דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

Summary

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

Abstract

הפרעות נוירולוגיות אנושיות רבות נגרמות על ידי ניוון של נוירונים ותאי גליה במוח. בשל מגבלות באסטרטגיות פרמקולוגיות וטיפוליות אחרות, אין כיום תרופה זמינה למוח הפגוע או החולה. החלפת תאים מופיעה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לתנאים ניווניות. עד היום, תאי גזע עצביים (NSCs) נוצרו בהצלחה מרקמות עובריות, תאים עובריים אנושיים (ES) או תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC). תהליך של דיפרנציה יזם על ידי הפעלה של גליקופרוטאין אנושי חדשני הקשור ל- GPI, המוביל ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים. תאי גזע פלוריפוטנטים אלה שמקורם בדם (BD-PSCs) מבדילים במבחנה לתאים עם פנוטיפ עצבי כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה brightfield ו- immunofluorescence. ניתוח אולטרה-מבני של תאים אלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשר את המבנה הפרימיטיבי שלהם, כמו גם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומאפיינים תת-תאיים.

Introduction

פיתוח שיטות מחקר בסיסיות ופרה-קליניות של תאי גזע מעודד יישום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע למחלות נוירולוגיות. טיפול פוטנציאלי כזה תלוי באופן קריטי בשיטה ליצירת תאים עצביים אנושיים המובילים להתאוששות תפקודית¹.

תאי גזע עצביים (NSCs) מחדשים ומבדילים לנוירונים חדשים לאורך החיים בתהליך הנקרא נוירוגנזה בוגרת. רק אזורי מוח מוגבלים מאוד מכילים NSCs המוכשרים ליצור נוירונים שזה עתה נולדו בבגרות. NSCs כאלה יכולים להוליד נוירונים בוגרים, המעורבים בלמידה ובזיכרון, ובכך להחליף נוירונים אבודים או פגומים. למרבה הצער, NSCs אלה נמצאים בכמויות מוגבלות זה neurogenesis מוגבל פוחתת במהירות במהלך התפתחות לנוער². לכן, מקורות אחרים של תאים עצביים חייבים להיחשב במטרה טיפול בתא.

מחלות נוירולוגיות ניווניות קשה לרפא באמצעות גישות פרמקולוגיות סטנדרטיות. אסטרטגיות טיפוליות חדשות לאימוץ הפרעות נוירולוגיות רבות שאינן ניתנות לחיסון מבוססות על טיפולים בתחליפי תאים של רקמה חולה ופצועה. השתלת המל"ל יכולה להחליף תאים פגומים ולספק השפעות מועילות. מקורות אחרים להחלפת תאים עצביים כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (ESC), הנגזרים ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסטות של היונקים³, כמו גם IPSCs⁴, אשר יש יכולת התחדשות עצמית נרחבת כמו ESCs ומסוגלים להבדיל לתוך שושלות תאים שונות. NSCs יכול גם להיווצר על ידי תכנות מחדש ישיר מפיברובלסטים אנושיים הימנעות מצב pluripotent⁵.

טיפול בתחליפי תאים הוא עדיין נושא מאתגר. למרות ש- ESC, עוברי או IPS יכולים להיות מקור ליצירת תאים עצביים לטיפול במחלות נוירולוגיות רבות חשוכות מרפא, החלפת תאי SCs למבוגרים אוטולוגיים של רקמות פגומות היא חלופה טובה יותר שעוקפת חששות אימונולוגיים, אתיים ובטיחותיים.

הפעלה של חלבון הקשור ל- GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים באמצעות זרחן של PLCγ / PI3K / Akt / mTor / PTEN יוזמת דיפרנציאציה של תאי צאצא דם ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בדם (BD-PSCs)⁶. תאים אלה מבדילים במבחנה כלפי תאים עצביים כפי שאושרו באמצעות ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים בהירה, אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM).

בעבודה זו אנו מתארים את הדור ללא GM של מחשבי BD-PSCs ואת ההבחנה מחדש המוצלחת שלהם לתאים עם פנוטיפ עצבי.

Protocol

אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.

1. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMNCs)

1. ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נסיגת דם בהתאם להנחיות המוסדיות.
2. קח 30 מ"ל של דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
3. בודד מחשבי PBMNCs לפי מדיית מעבר צבע בצפיפות. השתמש 10 מ"ל של מדיה עם 25 מ"ל של דם 1:1 מדולל עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 דקות.
4. בודדו את השכבה הבין-ביזה בין הפלזמה למדיה ההדרגתית בצפיפות על-ידי צנרת. לשטוף את התאים המבודדים עם 5 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. חזור פעמיים.
5. ספירת מספר התאים בשיטות סטנדרטיות באמצעות תא ספירה.

2. הפעלה של גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים על פני השטח של PBMNCs

1. מקם את 6 x 10⁶ תאים מונונוקלאריים (MNCs) בצינורות 15 מ"ל ולבצע שיתוף בין נוגדנים על ידי הדגירה של התאים עם נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה הקשור ל- GPI אנושי (30 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות ב- PBS עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב 37 °C (37 °F).
2. החלף מדיום דגירה במדיום Dulbecco המותאם של Iscove בתוספת סרום בקר עוברי 10%.
3. לגדל תאים ב 15 mL צינורות פוליסטירן, לשים את הצינורות באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO₂ במשך 8-10 ימים (ללא רועד). על D5, להוסיף 1-2 מ"ל נוספים של מדיום של Iscove בתוספת עם 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.

3. מיון של תאים שהופקו לאחרונה

1. ספירת תאים עם מונה תאים אוטומטי (השעיית תא 18 μL + 2 μL פלואורסצנטיות צבע) או בתא ספירה.
2. מתלה תא בתרבית צנטריפוגה (5-7 x 10⁶) ב 300 x g במשך 10 דקות ושאף את supernatant וכתוצאה מכך עם פיפטת פסטר סטרילי.
3. להשעות מחדש את גלולה התא ב 90 μL של PBS מקורר מראש pH 7.2, 0.5% BSA ו 2 mM EDTA.
4. הוסף CD45 חרוזים מגנטיים בגודל ננו חיובי (80 μL) השעיית התא ודגרה על קרח במשך 15 דקות.
5. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חוצץ PBS צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות.
6. להשעות מחדש את התאים ב- 500 μL של מאגר PBS.
7. לשטוף את העמודה עם 500 μL של חוצץ PBS מקורר מראש ומניחים אותו בשדה המגנטי.
8. מקם את מתלה התא על העמודה ולשטוף אותו עם 500 μL של מאגר PBS (פעמיים) ואת זרימת הצנטריפוגה המכילה CD45 תאים שליליים. לאסוף אותם במדיום של Iscove בתוספת עם 1% BSA.
9. תספור את התאים בתא הספירה.

4. הכנת מנות תרבית תאים לבידול עצבי של תאי גזע חדשים שנוצרו

1. מצופים את כלי התרבות עם פולי-L-אורניתין ולמינין לגידול תאים עצביים.
2. מניחים את כיסויי הזכוכית בצלחות 4-well ומצופה אותו עם 1:5 פולי-L-אורניתין מדולל (0.1 מ"ג / מ"ל ב ddH₂O) ב ddH₂O. מניחים את כיסויים לתוך אינקובטור 37 °C במשך 1 שעה. ואז לשטוף עם ddH₂O.
3. מפשירים לאט למינין (0.5-2.0 מ"ג/מ"ל) ומוסיפים לראש כיסויים. לדגור אותו ב 37 °C (55 °F) במשך 2 שעות.
4. הכן אינדוקציה עצבית בינוני N2 המורכב 49 מ"ל של D-MEM / F12, 500 μL של תוספת N2, 400 μL של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), פתרון FGF בסיסי בריכוז סופי 20 ננוגרם / מ"ל (מוכן מ 100 תמיסת מלאי מיקרוגרם / מ"ל), והפרין בריכוז סופי 2 ng / mL.
5. הסר למינין עודף על ידי pipetting ולהוסיף N2 בינוני עצבי מנות תרבות.

5. פולחן של תאי דם נוירונים מפוזרים

1. תרבית BD נגזר CD45 תאים שליליים על למינין / אורניתין מצופה מכסה במשך יומיים באינקובטור ב 37 °C (5% CO₂ במדיום N2 ליזום בידול עצבי של תאים חדשים שנוצרו על ידי BD.
2. תאי תרבות עוד יותר במדיום בידול עצבי המורכב 48 מ"ל של בינוני Neurobasal, 500 μL של L-גלוטמין, 1 מ"ל של תוספת B27, 500 μL של NEAA, 50 μL של גורם נוירוטרופי גליה אנושי רקומביננטי (GDNF) ב 5 מיקרוגרם / 250 μL ב PBS / 0.1% BSA, ו 50 μL של המוח האנושי רקומביננטי נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF) ב 5 מיקרוגרם / 200 μL ב PBS / 0.1% BSA ו 50 μL של פתרון חומצה אסקורבית 2.9 גרם / 50 מ"ל ב- PBS. מניחים צלחות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO_2.

6. ניתוח מיקרוסקופיה חיסונית של תאים עצביים שמקורם בדם

1. תרבית את התאים כמתואר לעיל במשך 16 ימים ולהסיר את המדיה.
   1. דגירה עם קיבוע מחמם מראש המורכב 75 מ"ל של מים סטריליים, 4 גרם של paraformaldehyde. מוסיפים 10 N NaOH לפי הצורך ומערבבים עד שהפתרון מתפנה. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS, 0.5 מ"ל של MgCl_2, 2 מ"ל של 0.5 M EGTA, ו 4 גרם של סוכרוז. טיrate ל- pH 7.4 עם 6 N HCl, ולהביא ל 100 מ"ל של מים סטריליים במשך 15 דקות, על פי Marchenko ואח^'7.
   2. להשליך את הקיבעון ולשטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם. הוסיפו מיד תמיסה טריה של טריטון X 0.3% וחלחלו לתאים למשך 5 דקות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף פתרון חסימה שנעשה על ידי PBS ו- 5% BSA.
   3. לחסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת רוקר במשך שעה אחת.
   4. הכן דילול מתאים של נוגדנים ב 1% BSA / PBS ודגר את התאים עם דילול נוגדנים על צלחת רוקר במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, לדגור על התאים עם DAPI ולהעלות את כיסויים עם מדיה הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ.
      הערה: נוגדנים המסומנים ישירות המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים.

7. ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור של תאים שנוצרו לאחרונה

1. זרע את התאים עבור TEM בשקופיות תא 8-well.
2. תקן את התאים ב 3.5% גלוטרדהיד עבור 1 שעות ב 37 °C (55 °F), לאחר תיקון ב 2% OsO₄ במשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר וכתם 2% אצטט אורניל בחושך ב 4 °C (50 °F) במשך 2 שעות 30 דקות.
3. לבסוף, לשטוף את התאים במים מזוקקים, לייבש אותו באתנול ולהטביע שרף אפוקסי לילה. למחרת להעביר את הדגימות לתנור 70 מעלות צלזיוס עבור 72 שעות עבור התקשות שרף.
4. נתק את תרביות התא המוטבעות מהשקופית התאית והדבק לבלוקי ארלדיט.
5. חותכים מקטעים טוריים דקים למחצה (1.5 מיקרומטר) עם מכונה, נטענים על מגלשות זכוכית ומכתימים קלות עם כחול טולואידין 1%.
6. הדבק מקטעים דקים למחצה בחרו לבלוקי ארלדיט וניתקו אותם ממגלשת הזכוכית על ידי הקפאה חוזרת (בחנקן נוזלי) והפשרה.
7. הכן מקטעים דקים במיוחד (0.06-0.08 מיקרומטר) עם מכונה וניגודיות נוספת עם ציטוט עופרת.
8. השג מיקרוגרפים באמצעות מיקרוסקופ סריקת אלקטרונים עם מצלמה דיגיטלית.

תוצאות

התוצאות מספקות ראיות לכך ששיטה חדשנית זו ללא GM מסוגלת להחזיר תאי אבות דם למצבם הפרימיטיבי ביותר מבלי לפעול ישירות על הגנום האנושי.

הוכחנו בעבר כי קישור נוגדנים ספציפי לחלבון הקשור ל- GPI יוזם באמצעות PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation של גנים רלוונטיים התפתחותית שמורים מאוד כגון WNT, NOT...

Discussion

שיטת התמנות מחדש של תאים אנושיים המתוארים בעבודה זו מבוססת על הפעלה ממברנה לגרעין של מכונות איתותים מאחורי גליקופרוטאין הממברנה האנושית הקשורה ל- GPI היוזמת את תהליך הדיפרנציאציה המובילה ליצירת ex vivo והרחבת מחשבים מתחדשים עצמית המתקבלים מדם היקפי אנושי שאינו מניפולציה. תאים אלה כאשר ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin Fraction V	Roth	T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate	Merck Millipore	MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555	Merck Millipore	MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488	Merck Millipore	MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488	BD Pharmingen	560381
AO/PI Cell Viability kit	Biozym	872045	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes	Sigma Aldrich	A8960-5G
B27 Serum free 50x	Fisher Scientific (Gibco)	11530536
Basic FGF solution	Fisher Scientific (Gibco)	10647225
Biocoll	Merck Millipore	L6115-BC	density gradient media
BSA Frac V 7.5%	Gibco	15260037
CD45 MicroBeads	Miltenyi	130-045-801	nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna	Biozym	872010	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek	Fisher Scientific	10234121
D-MEM/F12	Merck Millipore	FG4815-BC
Durcupan	Sigma Aldrich	44610	epoxy resin
FBS	Merck Millipore	S0115/1030B	Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human	Fisher Scientific (Gibco)	10679963
GlutaMax 100x	Gibco	35050038	L-glutamine
Glutaraldehyde grade	Sigma-Aldrich	G5882-50ML
Heparin sodium cell	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Human BDNF	Fisher Scientific (Gibco)	11588836
Iscove (IMDM)	Biochrom	FG0465
Laminin mouse	Fisher Scientific (Gibco)	10267092
Lead citrate	Sigma-Aldrich	15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter	Biozym	872040	Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer	Miltenyi	130-091-221
MEM NEAA 100x	Gibco	11140035
MiniMACS Trennsäulen	Miltenyi	130-042-201
Morada digital camera	Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells	Fisher Scientific	10507591
N2 Supplement 100x	Fisher Scientific (Gibco)	11520536
Neurobasal Medium	Gibco	10888022
PBS sterile	Roth	9143.2
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite	Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit	FEI Europe
Ultracut UC-6	Leica
Uranyl acetate C	EMS	22400