JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הטכנית לבידוד תת-אוכלוסיות תאי סטרומה אדיפוגניים ופיברו-דלקתיים ממחסני רקמת שומן לבן תוך בטני (WAT) על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או הפרדת חרוזים אימונומגנטית.

Abstract

החלק הסטרומלי-וסקולרי (SVF) של רקמת השומן הלבנה (WAT) הוא הטרוגני להפליא ומורכב מסוגי תאים רבים התורמים פונקציונלית להתרחבות ועיצוב מחדש של WAT בבגרות. מחסום עצום לחקר ההשלכות של הטרוגניות תאית זו הוא חוסר היכולת לבודד בקלות תת-אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית מ- WAT SVF עבור ניתוחי in vitro ו- in vivo. טכנולוגיית ריצוף חד-תאי זיהתה לאחרונה תת-אוכלוסיות של תאים פיברו-דלקתיים ואדיפוגניים PDGFRβ+ פריו-וסקולריים מובחנים מבחינה תפקודית במחסני WAT תוך-בטניים של עכברים בוגרים. אבות פיברו-דלקתיים (המכונים "FIPs") הם תאים מייצרי קולגן לא אדיפוגניים שיכולים להפעיל פנוטיפ פרו-דלקתי. PDGFRβ+ תאים מבשרי אדיפוציט (APCs) הם אדיפוגניים מאוד הן במבחנה והן in vivo לאחר השתלת תאים. במאמר זה אנו מתארים שיטות רבות לבידוד תת-אוכלוסיות אלה של תאי סטרומה ממחסני WAT תוך-בטניים של מורין. ניתן לבודד FIPs ו-APCs על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) או על ידי ניצול טכנולוגיית חרוזים אימונומגנטיים מבוססת נוגדנים ביוטינילציה. תאים מבודדים יכולים לשמש לניתוח מולקולרי ופונקציונלי. חקר התכונות התפקודיות של תת-אוכלוסיית תאי סטרומה בבידוד ירחיב את הידע הנוכחי שלנו על עיצוב מחדש של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים ברמה התאית.

Introduction

רקמת השומן הלבן (WAT) מייצגת את האתר העיקרי לאגירת אנרגיה ביונקים. בתוך רקמה זו, אדיפוציטים, או "תאי שומן", מאחסנים קלוריות עודפות בצורה של טריגליצרידים, ארוזים לתוך טיפות שומנים חד עיניות גדולות. יתר על כן, אדיפוציטים מפרישים מספר רב של גורמים המווסתים היבטים שונים של הומאוסטזיס אנרגיה 1,2,3. אדיפוציטים מהווים את עיקר נפח WAT; עם זאת, אדיפוציטים מייצגים רק פחות מ-50% מכלל התאים הנמצאים ב-WAT 4,5. התא הלא-אדיפוציטי של WAT, או מקטע סטרומה-כלי דם (SVF), הוא הטרוגני למדי ומכיל תאי אנדותל וסקולריים, תאי חיסון שוכנים ברקמות, פיברובלסטים ואוכלוסיות תאים מבשרי אדיפוציט (APC).

WAT יוצאת דופן ביכולתה יוצאת הדופן להתרחב בגודלה ככל שהביקוש לאגירת אנרגיה גדל. שמירה על פלסטיות רקמה זו חיונית מכיוון שאחסון נאות של שומנים ב- WAT מגן מפני שקיעת שומנים חוץ רחמית מזיקה לרקמות שאינן שומן6. האופן שבו מחסני WAT בודדים עוברים הרחבה זו בתגובה לעודף קלורי הוא גורם קריטי לרגישות לאינסולין במצב של השמנת יתר7. הרחבת WAT פתולוגית, שנצפתה אצל אנשים שמנים עם תסמונת מטבולית, מאופיינת בהרחבה מועדפת של מחסני WAT ויסצרליים על חשבון רקמת שומן תת עורית חיובית מטבולית. יתר על כן, עמידות לאינסולין בהשמנת יתר קשורה לשיפוץ פתולוגי של WAT. זה מאופיין בצמיחה היפרטרופית של אדיפוציטים קיימים (גידול בגודל), אנגיוגנזה לא מספקת, דלקת מטבולית כרונית, הצטברות של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים (פיברוזיס), והיפוקסיה רקמות 8,9. פנוטיפים אלה של WAT של השמנת יתר קשורים בסטאטוזיס בכבד ותנגודת לאינסולין, בדומה למה שנצפה במצב של lipodystrophy (היעדר WAT תפקודי). לעומת זאת, התרחבות WAT בריאה נצפתה באוכלוסיית השמנים הבריאים מבחינה מטבולית ומאופיינת בהרחבה מועדפת של WAT תת עורי מגן והרחבת מחסן באמצעות היפרפלזיה אדיפוציט10. הגיוס של אדיפוציטים חדשים מתווך על ידי התמיינות דה נובו אדיפוציט מתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) (המכונים, "אדיפוגנזה"). היפרפלזיה אדיפוציט עולה בקנה אחד עם דרגות נמוכות יחסית של פיברוזיס WAT ודלקת מטבולית 6,11. מספר רב של סוגי תאים בתוך המיקרו-סביבה של WAT משפיעים ישירות על הבריאות ויכולת ההתרחבות של WAT בהשמנת יתר12. לפיכך, הגדרת הפונקציה של סוגי התאים השונים הקיימים ב- WAT נותרה בעדיפות גבוהה עבור השדה.

במהלך העשור האחרון, מספר אסטרטגיות הופעלו כדי להגדיר ולבודד נגמ"שים מקוריים מאדם ועכבר WAT SVF13. אסטרטגיות כאלה מבודדות APCs בהתבסס על ביטוי פני התא של סמני גזע / תאי אב מזנכימליים נפוצים באמצעות טכניקות הפרדת תאים מבוססות נוגדנים. גישות אלה כוללות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), שימוש בנוגדנים המסומנים בתווית פלואורופור, או הפרדת חרוזים אימונומגנטית (כלומר, נוגדנים מהונדסים כימית). חלבוני פני השטח של התא המיועדים לבידוד APCs כוללים PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ו-SCA-1. גישות אלה סייעו להעשיר את הנגמ"שים; עם זאת, אוכלוסיות תאים המבודדות על סמך סמנים אלה הן הטרוגניות למדי. מחקרי ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) שנערכו לאחרונה הדגישו את ההטרוגניות המולקולרית והתפקודית של תאי סטרומה בתוך החלק הסטרומה-כלי הדם המבודד (SVF) של מורין WAT 14,15,16,17. מה-scRNA-seq והניתוחים הפונקציונליים שלנו, זיהינו ואפיינו תת-אוכלוסיות של תאים פריווסקולרים מווסתים חיסוניים ואדיפוגניים PDGFRβ+ בתא סטרומה של WAT תוך-בטני בעכברים בוגרים15. מבשרי פיברו-דלקתיים, או FIPs, מייצגים תת-אוכלוסייה בולטת של תאי PDGFRβ+ וניתן לבודד אותם על בסיס ביטוי LY6C (תאי LY6C+ PDGFRβ+)15. FIPs חסרי יכולת אדיפוגנית, מפעילים תגובה פרו-דלקתית חזקה לגירויים שונים, מייצרים קולגן ומפרישים גורמים אנטי-אדיפוגניים15. הפעילות הפרו-דלקתית והפיברוגנית של תאים אלה עולה בהקשר להשמנת יתר בעכברים, מה שמסבך תאים אלה כרגולטורים של עיצוב מחדש של VAT. תת-האוכלוסייה LY6C- CD9- PDGFRβ+ מייצגת תאים מבשרי אדיפוציט (APC). נגמ"שים אלה מועשרים בביטוי של Pparg וגנים פרו-אדיפוגניים אחרים, ומתמיינים בקלות לאדיפוציטים בוגרים במבחנה ו-in vivo15. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד אוכלוסיות תאים מובחנות אלה ממחסני WAT תוך בטניים של עכברים בוגרים באמצעות FACS, והפרדת חרוזים אימונומגנטית עם נוגדנים ביוטינילציה. פרוטוקול זה יכול לשמש לבידוד תת-אוכלוסיות אב שומניות מובחנות מבחינה תפקודית ממחסני WAT תוך-בטניים מרובים של עכברים בוגרים זכרים ונקבות15. חקר אוכלוסיות תאים מובחנות מבחינה תפקודית אלה בבידוד עשוי לתרום רבות להבנתנו הנוכחית של המנגנונים המולקולריים המווסתים אדיפוגנזה ועיצוב מחדש של רקמת שומן תוך בטנית בבריאות ובחולי.

הפרוטוקול שלהלן מפרט את בידודם של אבות השומן מ- MURINE epididymal WAT; עם זאת, ניתן להשתמש באותו הליך כדי לבודד תאים מתאימים ממחסני WAT מזנטריים ורטרופריטוניאליים של עכברים זכרים ונקבותכאחד 15. פרוטוקול מפורט כיצד לזהות ולבודד מחסנים אלה בעכברים ניתן למצוא ב- Bagchi et al.18. פרוטוקול זה הותאם לשימוש בעכברים בגילאי 6-8 שבועות. התדירות ויכולת ההתמיינות של נגמ"שים עשויים לרדת בקשר להזדקנות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוטוקולים והנהלים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי הדרום-מערבי של אוניברסיטת טקסס.

1. בידוד של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן לבן גונדל

  1. נתחו את רקמת השומן הלבנה של הגונדל מעכברים בני 6-8 שבועות והניחו רפידות שומן בתמיסת PBS 1x.
  2. ערבבו עד 4 מחסני שומן (מומלץ 2-4 מחסנים מ-1-2 עכברים) וטחנו את הרקמה בכוס של 10 מ"ל המכילה 200 מיקרוליטר של חיץ עיכול (1x HBSS, 1.5% BSA ו-1 מ"ג/מ"ל קולגנאז D).
  3. מעבירים את הרקמה הטחונה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל חיץ עיכול של 10 מ"ל.
  4. יש לדגור על התערובת בטמפרטורה של 37°C באמבט מים למשך שעה אחת תוך כדי ניעור.
  5. סנן את הרקמה המעוכלת דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר כדי להסיר רקמה לא מעוכלת.
  6. יש לדלל דגימה מסוננת ל-30 מ"ל עם PBS המכיל 2% FBS, וצנטריפוגה ב-600 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C. שאפו את הסופרנטנט, המכיל אדיפוציטים בוגרים.
  7. המשך מיד לשיטת בידוד התאים המועדפת.

2. בידוד נגמ"שים ו-FIPs באמצעות FACS

  1. ממיסים את הגלולה ב 1 מ"ל של 1x RBC lysis buffer על ידי ניעור הצינור בעדינות.
  2. יש לדגור ב-RT למשך 1-2 דקות.
  3. הוסף 10 מ"ל של 2% FBS/PBS ועבור דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. יש לשאוף מדיה ולהשעות מחדש את הגלולה ב-400-800 μL של 2% FBS/PBS המכיל בלוק Fc (1:200).
  6. יש לדגור ב-4°C למשך 10 דקות.
  7. להעביר 400 μL-800 μL של תרחיפים תאים המכילים ≤106 תאים לכל מ"ל ל 1.5 מ"ל צינורות ולהוסיף נוגדנים. ריכוזי נוגדנים מפורטים בסעיף טבלת חומרים .
    1. הכן צינורות בקרה נפרדים עבור 1) תאים לא מוכתמים, 2) פקדים בצבע יחיד, ו -3) פקדי FMO (פלואורסצנטיות פחות אחד).
    2. מכתימים את הדגימות בנוגדנים PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.
  8. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות כשהוא מוגן מפני אור.
  9. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  10. שאפו מדיה והשעו תאים ב-400 מיקרוליטר של 2% FBS/PBS.
  11. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  12. לשאוף מדיה ולהשהות תאים ב 400-800 μL של 2% FBS/PBS. לאחר מכן לעבור דרך מכסי מסנן 40 מיקרומטר לתוך 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית צינורות עבור FACS.
  13. בצע את השלבים הבאים עבור gating.
    1. השתמש בפקדים לא מוכתמים ובצבע יחיד לפיצוי.
    2. השתמש בפקדי FMO כדי להגדיר שערים ניסיוניים.
    3. השתמשו באסטרטגיית ה-gating שמוצגת באיור 1 כדי להשיג נגמ"שים ו-FIPs. APCs שער כמו CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- ו- FIPs כמו CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ תאים.
  14. לאסוף תאים ממוינים בצינורות המכילים 500 μL של 100% סרום ולשמור את התאים על קרח.
  15. תאי צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הוסף 2% FBS/PBS כדי לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה שוב ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות התאים הכדוריים.
  16. השהה מחדש את התאים הכדוריים בנפח המתאים של מדיה תרבית APC גונדל (לתרבית תאים) או חיץ מתאים לניתוח לאחר מכן.

3. הפרדה אימונומגנטית של שברים אדיפוגניים ולא אדיפוגניים

  1. בודדו SVF מרקמת השומן הלבנה בגונדל לפי שלבים 1.1-1.7.
  2. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת SVF ב-10 מ"ל של 1x MS Buffer זמין מסחרית.
  3. סנן את תרחיף התא דרך מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר.
  4. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש תאים כדוריים ב 100 μL של 1x MS Buffer.
  6. בצעו דלדול תאים מסוג CD31+ ו-CD45+ כפי שנדון להלן (איור 2A, שלב 1). זה נעשה כדי להסיר תאי שושלת אנדותל hematopoietic.
    1. ספור תאים באמצעות מונה תאים והתאם את הריכוז ≤ 1 x 108 תאים / מ"ל.
    2. הוסף את נוגדני CD31 ו- CD45 מצומדים ביוטין לתרחיף התא, כל אחד בריכוז של ≤ 0.25 מיקרוגרם לכל 106 תאים ודגור על קרח במשך 15 דקות.
    3. לשטוף תאים על ידי הוספת 4 מ"ל של 1x MS Buffer.
    4. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם 100 μL של 1x MS buffer.
    6. הוסיפו 10 מיקרוליטר ננו-חרוזים של סטרפטאווידין ודגרו על תאים על קרח למשך 15 דקות.
    7. לשטוף תאים על ידי הוספת 4 מ"ל של 1x MS buffer.
    8. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ואז לשאוף את supernatant.
    9. תאים להשהות ב 2.5 מ"ל של 1x MS מאגר ולהעביר 5 מ"ל צינור פוליפרופילן.
    10. הניחו את הצינור במדף המגנטים למשך 5 דקות.
    11. אסוף תאים ללא תווית על ידי שפיכת תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה נקי של 15 מ"ל.
      הערה: הימנע מטלטול או ניקוי טיפות תלויות מכיוון שהדבר מוביל לזיהום ממקטע תא לא רצוי.
    12. הסר את הצינור מהמגנט וחזור על שלבים 3.6.9. ל-3.6.11. פעמיים נוספות סה"כ 3 כביסות.
  7. הפרדה בין שברים אדיפוגניים ולא אדיפוגניים (איור 2A, שלב 2)
    1. המשך לעבוד עם שבר ללא תווית (כלומר, CD45- CD31- שבר).
    2. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל המכיל תאים לא מסומנים ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של חיץ MS 1x.
    4. הוסף נוגדנים מצומדים של ביוטין LY6C ו- CD9, בהתאמה, בריכוז של ≤ 0.25 מיקרוגרם לכל 106 תאים ודגור על קרח במשך 15 דקות.
    5. בצע את שלבים 3.6.3. ל-3.6.12. כדי להשלים את ההפרדה השנייה.
    6. איסוף שברים לא מאוגדים. תאים ללא תווית (LY6C- CD9-) מייצגים מקטע אדיפוגני המכיל APCs (איור 2A, שלב 3).
    7. הסר את הצינור מהמגנט, השהה מחדש ושחרר תאים קשורים במאגר MS 1x. שבר מסומן או מסומן (LY6C+ CD9+), מייצג מקטע לא אדיפוגני המכיל FIPs (איור 2A, שלב 3).
    8. שברים מסומנים ולא מסומנים בצנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות לתאי גלולה ב 4 ° C.
  8. המשך מיד לתרבית תאים (שלב 6) או השתמש במבשרים לא ממוינים לניתוחים מועדפים (שלב 4 ו/או שלב 5).

4. הערכת טוהר של שברים אדיפוגניים ולא אדיפוגניים על ידי ציטומטריית זרימה

  1. השהה מחדש שברי תאים מבודדים בחרוזים ב- 200-400 μL של 2% FBS/PBS המכילים בלוק Fc (1:200).
  2. יש לדגור ב-4°C למשך 10 דקות.
  3. להעביר את השעיית התא לצינורות 1.5 מ"ל ולהוסיף נוגדנים. ריכוזי נוגדנים מפורטים בטבלת החומרים.
    1. הכן צינורות בקרה נפרדים עבור 1) תאים לא מוכתמים, 2) פקדים בצבע יחיד, ו -3) פקדי FMO.
    2. לדגימות, הוסף נוגדנים CD45, CD31, CD9 ו- LY6C.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות כשהוא מוגן מפני אור.
  5. צנטריפוגה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  6. שאפו תאי סופרנאטנט והשהו מחדש ב-400 מיקרוליטר של 2% FBS/PBS.
  7. צנטריפוגה את המתלה ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  8. שאפו את תאי הסופרנאטנט והשהה מחדש ב-400-800 מיקרוליטר של 2% FBS/PBS. סנן דרך מכסי מסנן 40 מיקרומטר לתוך צינורות פוליסטירן עגולים בנפח 5 מ"ל לניתוח לפי ציטומטריית זרימה.
  9. ניתוח ציטומטריית זרימה להערכת טוהר
    1. השתמש בפקדים לא מוכתמים ובצבע יחיד לפיצוי.
    2. השתמש בפקדי FMO כדי להגדיר שערים ניסיוניים.
    3. השתמשו באסטרטגיית ה-gating עבור תאים חיים ותאים בודדים כפי שמוצג באיור 2B.
    4. בצעו את ה-gating כפי שמוצג באיור 2B עבור CD45, CD31, LY6C ו-CD9.
    5. השתמש בתוכנת ציטומטריית זרימה כדי להעריך את התדרים של CD45- CD31- LY6C- CD9- תאים (APC) ו- CD45- CD31- LY6C+ תאים (FIPs) בתוך שברים מבודדים.

5. ניתוח ביטוי גנים באמצעות PCR כמותי להערכת טוהר FIPs ו- APCs

  1. חלץ mRNA מתאים מבודדים מגנטית או FACS באמצעות ערכת מיצוי זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן.
  2. השתמש במיקרוגרם אחד של RNA כדי לסנתז cDNA באמצעות ערכת cDNA Reverse Transcriptase (ראה טבלת חומרים) על-ידי ביצוע הוראות היצרן.
  3. קביעת רמות mRNA יחסיות של גנים סלקטיביים APC ו-FIPs (טבלה 1) באמצעות PCR כמותי באמצעות תערובת מאסטר PCR ירוקה של SYBR.
    1. הגדר את תגובת הדגימה עבור PCR באופן הבא: 5 μL של 2x צבע ירוק SYBR, 1 μL של cDNA (~ 50 ng / μL), 0.5 μL של כל פריימר קדימה ואחורה (10 μM) ו 3 μL של מים.
    2. השתמש בתנאי ה-PCR הסטנדרטיים הבאים עבור ריצת PCR כמותית: שלב החזקה: 50°C למשך 2 דקות, 95°C למשך 10 דקות; שלב PCR (40 מחזורים): 95 ° C עבור 15 שניות, 60 ° C למשך דקה אחת.
  4. נרמל ערכים לרמות גן תחזוקת הבית (Rps18) על ידי חישוב ΔΔ-Ct.
  5. כדי להעריך מובהקות סטטיסטית, בצע מבחן t של סטודנט לא מזווג.

6. תרבית תאים והתמיינות

  1. צנטריפוגה מגנטית או FACS - תאים מבודדים ב 600 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  2. השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של מדיה תרבית APC גונדל צלחת 40K תאים / באר מכל שבר בצלחת תרבית 48 באר.
  3. החלף מדיה כל 1-2 ימים. נגמ"שים יתחילו לעבור התמיינות לאדיפוציטים ככל שהם מתקרבים למפגש. FIPs המתוחזקים באותה מדיה עמידים לעבור אדיפוגנזה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שתי אסטרטגיות המאפשרות בידוד של אוכלוסיות תאי סטרומה מובחנות ממחסני WAT תוך-בטניים של עכברים בוגרים. APCs ו-FIPs יכולים להיות מבודדים על-ידי FACS (איור 1) או הפרדת חרוזים אימונומגנטית באמצעות נוגדנים ביוטינילטים (איור 2). שתי הגישות משתמשות בריאגנט?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זן C57BL/6 של עכברים הוא זן העכבר הנפוץ ביותר במחקרים על השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה. עכברי C57BL/6 עולים במהירות במשקל כאשר הם עוברים לדיאטה עתירת שומן (HFD) ומפתחים כמה מהמאפיינים הבולטים של תסמונת מטבולית הקשורים להשמנת יתר (למשל, עמידות לאינסולין והיפרליפידמיה). יש לציין כי התרחבות WAT המתרחשת ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

T.A.P. היא עובדת ובעלת מניות בחברת Novo Nordisk A/S

Acknowledgements

המחברים אסירי תודה לליסה הנסן וקירסטן וסטרגארד על הסיוע הטכני המצוין, ולפ' שרר, נ' ג'ופין וק' קרו על קריאה ביקורתית של כתב היד. המחברים מודים ל-UTSW Flow Cytometry Core על הדרכה מעולה וסיוע בפיתוח הפרוטוקולים המתוארים כאן. R.K.G. נתמך על ידי NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ו- NIDDK R01 DK119163. J.P. ממומן על ידי פרס טרום דוקטורט מקרן החדשנות דנמרק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainersFisher Scientific352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS)Fisher Scientific21040CV
5ml polypropylene tubesFisher Scientific352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSSSigmaH8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)Roche11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.)Fisher ScientificBP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer)BioLegend480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)BioLegend480019
100 µL MojoSort Streptavidin NanobeadsBioLegend480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis BuffereBioscience00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32)eBioscience553141
Antibodies
Biotin CD45BioLegend103103Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31BioLegend102503Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9BioLegend124803Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6CBioLegend128003Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5BioLegend102419Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5BioLegend103131Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PEBioLegend136006Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APCBioLegend128016Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITCBioLegend124808Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucoseCorning10-014-CV
192 mL MCDB201SigmaM6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024Sigma12303C
5 mL 100% ITS premixBD Bioscience354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphateSigmaA8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basicR&D systems3139-FB-025/CF
5 mL Pen/StrepCorning30-001-CI
500 µL GentamycinGibco15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

References

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636(2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501(2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861(2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890(2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162SVFPDGFRFIPsAPCsFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved