אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Summary

אנו מציגים כאן שיטה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג כדי ליצור ביעילות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים, ללא צורך בטרנספקציה גנטית או בווקטורים רטרו-ויראליים. אסטרטגיה זו מבטיחה, אם כן, לרפואה תרגומית ומייצגת התקדמות ניכרת בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי הגזע.

Abstract

ניתן להפוך או לשנות את הפנוטיפ של התא בשיטות שונות, עם יתרונות ומגבלות ספציפיים לכל טכניקה. כאן אנו מתארים אסטרטגיה חדשה המשלבת את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. נדרשים שני שלבים עיקריים. בשלב הראשון, תאים בוגרים בוגרים (ממוינים באופן סופני) נחשפים למחק האפיגנטי 5-אזה-ציטידין כדי להניע אותם למצב פלוריפוטנטי. חלק זה של הפרוטוקול פותח, בהתבסס על ההבנה הגוברת של המנגנונים האפיגנטיים השולטים בגורל התאים ובהתמיינותם, וכרוך בשימוש במשנה האפיגנטי כדי למחוק את מצב התאים המובחנים ולאחר מכן לנסוע לתוך חלון פלסטיות גבוה חולף.

בשלב השני, תאים שנמחקו עטופים במיקרו-ביוריאקטורים של פוליאטטרפלואורואתילן (PTFE), הידועים גם בשם Liquid Marbles, כדי לקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים כדי להרחיב ולשמור ביציבות על הפלסטיות הגבוהה הנרכשת. PTFE היא תרכובת סינתטית הידרופובית לא תגובתית והשימוש בה מאפשר יצירת מיקרו-סביבה תאית, שלא ניתן להשיגה במערכות תרביות דו-ממדיות מסורתיות. מערכת זו מעודדת ומגבירה את התחזוקה של פלוריפוטנטיות באמצעות רמזים הקשורים לביו-מכנוסנסינג.

ההליכים הטכניים המתוארים כאן הם אסטרטגיות פשוטות כדי לאפשר אינדוקציה ותחזוקה של מצב פלסטיות גבוהה בתאים סומטיים בוגרים. הפרוטוקול איפשר את הפקתם של תאי פלסטיות גבוהה בכל מיני היונקים שנבדקו. מכיוון שהיא אינה כרוכה בשימוש בטרנספקציה של גנים והיא נקייה מווקטורים ויראליים, היא עשויה לייצג התקדמות טכנולוגית בולטת עבור יישומי רפואה תרגומית. יתר על כן, מערכת המיקרו-ביו-ריאקטורים מספקת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית האורגנואידים של תאי גזע על ידי יצירה מחדש במבחנה של מיקרו-סביבה ספציפית המאפשרת תרבית ארוכת טווח של תאים בעלי פלסטיות גבוהה, כלומר ESCs, iPSCs, תאים שנמחקו אפיגנטית ו-MSCs.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, הרעיון המקובל של התקדמות חד-כיוונית לעבר מחויבות והתמיינות של תאים שונה לחלוטין. הוכח כי ניתן להפוך את אפיון התא, וניתן לדחוף תא ממוין סופני לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר, בשיטות שונות.

בין מספר השיטות המוצעות, אחת השיטות המבטיחות ביותר כוללת שימוש בתרכובות כימיות כדי לגרום לתאים למה שמכונה פלוריפוטנטיות המושרה כימית. המולקולות הקטנות המשמשות בגישה זו מסוגלות לקיים אינטראקציה ולשנות את החתימה האפיגנטית של תא בוגר בוגר, תוך הימנעות מהצורך בכל וקטור מהונדס ו/או ויראלי 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . מחקרים רבים הראו לאחרונה כי ניתן להעביר תאים מפנוטיפ אחד למשנהו על ידי מתן גירויים ביוכימיים וביולוגיים ספציפיים המעוררים הפעלה מחדש של גנים היפר-מתילים 11,12,13,14,15. אירועים אלה של דה-מתילציה מאפשרים המרה של תאים ממוינים סופניים לאב פרימיטיבי, רב-פוטנטי או לתא בעל פלסטיות גבוהה/פלוריפוטנטית 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

במקביל, מחקרים רבים התמקדו לאחרונה בהבנת רמזים הקשורים למכנוזנסינג, ובאופן ספציפי יותר, באפשרות להשתמש בכוחות מכניים כדי להשפיע ישירות על פלסטיות ו/או התמיינות של תאים ^16,17,18,19. ואכן, הוכח בבירור כי המטריצה החוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד מפתח בשליטה על גורל התא. בפרט, האותות הביומכניים והביו-פיזיקליים המיוצרים על ידי ECM מווסתים ישירות את המנגנונים המולקולריים ואת מסלולי האיתות, ומשפיעים על התנהגות התאים ועל תפקודיהם^20,21. נתונים עדכניים אלה סללו את הדרך לפיתוח מערכות תרביות תלת-ממדיות חדשניות המחקות באופן הדוק יותר את המיקרו-סביבה של תאי in vivo, ומשכפלות גירויים מכניים ופיזיים המניעים את התנהגות התאים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול דו-שלבי המשלב את השימוש במחיקה אפיגנטית כימית עם רמזים הקשורים למכנוזנסינג, כדי ליצור תאים פלוריפוטנטיים של יונקים. בשלב הראשון, התאים מודגרים עם מולקולת הדה-מתילציה 5-אזה-ציטידין (5-aza-CR). סוכן זה מסוגל לגרום לדה-מתילציה גלובלית משמעותית של הדנ"א באמצעות השפעה משולבת של הפעולה הישירה של עשר-אחת-עשרה טרנסלוקציה 2 (TET2) בתיווך ^8,10 והעיכוב העקיף של מתיל-טרנספראזות הדנ"א (DNMT)^22,23. שלב זה גורם להסרת הבלוקים האפיגנטיים עם הפעלה מחדש לאחר מכן של ביטוי גנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, ולכן, יצירת תאים בעלי פלסטיות גבוהה ^1,2,3,8,10, להלן "תאים שנמחקו אפיגנטית". בשלב השני, התאים עטופים במערכת תרבית תלת-ממדית. לשם כך, התרכובת הסינתטית ההידרופובית הלא תגובתית polytetrafluoroethylene (PTFE; עם גודל חלקיק של 1 מיקרומטר) משמשת כמיקרו-ביוריאקטור, המאפשרת יצירת מיקרו-סביבה תאית שאינה ניתנת להשגה באמצעות שימוש במערכות תרבית דו-ממדיות מסורתיות¹⁰. חלקיקי אבקת ה-PTFE נצמדים לפני השטח של טיפת הנוזל שבה התאים נתלים מחדש ומבודדים את ליבת הנוזל מהמשטח התומך, תוך שהם מאפשרים חילופי גזים בין הנוזל הפנימי לסביבה²⁴ שמסביב. "מיקרו-ביוריאקטור PTFE" שהתקבל כך, הידוע גם בשם "שיש נוזלי", מעודד את התאים לקיים אינטראקציה חופשית זה עם זה, מקדם סידור מחדש של תאים תלת-ממדיים ^25,26,27, ומרחיב ושומר ביציבות על מצב הפלסטיות הגבוהה הנרכשת למרות רמזים הקשורים לביו-מכניזנסינג¹⁰.

Protocol

כל המחקרים נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן, שפורסם על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (NIH). בידוד תאים אנושיים מאנשים בוגרים בריאים אושר על ידי הוועדה האתית של אוספייל מג'ורה פוליקליניקו, מילאנו. כל השיטות במחקר שלנו בוצעו בהתאם להנחיות המאושרות.

1. בידוד פיברובלסט בעור

הערה: ניתן ליישם את כל ההליכים המתוארים להלן על פיברובלסטים המבודדים ממיני יונקים שונים, כולל עכברים, חזירים ובני אדם. תאי מורין בודדו מעכברים זכרים בני 7 שבועות ורקמת עור חזירית נאספה בבית המטבחיים המקומי. תאים אנושיים בודדו מחולים מבוגרים, לאחר הסכמה מדעת בכתב.

1. מכינים תמיסת ג'לטין חזירי 0.1%.
   1. שוקלים 0.1 גרם של ג'לטין חזירי וממיסים אותו ב-100 מ"ל מים. לעקר את תמיסת הג'לטין על ידי אוטוקלאב לפני השימוש.
   2. מצפים צלחת פטרי 35 מ"מ עם 0.1% ג'לטין חזירי על ידי הוספת 1.5 מ"ל של הפתרון המוכן. דגירה למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
2. חותכים ביופסיות עור של יונקים (עכברים, חזירים ובני אדם) באורך של כ-2-5 ס"מ ומניחים אותן בתמיסת הפוספט (PBS) של Dulbecco המכילה 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית. יש לאחסן בטמפרטורה של + 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   הערה: אוספי ביופסיה חייבים להתבצע בהסכמה ולאחר אישור ועדת האתיקה, בהתאם להנחיות שנקבעו.
3. שטפו באופן נרחב את הביופסיות שנאספו שלוש פעמים ב-PBS סטרילי טרי המכיל 2% תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית.
4. אספו ביופסיות מהשטיפה האחרונה והכניסו אותן לתוך צלחת פטרי סטרילית בקוטר 100 מ"מ. השתמשו באזמל סטרילי כדי לחתוך אותם לחתיכות בגודל של כ-2 מ"מ³ .
5. בתום דגירה של 2 שעות, יש להסיר את עודף תמיסת הג'לטין מצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.1.2), ובאמצעות פינצטה כירורגית סטרילית, יש להניח מיד 5-6 שברי עור בכל תבשיל תרבית מצופה מראש.
6. הרטיבו את השברים על ידי הוספת 100 μL טיפות של מדיום בידוד פיברובלסט (טבלה 1) מעל כל אחד מהם. תרבית ב 37 °C (84 °F) בחממת_{CO 2 5} %.
   הערה: כדי למנוע מהמדיום להתאדות, הניחו את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתוך צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ ומעלה המכילה מים סטריליים. הקפידו לכסות את שתי מנות הפטרי.
7. לאחר 24 שעות של תרבית, בדוק את כמות המדיום בצלחת פטרי תרבית 35 מ"מ. במידת הצורך, הוסיפו 500 μL של מדיום בידוד פיברובלסט כדי לשמור על הרטבת השברים.
8. הסירו בזהירות את המדיום ורעננו אותו לפחות כל יומיים של תרבות באמצעות פיפטה.
9. כאשר פיברובלסטים מתחילים לצמוח מתוך שברי העור המונחים בצלחת פטרי 35 מ"מ (המתוארת בשלב 1.5.) ומתחילים ליצור מונולאייר של תאים (בדרך כלל 6 ימים). הסר את חתיכות העור באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית ותרבית ב-2 מ"ל של מדיום בידוד פיברובלסט.
10. יש להמשיך ולתרבת את חד שכבת התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO₂ עד ל-80% מפגש ורענון בינוני כל יומיים.

2. תרבית תאים ראשונית פיברובלסטים

1. כאשר פיברובלסטים מגיעים ל-80% מפגש, הסירו בזהירות את מדיום הבידוד הפיברובלסט ושטפו תאים שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS המכילים תמיסה אנטי-מיקוטית אנטיביוטית של 1%.
2. לניתוק תאים, יש להוסיף 600 μL של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA בצלחת התרבית ולדגום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3-5 דקות.
3. הוסיפו 5.4 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסטים כדי לנטרל טריפסין כאשר התאים מתחילים להתנתק מצלחת התרבית (טבלה 1).
4. היפטרו מהתאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה. תאי צלחת במנות תרבית חדשות (ללא ג'לטין), תוך שמירה על יחס המעבר בין 1:2 ל-1:4 (תלוי בקצב הגדילה).
   הערה: צנטריפוגה אינה הכרחית.
5. לשמור על תאים בתרבית ולהחליף מדיום כל יומיים, עד שהם מגיעים ל-80% מפגש ומעבירים אותם.
   הערה: הפץ פיברובלסטים פעמיים בשבוע כדי לשמור על צמיחה נמרצת.

3. חשיפה פיברובלסטית ל-5-aza-CR

1. הכן פתרון מלאי טרי של 1 mM 5-aza-CR.
   1. שקלו 2.44 מ"ג של 5-אזה-CR והמיסו אותו ב-10 מ"ל של גלוקוז גבוה ב-DMEM. החייאת האבקה על ידי מערבולת. לעקר את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
      הערה: יש להכין פתרון מלאי 5-aza-CR מיד לפני השימוש.
   2. הכן פתרון עבודה 5-aza-CR על ידי דילול 1 μL של תמיסת מלאי 5-aza-CR (3.1.1.) ב-1 מ"ל של מדיום תרבית פיברובלסט.
      הערה: הריכוז של פתרון עבודה 5-aza-CR הוא 1 μM ^1,2,3,8,9.
2. נסה את התאים כפי שתואר קודם לכן (2.1.-2.3.) ופרק תאים על ידי צנרת חוזרת ועדינה.
3. אספו את מתלי התא והעבירו אותו לצינור חרוטי.
4. ספירת תאים באמצעות תא ספירה תחת מיקרוסקופ אופטי בטמפרטורת החדר. חשב את נפח המדיום הדרוש להשעיית תאים מחדש כדי לקבל 4 x 10⁴ תאים ב-30 μL של מדיום תרבית פיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.).
   הערה: הנוסחה שיש להשתמש בה תלויה בסוג הספציפי של התא.
   
5. צנטריפוגה את מתלה התא ב 150 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את גלולת הסופר-ננטנט וההחייאה עם מדיום תרבית הפיברובלסט בתוספת 1 μM 5-aza-CR (ראה שלב 3.1.2.). עבור נפח המדיום של תרבית פיברובלסט לשימוש ראה שלב 3.4.
   הערה: כבקרה שלילית, תאי החייאה מפרסמים את אותו ריכוז במדיום תרבית פיברובלסטים ללא 5-aza-CR וממשיכים עם אנקפסולציה של תאים באבקת PTFE (שלב 4.1.-4.13.).

4. אנקפסולציה פיברובלסטית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE

1. מלאו צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באבקת פוליאטראפלואורואתילן (PTFE) כדי לייצר מיטה (איור 1A).
   הערה: השתמש בצלחות פטרי בקטריולוגיות 35 מ"מ כדי למנוע הידבקות שיש נוזלית. על מנת לקבל מעטפת הידרופובית ונקבובית דקה, השתמש באבקת PTFE עם גודל חלקיק ממוצע של 1 מיקרומטר ומיוצרת עם טחינה מקסימלית של 2.0 NPIRI. זה מאפשר יצירת גולות נוזליות חדירות בגז. יתר על כן, הציפוי השקוף מאפשר תצפית על תהליכי צבירה של תאים בזמן אמת גודל חלקיקים גדול יותר מוביל לפולידיספרסיות גבוהה שיכולה לגרום לאידוי מוגבר, עיוות ואובדן הצורה הכדורית, והתמוססות מוקדמת של המיקרו-ביוריאקטורים.
2. מחלקים 30 μL טיפה בודדת המכילה 4 x 10⁴ תאים (ראו שלבים 3.4.-3.5.) על מצע האבקה (איור 1B).
3. סובבו בעדינות את צלחת ה-Petri בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי להבטיח שאבקת PFTE תכסה לחלוטין את פני השטח של טיפת הנוזל כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי (איור 1C).
4. הרימו את המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, שנחתך בקצה, כדי להתאים לקוטר השיש (איור 1D,E). צלחת המיקרו-ביו-ריאקטור משיש נוזלי על צלחת פטרי בקטריולוגית נקייה כדי לייצב אותה (איור 1F).
   הערה: כדי ליצור חיכוך לאחיזת השיש בתוך הקצה, חתכו את קצות הפיפטה בקוטר של מעט פחות מקוטר השיש הנוזלי.
5. העבירו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי מצלחת הפטרי לצלחת של 96 בארות (שיש/באר אחת) (איור 1G).
6. לאט לאט להוסיף 100 μL של מדיה משולי הבאר. המיקרו-ביו-ריאקטור מתחיל לצוף על גבי המדיה (איור 1H).
   הערה: המיקרו-ביו-ריאקטור נשבר במגע ישיר עם נוזל, עקב ההפרעה להידרופוביות של PTFE. כגישה חלופית, ניתן למקם את המיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי בנפרד בצלחת תרבית בקטריולוגית של 35 מ"מ. במקרה זה, על מנת למנוע אידוי שיש נוזלי, יש להחדיר את צלחת הפטרי 35 מ"מ המכילה את המיקרו-ביוריאקטור לצלחת פטרי 100 מ"מ, שבעבר הוטבעה במים סטריליים
7. אינקובציה של מיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% CO₂ 1,2,3,8,9.
   הערה: גודל חלקיק ה-PTFE של 1 מיקרומטר יכול להבטיח חילופי גזים אופטימליים בין הנוזל הפנימי לסביבה שמסביב.
8. לאחר דגירה של 5-aza-CR במשך 18 שעות, אספו את המיקרו-ביוריאקטור משיש נוזלי באמצעות חתך קצה פיפטה של 1,000 μL בקצה (ראו שלב 4.5).
9. מקם את המיקרו-ביוריאקטור בצלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ (איור 1D-F).
10. השתמש במחט כדי לנקב את השיש הנוזלי ולשבור אותו.
11. ספרואידים שנוצרו משוחזרים עם קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה, תחת סטריאומיקרוסקופ (איור 1I,J).
    הערה: תאים שנמחקו באופן אפיגנטי עטופים ב-PTFE יוצרים מבנה כדורי תלת-ממדי (צבירה אחת בכל שיש נוזלי).
12. כדי להעריך את הרכישה של מצב פלוריפוטנטי בתגובה ל-5-aza-CR, בדקו את תחילת ביטוי הגנים הקשורים לפלוריפוטנטיות, OCT4, NANOG, REX1 ו-SOX2, על ידי PCR איכותי (טבלה 2).
13. המשך עם השלב השני של הפרוטוקול כמתואר להלן.

5. תרבית במיקרו-ביוריאקטורים של PTFE של תאים שנמחקו אפיגנטית

1. הכינו מדיום תרבות ESC טרי (טבלה 1).
2. העברת אורגנואידים בצלחת פטרי המכילה מדיום ESC לשטיפת שאריות 5-aza-CR (ראה שלבים 5.1.-5.2.).
3. הכינו צלחת פטרי בקטריולוגית חדשה בקוטר 35 מ"מ המכילה מצע אבקת PTFE (ראו גם שלב 4.1).
4. מחלקים אורגנואיד יחיד בטיפה של 30 μL מדיום תרבית ESC על מצע האבקה באמצעות קצה פיפטה של 200 μL, שנחתך בקצה (ראו שלבים 4.9.; 5.3.).
5. סובבו בעדינות את צלחת הפטרי בקוטר 35 מ"מ בתנועה מעגלית כדי ליצור מיקרו-ביו-ריאקטור חדש משיש נוזלי, הרימו אותה באמצעות קצה פיפטה של 1,000 μL, נחתכו בקצה, והניחו את המיקרו-ביוריאקטור החדש שנוצר לתוך באר של צלחת בת 96 בארות (שיש/באר אחת) (ראו שלבים 4.3.-4.6).).
6. כדי להציף את המיקרו-ביוריאקטורים, הוסיפו 100 μL של מדיה משולי הבאר כדי לרחוץ לאט את השיש (ראו הערה 4.7)."
7. מיקרו-ביוריאקטורים משיש נוזלי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO_{2 של} 5% למשך זמן רב ככל שנדרש. שינוי בינוני כל יומיים, בעקבות ההליך המתואר ב 5.3.-5.7.
   הערה: בכתב היד הנוכחי, מסופקות תוצאות המתקבלות עם תרבית אורגנואידים במשך 28 ימים. עם זאת, במידת הצורך ניתן לבצע תקופת תרבות ארוכה יותר.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את כל השלבים שיש לבצע כדי ליצור ולתחזק ביציבות תאים פלוריפוטנטיים של יונקים מתאים סומטיים בוגרים. שיטה זו הצליחה עם פיברובלסטים שבודדו ממיני יונקים שונים, כלומר עכברים, חזירים ובני אדם. התוצאות הייצוגיות כאן המדווחות מתקבלות מכל קווי התאים, ללא קשר למיני המוצא.

Discussion

במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים התמקדו בפיתוח אסטרטגיות להחזרת תא מובחנות סופנית לעבר מצב פחות מחויב ומתירני גבוה יותר. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ייצור ותחזוקה ארוכת טווח של תאים פלוריפוטנטיים החל מתאים בוגרים בוגרים שהתמיינו באופן סופני. השיטה משלבת שני שלבים בלתי תלויים הכוללים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Component of ESC medium
5-Azacytidine	Sigma-Aldrich	A2385	5-aza-CR, for fibroblast epigenetic erasing
Adenosine	Sigma-Aldrich	A4036	Component of nucleoside mix for ESC medium
Antibiotic Antimycotic Solution (100×)	Sigma-Aldrich	A5955	Component of fibroblast and ESC media
CFX96 Real-Time PCR	Bio-Rad Laboratories	NA	Thermal cycler for quantitative PCR
Cytidine	Sigma-Aldrich	C4654	Component of nucleoside mix for ESC medium
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966052	For fibroblast isolation and culture medium
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	31885023	For ESC medium
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	PBS; for biopsy and cell wash and for solution preparation
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification Kit	Thermo Fisher Scientific	61021	mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Sigma-Aldrich	ESG1106	Component of ESC medium
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermo Fisher Scientific	10500064	Component of fibroblast and ESC media
FGF-Basic (AA10-155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Component of ESC medium
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890	For dish coating
GeneAmp PCR System 2700	Applied Biosystems	NA	Thermal cycler for qualitative PCR
Global DNA Methylation ELISA Kit	CELL BIOLABS	STA-380	Methylation study
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7801	Qualitative PCR
Guanosine	Sigma-Aldrich	G6264	Component of nucleoside mix for ESC medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31550031	For ESC medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Component of ESC medium
KOVA glasstic slide 10 with grids	Hycor Biomedical	87144	For cell counting
Leica MZ APO Stereo Microscope	Leica	NA	For organoid observation
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Component of fibroblast and ESC media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140035	Component of ESC medium
Millex-GS 0.22 µm pore filters	Millipore	SLGS033SB	For solution sterilization
M-MLV Reverse Transcriptase, RNase H Minus, Point Mutant	Promega	M3681	mRNA reverse transcription
Multiskan FC Microplate Photometer	Thermo Fisher Scientific	51119000	For ELISA plate reading
Nikon Eclipse TE300 Inverted Phase Contrast Microscope	Nikon	NA	For cell observation
Perkin Elmer Thermal Cycler 480	Perkin Elmer	NA	Thermal cycler for reverse transcription
Poly(tetrafluoroethylene) 1 μm particle size	Sigma-Aldrich	430935	For generating micro-bioreactor
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Thermo Fisher Scientific	K182001	Genomic DNA estraction
TaqMan Gene Expression Cells-to-CT Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1728	Quantitative PCR
Thymidine	Sigma-Aldrich	T1895	Component of nucleoside mix for ESC medium
Tissue Culture Dish 100X20 mm, Standard	Sarstedt	833902	For fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Standard	Sarstedt	833900	For Fibroblast isolation
Tissue Culture Dish 35X10 mm, Suspension	Sarstedt	833900500	Bacteriology petri dish for liquid marble culture
Tissue Culture Plate 96 Well,Standard,F	Sarstedt	833924005	For liquid marble culture
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924	For fibroblast dissociation
Tube 15ml, 120x17mm, PS	Sarstedt	62553041	For cell suspension centrifugation
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003	Component of nucleoside mix for ESC medium