנו לתקופה של 72 שעות. תוצאות הריאולוגיה מראות כי תכונות ביו-פיזיקליות של כבד פיברוטי, cirrhotic ו- HCC ניתן לחקות בהצלחה. בסך הכל, התוצאות מצביעות על כך שמודל תלת מימד זה מייצג יותר את מצב ה- in vivo בהשוואה לתרבויות דו-ממדיות מסורתיות. מודל הגידול בתלת-ממד שלנו הראה ירידה בתגובה לכימותרפיה, מחקה עמידות לתרופות שנראות בדרך כלל בחולי HCC.

Introduction

קרצינומה hepatocellular (HCC) מהווה 90% של כל סרטן הכבד העיקרי^1,2. עם 810,000 מקרי מוות ו 854,000 מקרים חדשים מדווחים מדי שנה הוא מדורג כיום כסרטן החמישי בשכיחותו בעולם עם אחד המקרים הגבוהים ביותר של תמותה¹. הפיתוח של HCC מיוחס בעיקר דלקת הקשורים למחלות כבד כרוניות כלומר, הפטיטיס ויראלי, צריכת אלכוהול מופרזת כרונית, תסמונת מטבולית,^השמנתיתר וסוכרת 1^,3,4.  הדלקת הקשורה לתנאים פתולוגיים אלה גורמת לפציעה hepatocyte והפרשה של ציטוקינים שונים המפעילים ומגייסים תאים כוכביים בכבד ותאים דלקתיים ליזום פיברוזיס⁵. תאים כוכביים בכבד ידועים בתפקיד המפתח שלהם חניכה, התקדמות, רגרסיה של פיברוזיס בכבד. עם ההפעלה הם מבדילים לתוך myofibroblast כמו תאים עם תכונות התכווצות, פרו דלקתיות פרו פיברינוגניים^6,7,8. פיברוזיס וכתוצאה מכך בתורו גורם dysregulation של פעילות אנזים שיפוץ מטריצה חוץ תאית, יצירת סביבה המאופיינת נוקשות מוגברת הכוללת מלווה הפרשת גורמי גדילה, אשר תורם עוד יותר HCC פתוגנזה^9,10. זוהי לולאת משוב פתוגנית רציפה זו בין hepatocytes לבין הסביבה סטרומה, אשר מתדלקת חניכת סרטן, אפיתל למעברים mesenchymal (EMT), אנגיוגנזה, פוטנציאל גרורתי, תגובה תרופתית שונה^11,12,13.  תובנה לגבי hepatocarcinogenesis במונחים של יחסי הגומלין בין הגידול לבין מיקרו-הסביבה הגידול הוא, אם כן, בעל חשיבות רבה לא רק מנקודת מבט מכנית אלא גם מנקודת מבט טיפולית.

מודלים דו מימדיים (2D) בתרבית תאי במבחנה משמשים בעיקר 80% מביולוגים של תאים סרטניים¹⁴. עם זאת, מודלים אלה אינם מייצגים את מיקרו הסביבה הגידול האמיתי, אשר משפיע על תגובות^{כימותרפיות 14,15,16}. כיום 96% מהתרופות הכימותרפיות נכשלות במהלך ניסויים קליניים¹⁴.  שכיחות גבוהה זו בשיעורי התשה של סמים ניתן לייחס לעובדה כי זמין במבחנה טרום הקרנה מודלים אינם מייצגים באופן מלא את התובנה הנוכחית שלנו והבנה של מורכבות HCC ואת microenvironment¹⁶. לעומת זאת במודלים של בעלי חיים vivo נוכח עם מערכת החיסון נפגעת פערים באינטראקציות בין הגידול microenvironment בהשוואה לבני אדם^16,17. בממוצע רק 8% מהתוצאות המתקבלות ממחקרים שנעשו בבעלי חיים ניתן לתרגם באופן אמין מן הפרה קליני להגדרה הקלינית^16,17. לכן, ברור כי ההערכה של HCC דורשת פיתוח של פלטפורמת במבחנה כי ביעילות recapitulates את המורכבות של לא רק את הגידול, אלא גם את microenvironment. הפלטפורמות ישלימו את המודלים הזמינים כיום במבחנה לפני ההקרנה הקלינית ויפחיתו את כמות המחקרים בבעלי^חייםבעתיד 7^,14.

פלטפורמה אחת כזו היא מודלים מתקדמים של תרבות תאים תלת מימדית (תלת מימדית). מספר רב של מודלים תלת-ממדיים מתקדמים אלה לחקר HCC הופיעו בעשור האחרון ופורסמו ביקורות שונות. מודלים תלת-ממדיים זמינים לחקר HCC כוללים כדוריות רב-תאיות, אורגנואידים, דגמים מבוססי פיגומים, הידרוג'לים, מיקרופלואידים והדפסה ביולוגית. מתוכם, ספרואידים רב תאיים הם אחד המודלים הידועים ביותר המשמשים במחקר של התפתחות הגידול. Spheroids הם מודל זול עם קושי טכני נמוך בעת ובעונה אחת ביעילות מחקה בארכיטקטורת גידול vivo^18,19,20. כדוריות רב תאיות תרמו שפע של מידע על HCC^17,21,22. עם זאת, זמן תרבות סטנדרטי חסר כמו כדוריות רב תאיות נשמרים בתרבות בין 7 ל 48 ימים. זמן תרבות מוגבר הוא בעל חשיבות רבה. Eilenberger מצא כי ההבדלים בגיל ספרואידי משפיע עמוקות Sorafenib (מעכב קינאז המשמש לטיפול בסרטן הכבד) דיפוזיביות ורעילות²³. בעוד Wrzesinski ופיי מצאו כי 3D hepatocyte spheroids דורשים 18 ימים כדי להקים מחדש פונקציות כבד פיזיולוגיות מפתח לאחר trypsinization וממשיך להפגין את הפונקציונליות היציבה עד 24 ימים לאחר התאוששות זו^24,25.

חלק מדגמי HCC תלת-ממדיים מתקדמים יותר כוללים שימוש בפיגומי כבד דקולריים אנושיים ופיגומים מודפסים ביולוגית. מאזה ועמיתיו יצרו פיגום תלת מימדי טבעי למידול HCC באמצעות כבדים אנושיים דקולריים שאינם מתאימים להשתלה²⁶. פיגומים טבעיים אלה יכולים להיות מאוכלסים בהצלחה במשך 21 ימים עם תרבות משותפת של כוכבי הכבד ותאי hepatoblastoma, תוך שמירה על הביטוי של רכיבי מטריצה חוץ תאיים מפתח כגון סוג קולגן I, III, IV ו fibronectin. מלבד מידול מחלות, מודל זה מציע גם את היתרון של השתלת איברים תפקודית והקרנת תרופות ורעילות פרה-קלינית²⁶. עם ההתקדמות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית, ניתן כעת גם להדפיס ביו-הדפסת פיגומים מטריצה תלת-תאית תלת-ממדית.  Ma ועמיתיו, פיגומים מטריצה חוץ-תאית בהדפסה ביולוגית עם תכונות מכניות משתנות ומיקרו-ארכיטקטורה ביומימטית באמצעות מהנדס הידרוג'לים ממטריצה חוץ-תאית²⁷. אין ספק שכל אלה הם דגמי HCC תלת מימדיים מצוינים. עם זאת, אי זמינות הכבד האנושי ואת העלות הכרוכה ברכישת הציוד והחומרים הדרושים מציב מודלים אלה בעמדת נחיתות. בנוסף, שיטות אלה הן כל מתקדם מבחינה טכנית הדורש הכשרה נרחבת כי לא יכול להיות זמין לכל החוקרים.

בהתבסס על המורכבות של HCC ודגמי תלת-ממד הזמינים כיום, השתדלנו לפתח דגם HCC תלת-ממדי מקיף. כיוונו למודל המסוגל לכבוש מחדש הן את המיקרו-ווירונינציה הטרום-מלבנית והן את המיקרו-וירוס הגידולי על ידי שילוב ערכי נוקשות הידרוג'ל מתכווננים.  יתר על כן, כללנו גם קווי תאים hepatocellular ו סטרומה הקשורים, כי לשחק תפקיד מפתח פתוגנזה של HCC. אלה כוללים תאי אנדותל, תאי כוכבי כבד והפטוציטים ממאירים, הגדלים במיקרו-וירוס המורכב מהידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. עם הידרוג'לים שנבחרו, קולגן מסוג I ופיברינוגן, המשולב ביחסים דומים לשינויים ביו-פיזיים שנראו בנוקשות הכבד במהלך החניכה וההתקדמות של HCC.  בנוסף, כיוונו למודל שניתן לשמור בתרבות לתקופה ממושכת. דמיינו מודל מודולרי וחסכוני שניתן להתקין עם ציוד בסיסי, הכשרה וניסיון מינימליים וחומרים זמינים.

Protocol

איור 1: תיאורים גרפיים של יצירת דגם HCC הביומימטי תלת מימדי אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הערה: זרימת העבודה הכוללת של פרוטוקול זה מוגדרת באיורים של איור 1

1. הכנת פתרון מלאי פיברינוגן

1. הכן 1 M סידן כלורי (CaCl₂₎פתרון מלאי, על ידי שקילה 2.21 גרם CaCl₂ והוספתו 20 מ"ל מים מזוקקים (dH₂O). פתרון מלאי ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
2. הכן פתרון מלאי אפרוטינין 20 מ"ל (1218.75 KIU / מ"ל) על ידי שקילה 5 מ"ג של אפרוטינין והוספתו 20 מ"ל dH₂O. פתרון מלאי Aliquot לתוך 1 aliquots mL ולאחסן ב -20 °C (60 °F).
3. הכן 10 מ"ל של 80 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי פיברינוגן.
   1. בצינור 50 מ"ל להוסיף 7.849 מ"ל פוספט אגירה מלוחים (PBS), 2.051 מ"ל מלאי אפרוטינין (1218.75 KI /mL) עבור ריכוז אפרוטינין הסופי של 250 KIU / mL ו 100 μL CaCl₂ (1M) עבור ריכוז CaCl_{הסופי 2} של 10 מ"מ.
   2. שוקל 800 מ"ג של פיברינוגן.
   3. לשקול 200 מ"ג נתרן כלורי (NaCl) עבור פתרון המניה להכיל 2% w / v NaCl.
   4. מוסיפים את הפיברינוגן ואת NaCl במרווחים לצינור 50 מ"ל המכיל את PBS, אפרוטינין ו CaCl₂. אין לערבב או לנער במרץ שכן הדבר יגרום ג'ל ג'ל פיברינוגן וגושים להרכיב את הפתרון.
   5. מניחים את הצינור 50 מ"ל של פתרון מלאי פיברינוגן אופקית על שייקר ולנער בהגדרה נמוכה של 300 סל"ד.
4. לאחר שהפתרון התפוגג, סנן אותו באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר או מסנן עליון של בקבוק בהתאם לעוצמת הקול. חשוב לציין, לא autoclave פתרון פיברינוגן כמו זה יהרוס את פיברינוגן.
   הערה: חלק זה של הפרוטוקול יכול לקחת בין 2 ל 5 שעות בהתאם לכמות פתרון המניות, הפעם יש לקחת בחשבון במהלך ההתקנה הניסיונית.

2. ציפוי מוסיף עם קולגן לפני זריעת הידרוג'ל על מוסיף

1. במכסה המנוע של זרימה למינארית או מכסה המנוע של תרבות הרקמות, באמצעות פינצטה מעוקרת, מסירים מוסיף מהצלחת ומניחים הפוכים על מכסה הצלחת.
2. הכן 100 מ"ל של 20 מ"מ אצטית חומצה אצטית פתרון על ידי הוספת 115 μL של חומצה אצטית קרחונית ל 25 מ"ל של dH₂O ולהתאים את הנפח הסופי של 100 מ"ל עם dH 2 O._לסנןאת הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. פתרון מלאי ניתן לאחסן ב- RT.
3. הכן 2 מ"ל של פתרון קולגן 100 מיקרוגרם / מ"ל מתמיסת קולגן 5 מ"ג / מ"ל על ידי הוספת 40 μL של פתרון קולגן 5 מ"ג / מ"ל ל 1.960 מ"ל של פתרון 20 מ"מ חומצה אצטית קרחונית מוכן 2.2.
4. מצפה את מוסיף עם 100 מיקרוגרם / מ"ל פתרון קולגן מוכן 2.3 על ידי pipetting 100 μL של הפתרון על כל הכנס. בואו מכניס אוויר יבש בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר או מכסה המנוע תרבית רקמה במשך 2 עד 3 שעות.
5. לאחר תוספות יש לשטוף מיובשים כל להוסיף 3x עם PBS. מוסיפים 1 מ"ל של PBS לכל באר של צלחת 12 באר, מניחים את התוספות עם ציפוי קולגן הפונה כלפי מטה לתוך הבארות, להסיר PBS מהבאר ולחזור על ההליך. בואו מכניס אוויר יבש בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר 1 עד 2 שעות.
   התראה: חומצה אצטית רעילה לתאים ויש לשטוף אותה ביסודיות עם PBS.
6. הוסף מרווח מודפס תלת-ממדי מותאם אישית מעל התוספות, יהיה צורך בכך ברגע שהג'לים תלויים מההוספה כדי למנוע מהם לגעת בבאר התחתונה של הצלחת(איור 2).

איור 2: מרווח מודפס בתלת-ממד מותאם אישית אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

7. מכסים את התוספות ההפוכות בחלק התחתון של הצלחת ומניחים באינקובטור עד שהתאים מוטבעים בהידרוגלים ומוכנים לזרע.

3. תאי זריעה מוטבעים הידרוג'לים על מוסיף

הערה: טבלה 1 מספקת תיאור של 3 ניסוחים עם ריכוזים משתנים פיברינוגן כי יהיה מוכן. ניסוח אחד מתאים לכבד במהלך הופעת פיברוזיס, שתי שחמת ושלושה HCC, ערכי הנוקשות עבור כל אחד ניסוחים אלה נקבעו עם rheology במהלך אופטימיזציה פרוטוקול.

ניסוח	ריכוז פיברינוגן סופי (מ"ג/מ"ל)	ריכוז קולגן סופי (מ"ג/מ"ל)	תאים (LX2 + HepG2 שיתוף תרבות 1:1)	שלב הכבד	ספרות ערכי נוקשות בכבד (kPa)	ערך נוקשות דגם מרולוגיה (kPa)	ניסוח	פיברינוגן להוסיף (מ"ל)	קולגן להוספה (מ"ל)	10 % DMEM (מ"ל)	תרומבין (μL)	אסמכתאs
1	10	2	2 x 106 תאים/מ"ל	פיברוזיס	≥2	3	1	1	0.8	0.2	4	28; 29; 30
2	30	2	2 x 106 תאים/מ"ל	שחמת		6	2	0.75	0.8	0.45	3
3	40	2	2 x 106 תאים/מ"ל	עותק מוסתר	≥10	10	3	0.25	0.8	0.95	1	28; 31; 32

טבלה 1: תיאור ניסוחים לתאי זריעה המוטמעים בהידרוגלים על מוסיף

1. הכן 1 M פתרון מלאי נתרן הידרוקסידי על ידי הוספת 3.99 גרם של NaOH ל 100 מ"ל של dH₂O.  לאחר מכן ניתן לסנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. אחסן את פתרון המלאי ב- RT.
2. מניחים את הקולגן 5 מ"ג / מ"ל ו 10 מ"ל של 1 M NaOH על קרח.
3. מחממים מראש 50 מ"ל PBS, 15 מ"ל טריפסין, 70 מ"ל 10% DMEM, ופתרון מלאי פיברינוגן, מוכן בסעיף 1, כדי 37 °C (77 °F) במשך 20 דקות באמבט מים.
4. הכינו את השעיות התאים.
   1. לשטוף תאים כוכבי הכבד (LX2) ו קרצינומה של הכבד (HepG2) תאים T175 תרבות בקבוקים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS.
   2. טריפסיניזציה של תאים עם 6 מ"ל טריפסין במשך 4 דקות ב 37 °C (67 °F).
   3. השבת את טריפסין עם 6 מ"ל של 10% DMEM.
   4. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 15 מ"ל וצנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
   5. לאחר צנטריפוגה, לשאוף את supernatant ו resuspend כל קו התא ב 5 מ"ל של 10% DMEM.
   6. ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי: הוסף 10 μL של כל השעיית תא לשקופית תא הספירה והכנס את השקופית לדלפק התא. ספירת תאים מוצגת כתאים/מ"ל.
   7. לדלל את התאים מכל קו תא ל 1 x 10⁶ תאים למ"ל באמצעות ספירת התאים בשלב 3.4.6 לתוך מסומן בבירור 15 צינורות מ"ל. צנטריפוגה דילול במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
5. לאחר צנטריפוגה, לשאוף את supernatant ולהוסיף 10% DMEM לכל צינור 15 מ"ל על פי טבלה 1, ערכים המסופקים בטבלה הוא עבור 2 מ"ל של כל ניסוח.
6. לנטרל את כמות הקולגן עם 10 μL / mL NaOH (1 M), ולהוסיף את הקולגן המנוטרל להשעיית התא, הנוכחי 10% DMEM יהפוך צהוב, פעם ההשעיה מעורבבת ביסודיות על ידי pipetting עם קצה לחתוך זה יהפוך ורוד בהיר.
7. מוסיפים פיברינוגן להשעיית תאי הקולגן על פי טבלה 1, באמצעות קצה פיפטה חתוך, מערבבים את ההשעיה ביסודיות.
8. לבסוף להוסיף תרומבין להשעיית תאי קולגן-פיברינוגן, 0.1 כרומבין KIU עבור כל 10 מ"ג של פיברינוגן.
9. הסר את מוסיף הפוך מצופה מראש מוכן בסעיף 2 מן החממה באמצעות קצה פיפטה לחתוך 200 μL, פיפטה 200 μL של ההשעיה מוכנה על מוסיף המיועד. אפשר את הג'לים לחצות במשך 15 דקות בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר.
10. לאחר 15 דקות, מניחים בעדינות את החלק התחתון של הצלחת מעל הג'לים ומעבירים אותם לאינקובטור כדי לאפשר לג'לים לצליבה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות.
11. לאחר הג'לים יש crosslinked, להפוך את מוסיף שוב ולהוסיף 2 מ"ל של 10% DMEM לכל אחת מהבארות התחתונות של הצלחת.

4. זריעת תאי אנדותל

1. מחממים מראש 25 מ"ל תמיסת מלח מאוזנת (HBSS), 10 מ"ל טריפסין, מעכב טריפסין 10 מ"ל ובינוני צמיחה אנדותל 50 מ"ל, ל 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות באמבט מים .
2. הכן את השעיית התא אנדותל (HUVEC).
   1. לשטוף תאי HUVEC בבקבוקי תרבות T175 פעמיים עם 10 מ"ל HBSS.
   2. טריפסיניזציה של תאים עם 6 מ"ל טריפסין במשך 4 דקות ב 37 °C (67 °F). להשבית טריפסין עם מעכב 6 mL טריפסין. לאסוף את ההשעיה התא ב 15 מ"ל של צינור צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x g.
   3. לאחר צנטריפוגה לשאוף את supernatant ולהשעות את התאים במדיום צמיחה אנדותל 5 מ"ל.
   4. ספור את התאים כפי שתוארו קודם לכן ב- 3.4.6 באמצעות מונה תאים אוטומטי.
   5. באמצעות ספירת התאים מדלפק התא, להכין צפיפות זריעה של 1.0 x 10⁴ תאים / מ"ל במדיום צמיחה אנדותל.
3. זרע 500 μL של המתלה תא HUVEC לתוך כל באר של החלק העליון של הכנס יש נפח סופי של 5.0 x 10³ תאים לכל הכנסה.

5. תחזוקה

1. החלף את מדיום הצמיחה כל יום שני, שאף מדיום צמיחה בילה הן מן הבאר ואת הכנס. הוסף 2 מ"ל 10% DMEM לבארות המכילות את הג'ל ואת 0.5 מ"ל אנדותל צמיחה בינונית לתוספות המכילות את תאי HUVEC.
2. לשמור על המודל במשך 21 ימים לפני הניסוי.

6. ריאולוגיה

1. למדוד מודולי אחסון של ניסוחים ג'ל כדי להצביע על ערכי נוקשות באמצעות rheometer, על ידי ביצוע מטאטא תדר מ 0.1-20 Hz ב 0.267% ו 37 ° C, עם כוח צירי קבוע של 0.1N באמצעות גיאומטריה פלנטה פלנטה מקבילה 8 מ"מ קוטר.

7. כדאיות ותגובת סמים

1. לקבוע את תגובת התרופה ואת הכדאיות בתרבויות דו-ממדיות ומודל תלת-ממד.
   1. זרע HepG2 (5.0 x 10³ תאים / מ"ל) ו LX2 (5.0 x^{10 3} תאים / מ"ל) תאים ביחס 1:1 עבור תרבות 2D לתוך שחור ברור התחתון 96-באר צלחות בצפיפות זריעה של 1.0 x 10⁴ תאים / מ"ל.  אפשר לתאים להתחבר בן לילה.
   2. הגדר את דגם תלת-ממד כך שיתאים לסביבה cirrhotic עם ערך נוקשות של 6 kPa.  לשמור על המודל במשך 21 ימים לפני הטיפול Doxorubicin.
2. שעתיים לפני הטיפול doxorubicin, לשאוף את מדיום התרבות הן מודל 2D ו 3D. לשטוף את שני הדגמים פעמיים עם PBS. הוסף את מדיום הרעב (DMEM בתוספת 1% v / v פתרון אנטיביוטי אנטי מיקוטי) לתרבות 2D co-culture (200 μL לבאר) ולדגם 3D (2 מ"ל לבארות המכילות הידרוג'ל ו 500 μL לתוספת).
3. מנהל דוקסורוביצ'ין הן לדגם הדו-ממדי והן לדגם התלת-ממד.  המינונים הם כדלקמן: 0.5, 1 ו 1.5 mM המתאים IC25, 50 ו 75 ערכים, בהתאמה.  לטפל בשני הדגמים עבור 72 שעות.
   הערה: Doxorubicin, מעכב topoisomerase II, היא אחת התרופות הכימותרפיות הראשונות המשמשות HCC והוא גם אחד הסוכנים הכימותרפיים הפעילים ביותר בטיפול HCC^33,34.
4. לאחר 72 שעות, מדיום תרבות שאפתן הן מדגם דו-ממדי והן מדגם תלת-ממדי. ודא שכל מדיום תרבות שנותר מוסר על-ידי שטיפת שני הדגמים פעמיים באמצעות PBS.
5. הכן AlamarBlue על פי המלצות היצרן ולהוסיף את בארות של דגם 2D ו 3D. הוסף 150 μL לבאר לתרבות 2D ו 2 מ"ל לבאר ו 500 μL לכל תוסף לתרבות 3D.  דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
6. לאחר העברת הדגירה 150 μL של AlamarBlue מכל באר של ההתקנה 3D לתוך צלחת שחורה ברורה 96-באר. AlamarBlue ניתן לקרוא ישירות מהצלחת עבור דגם 2D.
7. קרא את הפלואורסצנטיות עם קורא microplate באורך גל עירור ואורך גל פליטה של 485 ו 550 ננומטר, בהתאמה.
8. חשב את אחוז הכדאיות של התאים בשני הדגמים באמצעות הנוסחה הבאה:
   

תוצאות

טווחי ריכוז ונפח זריעה
מיטוב פרוטוקול כדי להשיג את פרוטוקול התפקוד הסופי התרחש בהתאם לדיאגרמה הסכימטית המוצגת באיור 3. שני הידרוג'לים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, קולגן מסוג I ופיברינוגן, זוהו באמצעות חיפוש^{ספרותי 35,36}.  החל מסוג קולגן זנב עכברוש I, מגוון של ריכוזים (4, 3, 2 ו 1 מ"ג / מ"ל) היה זרע על מוסיף הפוך כדי לקבוע את יכולתם לדבוק בהצלחה לתוסף פעם הפוכה שוב. כל הריכוזים בטווח זה הצליחו ליצור ג'לים, אולם ג'לים של קולגן נראו שטוחים והיו בהם בועות אוויר שונות שנלכדו בהן בגלל טיפול וצנרת, ראו איור 4 ואיור 5. כדי לקבוע את נפח הזריעה האופטימלי כדי לשפר את איכות ג'ל הקולגן, מגוון כמויות זריעה (100, 150 ו-200 μL), נזרע על תוספות הפוכות, ראה איור 5.  נפח הזריעה לא השפיע על המראה של הג'ל או על נוכחות של בועות בתוך הג'ל. בהתאם לכך, הוחלט כי 200 μL היה נפח הזריעה האופטימלי המייצר את הג'לים המלאים ביותר. פיברינוגן הוערך גם בשל יכולתו לייצר ג'ל שיכול לדבוק בהכנסה לתקופה ממושכת.  טווח ריכוז (70, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1 מ"ג/ מ"ל) הוכן וזרע בנפח של 200 μL על המכסה של צלחת 12 באר, ראה איור 6. בתוך 20 דקות לאחר זריעת כל הריכוזים הצליחו ליצור בהצלחה ג'ל. עם זאת, הריכוזים 5 ו 1 מ"ג / מ"ל לא נכלל כמו הג'לים שנוצרו היה נוזל כמו עקביות והחל להתנתק מהמכסה לאחר שהוחזק לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

איור 3: דיאגרמה סכמטית של מיטוב פרוטוקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ג'ל קולגן 4 מ"ג/מ"ל המכיל 1.0 x 10⁵ תאים/מ"ל הנגזרים על מוסיף המציג בועות הנמצאות בג'ל. הכנס בצד שמאל היה degassed על קרח במשך 15 דקות, בעוד להוסיף בצד ימין לא היה degassed. Degassing לא הייתה כל השפעה על הבועות הנוכחיות בג'לים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: ג'לים של קולגן 4 מ"ג/מ"ל המכילים 1.0 x 10⁵ תאים/מ"ל הנגזרים על תוספות בנפחים משתנים. (A) הכנס בצד שמאל 100 μL, אמצע 150 μL וימינה 200 μL, ישירות לאחר הזריעה. בועות בג'לים עדיין היו קיימות. (B) הכנס בצד שמאל 200 μL, אמצע 150 μL וימינה 100 μL, לאחר 60 דקות הצלבה. כל הג'לים ללא קשר לנפח עדיין נראים שטוחים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: פיברינוגן (200 μL) בטווח ריכוז שבין 70 ל-1 מ"ג/מ"ל שזרע על מכסה של צלחת של 12 בארות. (A)ג'לים מיד לאחר הזריעה. (B)ג'לים 20 דקות לאחר הזריעה. (ג)ג'לים שמרו על הלילה. כל הג'לים נראים מעוגלים היטב, 5 מ"ג / מ"ל ו 1 מ"ג / מ"ל ג'ל לא נכללו כפי שנראה שיש להם עקביות נוזלים יותר 20 דקות לאחר הזריעה והתחיל להתנתק מהמכסה לאחר שהוחזקו לילה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קולגן משולב ופיברינוגן
בהתבסס על התוצאות של ריכוז קולגן ופיברינוגן נע ההשפעה של שילוב קולגן ופיברינוגן הוערך. שלוש תוספות הוגדרו עם הבאים, 4 קולגן מ"ג/מ"ל, 20 מ"ג/מ"ל פיברינוגן ומנה של 1:1 קולגן (4 מ"ג/מ"ל) ופיברינוגן (20 מ"ג/מ"ל), ראו איור 7. מיד לאחר זריעת הידרוג'לים, ראינו כי הכנס עם קולגן לבד עדיין היה מראה שטוח בשילוב עם המופע של בועות בתוך הג'ל. התוספות עם פיברינוגן יצרו ג'ל מלא מעוגל, כך גם הכנס עם שילוב של קולגן ופיברינוגן. לאחר קישור צולב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, כל הג'לים היו מחוברים לתוסף ונשאר מחובר לאחר דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.

איור 7: השפעת השילוב של קולגן ופיברינוגן. (A)קולגן 4 מ"ג / מ"ל זרעים על הכנס בצד שמאל, פיברינוגן 20 מ"ג / מ"ל זרעים על הכנס באמצע קולגן 4 מ"ג / מ"ל, פיברינוגן 20 מ"ג / מ"ל (1:1 מנה) זרע על הכנס בצד ימין. כל הג'לים זרעו בנפח של 200 μL המכיל 1.0 x 10⁵ תאים / מ"ל, כל הג'לים היו מקושרים במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. (B) קולגן 4 מ"ג / מ"ל 60 דקות לאחר crosslinking, ג'ל הופיע שטוח היו בועות. (C) הכנס על פיברינוגן שמאל 20 מ"ג / מ"ל, ג'ל מופיע מעוגל, אין בועות נוכח, להכניס על הקולגן הימני 4 מ"ג / מ"ל, פיברינוגן 20 מ"ג / מ"ל ג'ל, ג'ל מעוגל היטב ללא בועות. (D)קולגן 4 מ"ג / מ"ל ג'ל לאחר שהוחזק לילה ב 37 מעלות צלזיוס, ג'ל עדיין הכיל כמות גדולה של בועות, כמה נפיחות של הג'ל התרחשה. (ה)פיברינוגן 20 מ"ג / מ"ל נשמר לילה ב 37 °C(F)קולגן 4 מ"ג / מ"ל, פיברינוגן 20 מ"ג / מ"ל ג'ל נשמר לילה ב 37 °C (69 °F).

קביעת צפיפות זריעת תאים
בהתבסס על הניסיון הקודם של עבודה עם הידרוג'לים נערך ניסוי כדי לקבוע את צפיפות זריעת התא האופטימלית (נתונים שאינם מוצגים)³⁷. התאים הוטמעו בשילוב של קולגן ופיברינוגן בטווח הריכוז הבא (7.5 x 10⁵, 8.5 x 10⁵, 9.5 x 10⁵, 1.0 x 10⁶, 1.5 x 10⁶ ו 2.0 x 10⁶ תאים / מ"ל), 2.0 x 10⁶ תאים / מ"ל נמצאה צפיפות הזריעה האופטימלית.

ריאולוגיה (Rheology)
עשרה ניסוחים של שילובי פיברינוגן וקולגן הידרוג'ל הוערכו באמצעות rheology, ראה טבלה 2. המטרה הייתה לקבוע אילו ניסוחים אלה יכולים לחקות נוקשות בכבד לראות במהלך הפיתוח של HCC. הספרות סיפקה ערכי נוקשות כבד ידועים לחולדות, עכברים ובני אדם במהלך פיברוזיס, שחמת הכבד ו- HCC והמטרה הייתה להתקרב ככל האפשר לערכים אלה^{28,29,30,31,32}. עשרת הניסוחים כפי שנקבעו בטבלה 2 הוכנו המשולש ומודולוס האחסון של כל אחד מהם נקבע באמצעות מד קנה-בקר, התוצאות המוצגות באיור 8.

ניסוח	פיברינוגן (מ"ג/מ"ל)	קולגן (מ"ג/מ"ל)
1	60	2
2	50	2
3	40	2
4	30	2
5	20	2
6	10	2
7	20	5
8	20	4
9	20	3
10	20	1

טבלה 2: שילובי קולגן ופיברינוגן בריכוזים שונים המוערכים עם Rheology כדי לקבוע ערכי נוקשות

איור 8: ערכי נוקשות הידרוג'ל לשילובי קולגן ופיברינוגן בריכוזים שונים המוערכים עם רייולוגיה. מודולוס אחסון ומודולוס אובדן נקבעו ב 37 °C (70 °F) ו 1Hz באמצעות ריומטר היברידי דיסקברי HR-2 (n = 3, קווי שגיאה = SD). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מתוך עשר נוסחאות אלה שלוש נבחר להמשיך עם. אלה כללו 2 מ"ג / מ"ל קולגן מסוג I ו 10 מ"ג / מ"ל פיברינוגן המתאים לערכי נוקשות בכבד בתחילת פיברוזיס, 2 מ"ג / מ"ל קולגן מסוג I ו 30 מ"ג / מ"ל פיברינוגן המתאים שחמת הכבד ו 2 מ"ג / מ"ל קולגן סוג אני ו 40 מ"ג / מ"ל פיברינוגן המתאים HCC, ראה איור 9.

איור 9: ערכי נוקשות הידרוג'ל לניסוחים שונים של הידרוג'ל פיברינוגן/קולגן שנבחרו להמשיך איתם.  מודולוס אחסון מודולוס אובדן נקבעו ב 37 °C (70 °F) ו 1 הרץ (n = 3, קווי שגיאה = SD). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

כדאיות, תגובת סמים ופוטנציאל גרורתי
תוצאות הבדיקה של AlamarBlue הראו יכולת הכדאיות הכוללת מופחתת של התאים בתוך תרבות הדו-מימדית המשותפת, נמוכה מהצפוי בהתבסס על ערכי IC 25, 50 ו- 75 המדווחים הידועים, בהשוואה לפקד הלא מטופל, ראה איור 10. ניתן לייחס זאת לתאי LX2 בתרבות המשותפת שלנו הרגישים יותר לטיפול ב-Doxorubicin. עם זאת, במודל 3D שלנו שמנו לב ולהגדיל את ההתנגדות דוקסורוביצין, המאשר את הירידה בפוטנציאל כימותרפי לעתים קרובות לראות במערכות מודל 3D. מובהקות סטטיסטית בהשוואה לבקרות הוערכה באמצעות מבחן סטודנט T (דו-זנבי), כאשר P<0.05 נחשב משמעותי.

איור 10: אחוז הכדאיות של מודל תרבות משותפת דו-ממדית בהשוואה לדגם התלת-ממדי לאחר טיפול בדוקסורוביצ'ין בריכוזים שונים לתקופה של 72h. התוצאות מנורמלות ביחס לפקד שאינו מטופל (n= 3, קווי שגיאה = SD) (* = p<0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מבני הג'ל נבדקו חזותית מדי יום באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לעקוב אחר צמיחת התאים בתוך ריכוזים שונים של הידרוג'לים. התאים מילאו את ההידרוג'לים בצורה הומוגנית וקומפקטית, מהיום 7 ספרואידים החלו להתאסף בתוך המטריצה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של שיטה ליצירת מודל ביומימטי עבור HCC. נוצרה זרימת עבודה ברורה והשלבים הקריטיים הכרוכים בכך זוהו. צעדים קריטיים אלה כוללים, הכנת פתרון מלאי פיברינוגן, ציפוי מוסיף עם קולגן וזרע התאים imbedded לתוך הידרוג'ל. במהלך הכנת פתרון מלאי פיברינוגן חשוב להוסיף את פיברינוגן במרווחים קטנים יותר בריכוזים גבוהים יותר. זה לא רק יקטין את הזמן שלוקח לפיברינוגן להתמוסס, אלא גם ימנע מהפיברינוגן להתמוסס באופן לא עקבי בטרם עת כפי שניתן לראות באיור 11. הכנת ג'ל פיברינוגן לוקח כמות ניכרת של זמן וזה עשוי להשפיע על ההצלחה הניסיונית הכוללת. התוצאות מצביעות על כך שברגע שג'ל הפיברינוגן מתחיל לג'ל באופן לא עקבי עדיף להשליך אותו. מוסיף צריך להיות מצופה קולגן, שטף עם PBS ומיובש בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר לפני זריעת התאים מוטבע הידרוג'לים. כישלון להבטיח כי מוסיף יבש יגרום הידרוג'ל נשפך על הקצוות של הכנס, וכתוצאה מכך ג'ל אחיד. חוסר אחידות של הג'ל ישפיע בסופו של דבר על תוצאות שבהן דיפוזיה היא גורם.

איור 11: הכנת ג'ל פיברינוגן לניסוחי הידרוג'ל פיברינוגן/קולגן. (A)פתרון ג'ל פיברינוגן שיצר גושים והתחיל ג'ל בטרם עת עם פיברינוגן לא פתור דבק בצינור. (B)פתרון ג'ל פיברינוגן שהתמוסס לחלוטין, הפתרון ברור וקצת יותר צמיג. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מומלץ לעבוד מהר ככל האפשר תוך זריעת ההשעיה תא הידרוג'ל על מוסיף, כמו רכיב פיברינוגן יתחיל crosslink עם תוספת של תרומבין.  הכינו נפחי עבודה קטנים יותר בזמן העבודה עם מתלים ג'ל בריכוזים גבוהים יותר כדי למנוע את הג'ל מ crosslinking בעת זריעה. זה האחרון תהיה השפעה על ההפצה ואת כמות הג'ל זרע על כל באר. סדר הוספת הרכיבים הוא קריטי, בפרוטוקול זה סיפקנו זרימת עבודה יעילה כדי למנוע ג'לים מלהצליב בטרם עת.  בשל צמיגות של המתלה ג'ל הידרוג'ל עובד עם קצה פיפטה לחתוך מומלץ במהלך ערבוב ומדידה.  בעת ערבוב ההשעיה להבטיח כי זה נעשה במהירות ובאופן שווה כדי ליצור השעיה הומוגנית. ערבוב לא אחיד יגרום לג'ל הטרוגני שישפיע לרעה על התוצאות, ראו איור 12.

איור 12: ג'ל קולגן/פיברינוגן נזרע על 12 צלחות באר. כל הג'לים זרעים בנפח של 200 μL המכיל קולגן 2mg/mL ו 20 מ"ג / מ"ל פיברינוגן עם 2.0 x 10⁶ תאים / מ"ל. (A)ג'ל הידרוג'ל עם עקביות הטרוגנית, חלוקה לא אחידה גלויה של ההידרוגלים. (B)הידרוג'לים מעורבים הומוגנית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעקבות אופטימיזציה של הפרוטוקול, המודל הוערך כדי לקבוע את המודלים תכונות ביו-פיזיקליות. נתוני ריולוגיה הראו כי המודל שלנו, המורכב מרכיבי מטריצה חוץ-תאית רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כלומר סוג קולגן I ופיברינוגן, הצליח לחקות את התכונות הביו-פיזיקליות של כבד פיברוטי, cirrhotic ו- HCC^{28,29,30,31,32}. סיכום נוקשות הכבד בדגמי תלת-ממד עבור HCC הוא בעל חשיבות רבה ולעתים קרובות מתעלמים ממנו במהלך פיתוח הדגם. נוקשות מוגברת בכבד קשורה להתנגדות כימותרפית, התפשטות, הגירה, ומעונות בתוך HCC³⁸. בעוד ההפעלה של תאים כוכביים בכבד ב- HCC קשורה לנוקשות מטריצה חוץ-תאית מוגברת, עם מספר מסלולי איתות הקשורים לתאי כוכבי הכבד האלה המראים כניכנות³⁹.

הכללתם של תאים הקשורים סטרומה כגון תאים כוכביים בכבד ותא אנדותל בפיתוח מודלים 3D עבור HCC הפך רלוונטי יותר ויותר. מחקרים מראים כי ספירואידים רב תאיים המורכבים מכוכבי הכבד ותאי HCC גרמו להתנגדות כימותרפית מוגברת ולהגירה פולשנית, תוך חיקוי מראה הגידול של HCC ב vivo, בהשוואה לדגם עכברי PXT ודגימות רקמת HCC אנושיות¹⁷. מחקר דומה של יונג ואח ', 2017 מצא ספרואיד רב תאי המורכב קרצינומה hepatocellular (הא-7) ותאי אנדותל (HUVEC) קידם כלי דם ותוקפנות²². ספירואידים אלה הראו כדאיות בריכוזים גבוהים משמעותית של דוסורוביצ'ין וסורפניב בהשוואה לספרואידים מונוקולטורה הא-7²². ההערכה של הכדאיות של המודל שלנו ואת התגובה דוקסורוביצ'ין, עם ערכי נוקשות המתאימים לזה של HCC והכללת תאים הקשורים סטרומה (LX2 ו HUVEC), הראה ירידה דומה בתגובה כימותרפיה בהשוואה למודל תרבות משותפת 2D.  לכן, ביעילות חיקוי עמידות לתרופות בדרך כלל לראות בחולים ודגמים אחרים 3D HCC.

מכיוון שמדובר במערכת מודולרית המודל יכול להיות מבוצר על ידי תוספת של רכיבי מטריצה חוץ תאיים אחרים כלומר, למין וחומצה היאלורונית. לחלופין, הידרוג'לים הנוכחי בשימוש בתוך מודל זה יכול להיות תחליף על ידי הידרוג'לים סינתטיים כגון נתרן אלגינט או chitosan. שינויים נוספים במודל הנוכחי יכולים להיות החלפת קווי התאים בתרביות תאים ראשוניות כדי לייצר מודל רלוונטי עוד יותר מבחינה פיזיולוגית או באמצעות שילובים של גידולים אחרים וקווי תאים סטרומה.

לכן פיתחנו בהצלחה מודל 3D עם תכונות ביו-פיזיקליות מתכווננות לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה ב- HCC.  מצאנו שהמודל שלנו מייצג יותר את מצב in vivo בהשוואה לתרבויות דו-ממדיות מסורתיות בתגובה לדוקסורוביצ'ין. עם זאת, יש עדיין הרבה מה לעשות, אנו מקווים לאפיין באופן נרחב מודל זה ולחקור את המודל כפלטפורמה גרורתית אפשרית כדי לענות על שאלות מורכבות ודחופות יותר שנותרו במחקר HCC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AlamarBlue (Resazurin sodium salt)	Sigma	211-500	Prepare according to manufacturesr recommendations
Antibiotic Antimycotic Solution (100×), Stabilized	Sigma	A5955-100ML
Aprotinin Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78432
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C1016-2.5KG	Anhydrous, granular, ≤7.0 mm, ≥93.0%
CO2 Incubator	Kebo Biomed Sweden
Corning Black, clear flat bottom 96-well plate	Sigma	CLS3904-100EA
Corning HTS Transwell-24 well permeable supports	Sigma	CLS3396-2EA	HTS Transwell-24 units w/ 0.4 μm pore polycarbonate membrane and 6.5 mm inserts, TC-treated, sterile, 2/cs
Discovery Hybrid Rheometer 2	TA instruments, Sollentuna, Sweden
DMEM, high glucose, GlutaMAX supplement (LX2 and HepG2 cells)	Thermo Fisher Scientific	61965059	Supplemented with 10% v/v FBS and 1% v/v antibiotic antimycotic solution
Endothelial Cell Growth Medium (500 ml) (HUVEC)	Cell Applications, Inc	211-500
Fetal Bovine Serum, qualified, One Shot format, New Zealand	Thermo Fisher Scientific	A3160902
Fibrinogen type I-S from bovine plasma	Sigma	F8630-10G
FLUOstar Omega plate reader	BMG Labtech
Hanks' balanced salt solution	Sigma	H9394-500ML	Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride and magnesium sulfate
Labogene scanspeed 416 centrifuge	Labogene, Sweden
Laminar flow hood	Kebo Biomed Sweden
Mettler Toledo AG245 Analytical Balance	Mettler Toledo
Nikon TMS Light microscope	Nikon, Japan
Phosphate buffered saline tablet	Sigma	P4417-100TAB	Prepare according to manufacturers recommendation
Rat tail Collagen Type I 5 mg/mL	Ibidi	50201
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-1KG
Sodium Hydroxide (NaOH)	Merck	B619298
TC20 Automated cell counter	BioRad
TC20 cell counter counting slides	BioRad
Thrombin from bovine plasma	Sigma	T9549	Powder, suitable for cell culture, ≥1,500 NIH units/mg protein (E1%/280 = 19.5)
Trypsin (2.5%) 10x	Thermo Fisher Scientific		Dilute to 1x in PBS
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T6414-100ML	Solution, sterile-filtered