חתך עצב הראייה המשמר נדן בחולדות כדי להעריך התחדשות אקסונים והתערבויות המכוונות לאקסון תאי הגנגליון ברשתית

Summary

פרוטוקול זה מתאר חתך עצב הראייה המשמר את מעטפת עצב הראייה בחולדות. לחץ הידרוסטטי ממיקרו-הזרקות לעצב הראייה יוצר חתך שלם, המאפשר מיקום מחדש ללא תפרים של קצות עצב הראייה העוברים ומיקוד ישיר של התא האקסונלי במודל חתך.

Abstract

אקסונים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) מתכנסים בראש עצב הראייה כדי להעביר מידע חזותי מהרשתית למוח. פתולוגיות כגון גלאוקומה, טראומה ונוירופתיה אופטית איסכמית פוגעות באקסונים של RGC, משבשות את העברת גירויים חזותיים וגורמות לאובדן ראייה. מודלים של בעלי חיים המדמים פגיעה באקסון RGC כוללים פרדיגמות ריסוק עצב ראייה וטרנסקציה. לכל אחד מהדגמים הללו יתרונות וחסרונות מובנים. ריסוק עצב הראייה הוא בדרך כלל פחות חמור מחתך וניתן להשתמש בו כדי לבחון את התחדשות האקסון על פני אתר הנגע. עם זאת, הבדלים בכוח הריסוק ומשך הזמן יכולים להשפיע על תגובות הרקמות, וכתוצאה מכך שחזור משתנה ושלמות הנגע. עם חתך עצב הראייה, יש פגיעה חמורה וניתנת לשחזור שפוגעת לחלוטין בכל האקסונים. עם זאת, מעבר עצב הראייה משנה באופן דרמטי את מחסום הדם המוחי על ידי הפרת מעטפת עצב הראייה, וחושף את עצב הראייה לסביבה ההיקפית. יתר על כן, לא ניתן להעריך התחדשות מעבר לאתר חתך מבלי להחזיר את קצות העצבים החתוכים. יתר על כן, שינויים ניווניים מובהקים ומסלולים תאיים מופעלים על ידי פציעת ריסוק או חתך.

השיטה המתוארת כאן משלבת את היתרונות של מודלים של ריסוק עצב הראייה ושל חתך תוך הפחתת החסרונות. לחץ הידרוסטטי המועבר לעצב הראייה על ידי מיקרו-הזרקה חוצה לחלוטין את עצב הראייה תוך שמירה על שלמות מעטפת עצב הראייה. קצות עצב הראייה הטרנסקטים מורכבים מחדש כדי לאפשר בדיקות התחדשות אקסונים. מגבלה פוטנציאלית של שיטה זו היא חוסר היכולת לדמיין את החתך השלם, מקור פוטנציאלי לשונות. עם זאת, אישור חזותי לכך שהחלק הגלוי של עצב הראייה עבר טרנסקטציה מעיד על חתך מלא של עצב הראייה עם 90-95% הצלחה. ניתן ליישם שיטה זו כדי להעריך אסטרטגיות מקדמות התחדשות אקסונים במודל חתך או לחקור התערבויות המכוונות לתאים האקסונליים.

Introduction

פגיעה אקסונלית וניוון מתרחשים בתאי גנגליון רשתית (RGCs) לאחר טראומה או במחלות ניווניות כמו גלאוקומה ^1,2. אובדן RGCs ושיבוש הקרנות רטינופוגליות מביאים לאובדן ראייה קבוע³. כדי להבין את המסלולים המולקולריים האחראים לתהליכים הניווניים ולפתח אסטרטגיות להפחתת אובדן אקסונלי ו-RGC או לחידוש אקסונים של RGC, נעשה שימוש במודלים של בעלי חיים ניסיוניים כדי לדמות פגיעה בעצב הראייה, כולל מודלים של ריסוק עצב הראייה ומודלים של חתך עצב הראייה. בבחירת מודל ניסיוני, יש לקחת בחשבון את היתרונות והחסרונות של כל גישה כמו גם את המסלולים המולקולריים המופעלים על ידי הפגיעה⁴.

הרציונל לפיתוח השיטה המתוארת כאן הוא למנף את היתרונות של דגמי ריסוק עצב הראייה⁵ וטרנסקט⁶ תוך הפחתת החסרונות. מטרות שיטה זו היו ליצור פגיעה בעצב הראייה הניתנת לשחזור שבה כל האקסונים עוברים ללא ספק ובאופן מלא, החשיפה למערכת החיסון ההיקפית ממוזערת, והקצוות המועברים של עצב הראייה מתחברים בקלות כדי לאפשר הערכה של התחדשות RGC. בנוסף, השיטה פותחה כדי לאפשר גישה ממודרת לחלק האקסונלי של RGCs פגועים ולספק התערבויות ספציפיות לאקסון (למשל, גורמים נוירוטרופיים, השתלות תאיות) באופן מקומי לעצב הראייה הרטרואורביטלי.

ישנם יתרונות מרובים של טכניקה זו על פני שיטות אלטרנטיביות. בהשוואה לריסוק עצב הראייה, שיטה זו עוברת באופן מלא ומהימן על עצב הראייה; זה מטפל בבעיה פוטנציאלית של חיסכון לא רצוי^{באקסון 7}. בנוסף, השיטה המתוארת גורמת לפגיעה אקסונלית חמורה שאינה תלויה בכמות ומשך הכוח המופעל על ידי המפעיל כמו בפציעת ריסוק, ובכך מפחיתה את השונות⁸. בניגוד לשיטות מבוססות למעבר עצב הראייה, הגישה המפורטת בפרוטוקול זה שומרת על שלמות מעטפת עצב הראייה. יתרון בשימור מעטפת עצב הראייה הוא בכך שהוא מונע את חשיפת עצב הראייה למערכת החיסון ההיקפית. יתר על כן, הכוחות המכניים המופעלים על ידי מעטפת עצב הראייה על עצב הראייה הטרנסקט מאשרים מחדש את קצות העצב החתוכים ללא צורך במניפולציות מיקרו-כירורגיות מאתגרות ^9,10,11. לבסוף, כאשר מעטפת עצב הראייה שלמה, השיטה מייצרת מרחב פיזי בין גדמי עצב הראייה שלתוכו ניתן להכניס תאי גזע, גורמים נוירוטרופיים או פולימרים לאקסוני RGC נגועים ישירות.

ריסוק עצב הראייה הוא מודל תקן הזהב שבו מוערכות אסטרטגיות התחדשות עצב הראייה כדי לקבוע את יעילות הטיפולים. גודלו של עצב הראייה של המכרסם מגביל את המניפולציות האפשריות, במיוחד את החתך וההתאמה מחדש של העצב. עם זאת, בתחום הפגיעה וההתחדשות של חוט השדרה, יש הסכמה כי חתך שלם הוא המודל האידיאלי להבחין בין התחדשות אקסונלית לאקסון¹² שנחסך. השיטה המתוארת כאן מפחיתה את החסמים הטכניים להערכת אסטרטגיות התחדשות במודל חתך עצב הראייה. ככזה, ניתן להשתמש במודל זה כדי לאמת אסטרטגיות מבטיחות שזוהו בפרדיגמות ריסוק עצב הראייה עם חתך עצב הראייה. בנוסף, מכיוון שמודל זה מכוון ישירות לתא האקסונלי, הוא מאפשר מחקרים של התערבויות על אקסוני RGC בוגרים פצועים והמנגנונים האחראים לתהליכים ניווניים והתחדשות אקסונליים.

המודל של חתך עצב הראייה המתואר במחקר זה חוצה לחלוטין את עצב הראייה תוך שמירה על מעטפת עצב הראייה. גישה חדשנית זו מתאימה לניסויים שמטרתם להעריך את התחדשות האקסונים במודל חתך ללא צורך בתהליך המאתגר מבחינה טכנית של יישום מחדש של קצוות עצב הראייה. היבטים של הטכניקה דומים לביצוע ריסוק עצב הראייה; לכן, הגישה יכולה להתבצע על ידי מפעילים מנוסים בריסוק עצב הראייה. הגישה הכירורגית אינה דורשת מכשירים שתוכננו במיוחד וניתן להשלים אותה עם מכשירים כירורגיים זמינים ומערכת מיקרו-הזרקה, מה שהופך אותה לנגישה וחסכונית.

Protocol

נהלים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מערכת הבריאות לענייני חיילים משוחררים בסן דייגו. מכשירים ותמיסות כירורגיות עוקרו לפני הניתוח כדי להגביל זיהומים וסיבוכים לאחר הניתוח.

1. טכניקה כירורגית

1. לערוך ניסויים בטכניקות אספטיות ובהתאם לפרוטוקולים ספציפיים לשימוש בבעלי חיים.
2. לעקר מכשירים וחומרים הנוגעים ברקמות חיות כדי למנוע זיהומים, להימנע מהשפעה שלילית על רווחת בעלי החיים ולמזער השפעות שליליות פוטנציאליות על המחקר. נקו היטב מכשירים כירורגיים עם מים וחומרי ניקוי או מוצרים אנזימטיים כדי להסיר חומרים זרים ולעקר על ידי קיטור או עיקור הבזק.
3. Aliquot נוזלים למיכלים סטריליים במכסה המנוע של תרבית רקמות. עקר את מזרק המיקרוליטר על ידי שטיפתו ב-70% אתנול ושטיפתו בתמיסת מלח סטרילית פוספט (PBS).

2. הרדמה

1. להרדים חולדות באמצעות מערכת אידוי איזופלורן. אידוי איזופלורן בריכוז של 4.5% באמצעות חמצן באיכות רפואית בקצב של 1 ליטר לדקה לתוך קופסת הרדמה מחוברת. הכניסו את החיה לקופסת ההרדמה עד שהנשימה מאטה והחיה מורדמת.
   הערה: שלב ראשוני זה באמצעות הרדמה עם הרדמה בגז אינו הכרחי אם המפעיל מרגיש בנוח ובקיא במתן חומרי הרדמה בהזרקה לבעלי חיים שאינם מורדמים.
2. יש להוציא נפח מספיק של קוקטייל הרדמה המורכב מקטמין (50 מ"ג/ק"ג), קסילזין (2.6 מ"ג/ק"ג) ואצפרומזין (0.5 מ"ג/ק"ג) למזרק טוברקולין של 30 גרם. הסר את בעל החיים המורדם מקופסת ההרדמה. יש להזריק את ההרדמה תוך צפקית כדי להשיג עומק סדציה עקבי לאורך כל ההליך ולהחזיר את בעל החיים לכלוב שלו.
3. התחל את ההליך כאשר צביטה בבוהן לא מצליחה לעורר תגובה. העריכו את עומק וקצב הנשימה של בעל החיים ועם צביטה בבוהן כל 5 דקות לאורך ההליך כדי להבטיח היעדר כאב.
4. עם סיום הניתוח, הסר את החיה מהמסגרת הסטריאוטקסית. יש לתת זריקה תת עורית של מי מלח (3 מ"ל), אמפיצילין (0.15-0.2 מ"ג/ק"ג) ובאנמין (2.5-5 מ"ג/ק"ג) כדי לספק משככי כאבים ותמיכה בנוזלים. העבירו את החיה לאינקובטור מחומם כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.

3. גישה כירורגית

1. הנח את החולדה (גיל 7-8 שבועות, זן פישר 344) במסגרת סטריאוטקסית לראש ועל גבי כרית מחוממת. מקם את המסגרת הסטריאוטקסית כשראש החולדה פונה לשמאל המנתח ומרכז את המסלול השמאלי בשדה הראייה הכירורגי.
2. על עין שמאל יש למרוח טיפת פרופרקאין ולנקות את העין על ידי מריחת 5% פובידון-יוד על העפעף והעין. יש למרוח משחה עיניים על קרנית שתי העיניים כדי לשמור על לחות הקרנית ולמנוע היווצרות קטרקט.
3. העבירו תפר פוליגלקטין 4-0 דרך האפידרמיס של העפעף העליון אל ההיבט המרכזי של שולי העפעף, והשתמשו בתפר זה לטרסוראפיה זמנית בשלבים מאוחרים יותר. השתמש בתפר כדי להרחיק את העפעף ולחשוף את הפורניקס העליון.
4. הדביקו את תפר הפוליגלקטין למסגרת הסטריאוטקסית כדי להפעיל מתיחה וחשיפה מתמדת. הימנע ממתיחה מוגזמת מכיוון שהדבר עלול להגביל את החשיפה של התוכן הרטרואורביטלי.
5. בעזרת מלקחיים של Colibri, הרם את הלחמית העליונה וחתך את הלחמית לאורך הלימבוס עם זוג מספריים של Vannas. בצע פריטומיה בשעה 4 לאורך הלימבוס העליון.
6. החל מתיחה נחותה קלה על הגלובוס על ידי הנחת תפר פוליפרופילן עם לולאה לאורך הלימבוס העליון עם הקצוות החופשיים מתחת לגלובוס. רקמה שיורית לאורך הלימבוס העליון לאחר הפריטומיה מספיקה כדי לספק מתיחה על לולאת התפר ללא צורך להעביר את התפר דרך הסקלרה או הלימבוס.
   1. אבטח את קצות הלולאה בעזרת מהדק בולדוג ואפשר למהדק להשתלשל בחופשיות באוויר. משקל המהדק יפעיל מתיחה נחותה על הגלובוס ויחשוף יותר מהחלל הרטרואורביטלי.
7. ניתוח קהה עם מספריים של Vannas לאורך הסקלרה בעקבות ההיבט האחורי של הגלובוס ומתחת לרקטוס העליון. הוצא את שרירי פי הטבעת העליונים מהגלובוס על ידי חיתוך גיד השריר בעזרת מספריים של Vannas כדי לגשת לחלל הרטרואורביטלי.

4. גישה לעצב הראייה

1. ניתוח קהה עם מלקחיים של Dumont #5/45 לאורך ההיבט הטמפורלי של הגלובוס האחורי וזיהוי וריד המערבולת הצדדית העליונה. ניתוח קהה נוסף של האף לווריד המערבולת הצדדית העליונה כדי לחשוף את חרוט שריר המסלול סביב עצב הראייה ולהימנע מפגיעה מוקדמת בעצב הראייה. הימנע מפגיעה בווריד המערבולת מכיוון שהדבר עלול לגרום לדימום משמעותי. אם מתרחש דימום, ניתן למרוח אפליקטור כותנה עד להפסקת הדימום.
2. בעזרת מלקחיים Dumont #5/45, הכנס בזהירות את הקצה לתוך ההיבט הטמפורלי של חרוט שריר המסלול ופתח את המלקחיים במקביל למהלך סיבי השריר כדי לחשוף את עצב הראייה. השתמש במלקחיים כדי לעקור לרוחב את סיבי השריר המכסים את עצב הראייה ולחשוף את העצב במלואו. ודא שרק מעטפת עצב הראייה מכסה את עצב הראייה שכן סיבי שריר שיוריים ימנעו מפיפטה נימי הזכוכית הנמשכת לחדור בקלות לעצב הראייה.
3. שמור על חשיפת העצב על ידי הנחת שני מלקחיים Dumont #5/45 לאורך שני ההיבטים הצדדיים של העצב ופתיחת המלקחיים. כמות החשיפה אמורה לאפשר לעצב הראייה להימחץ 1.5-2.0 מ"מ אחורי הגלובוס ולהחדיר פיפטה נימית זכוכית משוכה לעצב הראייה מההיבט הגבי.

5. מעבר עצב הראייה בתוך המעטפת האופטית

1. בעזרת מלקחיים Dumont #5/45, הניחו את הקצוות משני צידי עצב הראייה לפחות 1.5-2.0 מ"מ אחורי הגלובוס. ודא שקצות המלקחיים משתרעים על קוטר העצב. סגור לחלוטין את המלקחיים למשך 5 שניות כדי לרסק את עצב הראייה ולרשום את מיקום מקום הריסוק.
2. בעזרת מזרק מיקרוליטר, מלאו פיפטה נימית משוכה מזכוכית ב-1-2 מיקרוליטר PBS והצמידו את הפיפטה למחזיק פיפטה. התקן את מחזיק הפיפטה למיקרומניפולטור והצמד את המיקרומניפולטור למסגרת הסטריאוטקסית.
3. כוונן את מערכת המיקרו-הזרקה כדי לספק דופק בודד של 4 אלפיות השנייה בלחץ של 20 psi בכל לחיצה על הכפתור. מקם את הפיפטה בשדה הניתוח.
4. תחת הטווח הכירורגי, השתמש בזוג מלקחיים #55 כדי לשבור ולשפוע את קצה הפיפטה לגודל (קוטר ~20-30 מיקרומטר) המסוגל לספק נפח קטן אך גדול מספיק כדי לספק קשיחות מספקת כדי לחדור למעטפת עצב הראייה. אשר את הסבלנות של קצה הפיפטה על ידי מתן דופק יחיד והתבוננות בנוזל בקצה הפיפטה.
5. צמצם את מיקום קצה הפיפטה ממש מעל מקום ריסוק עצב הראייה במרכז עצב הראייה ובמגע עם מעטפת עצב הראייה. שימו לב למיקום האנכי של הפיפטה על המיקרומניפולטור כדי לקבוע מאוחר יותר עומק של 200 מיקרומטר.
6. הורד את הפיפטה תוך התבוננות בקצה מתחת לטווח הניתוח עד שהפיפטה נכנסת לעצב הראייה. אם קצה הפיפטה מתכופף וחסר את הנוקשות לחדור למעטפת עצב הראייה, משוך את הפיפטה והשתמש בזוג מלקחיים #55 כדי להקטין את האורך ולהגדיל את קוטר קצה הפיפטה. לאחר ביצוע התאמות לקצה הפיפטה, נסה שוב לחדור למעטפת עצב הראייה עם הפיפטה.
7. עם הכניסה לעצב הראייה עם קצה הפיפטה, משוך את הפיפטה במידת הצורך. מיקום קצה הפיפטה, כפי שמצוין על ידי המיקרומניפולטור הסטריאוטקסי, צריך להיות 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח של עצב הראייה מהמיקום הראשוני שצוין בשלב 5.5.
8. תוך כדי התבוננות בעצב הראייה תחת הטווח הכירורגי, הפעל פולסים של לחץ הידרוסטטי עם מערכת המיקרו-הזרקה. כאשר מופעלים פולסים, יש לציין הפרדה ליניארית בין הקצוות הדיסטליים והפרוקסימליים של עצב הראייה כדי לאמת חתך של עצב הראייה.
   הערה: נפח הזרקה של 250-500 נ"ל מספיק בדרך כלל כדי לספק את הכוח הדרוש כדי לחצות את עצב הראייה. זריקות הדורשות יותר מ-1 מיקרוליטר עשויות להצביע על צורך במיקום מחדש של אתר ההזרקה. נפחים גדולים יותר המוזרקים לפרנכימה השלמה עשויים שלא לגרום לנזק נוסף ל-RGC בהתחשב בכך שהשיטה חוצה לחלוטין את עצב הראייה אך סביר יותר לעקוב לאורך הפאסיקלים של עצב הראייה. אי התבוננות בחתך ליניארי של עצב הראייה למרות הזרקת נפח נוזל מספיק מעיד ככל הנראה על מיקום שגוי של הפיפטה באתר הריסוק וצורך במיקום מחדש. ייתכן שיהיה צורך גם בעלייה של 50% בלחץ ההזרקה.

6. סגירה והתאוששות

1. משוך את הפיפטה והסר את מלקחיים Dumont #5/45 הנסוגים. החזר את העין למצב ניטרלי על ידי הסרת מהדק הבולדוג ותפר פוליפרופילן בלולאה מהגלובוס.
2. מקם מחדש את הלחמית ללימבוס הקרנית, והבטיח לשחרר כל לחמית שהתהפכה כדי לאפשר מיקום נכון של הרקמה וריפוי. מרחו משחה אנטיביוטית מקומית לעיניים על העין.
3. הסר את הסרט מהעפעף 4-0 תפר פוליגלקטין ושמור על התפר במקומו לשימוש לטרסורפי זמני. העבירו את התפר דרך שולי העפעף של העפעף התחתון, דרך האזור התת עורי בצורה נחותה ויצאו דרך האפידרמיס. קושרים את התפר בלחץ מספיק כדי לעצום את העין.
4. יש לתת משככי כאבים לאחר ניתוח בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים ולהנחיות הרשות לטיפול בבעלי חיים. שכן את החיה באופן עצמאי בכלוב מחומם כדי להתאושש לאחר הניתוח. אין להניח מצעים בכלוב ההתאוששות כדי למנוע שאיפה בשוגג.

תוצאות

חתך של עצב הראייה מביא בדרך כלל לאובדן אפופטוטי של 80-90% מה-RGCs הפגועים תוך 14 יום לאחר הפציעה. הטכניקה המתוארת חוצה את עצב הראייה תוך שמירה על שלמות מעטפת עצב הראייה (איור 1). מידת אובדן ה-RGC ניתנת להשוואה למודלים מסורתיים של חתך עצב הראייה וריסוק עצב הראייה, עם היתרון שקצות העצבים החתוכים מונחים ללא מאמץ לאחר חתך בשיטה המתוארת כאן (איור 2). חיבור מחדש של קצוות עצב הראייה החתוך באופן זה מאפשר הערכה של התחדשות אקסונלית RGC במודל חתך על ידי מתן מצע שעליו עשויים לצמוח אקסונים וללא צורך במניפולציה מיקרוכירורגית לחיבור מחדש של קצות העצבים החתוכים (איור 3). מעקב אנטרוגרדי של אקסונים RGC עם תת-יחידה B של רעלן כולרה (CTB) מדגים כי אקסונים חיוביים ל-CTB עוברים טרנסקטציה מלאה לאחר חתך עצב הראייה המשמר נדן (איור 4). שימור מעטפת עצב הראייה תוך כדי מעבר עצב הראייה יוצר גם חלל סגור שלתוכו ניתן להעביר חומרי חקירה, כגון גורמים או תאים נוירוטרופיים, לאקסוני RGC נגועים ולשמור עליהם במקומם (איור 5). במהלך השלבים הראשונים של האימון, יש שיעור הצלחה צפוי של 60-70% של חתך כולל. עם ניסיון, אחוזי ההצלחה של החתך הכולל הם כ-90-95%.

איור 1: מעבר עצב הראייה תוך שמירה על מעטפת עצב הראייה. (A) תמונה של שדה הניתוח המדגימה חשיפה של עצב הראייה השלם לפני החתך. (B) תמונה של עצב הראייה לאחר חתך. פיפטת זכוכית עדינה פילחה את מעטפת עצב הראייה באתר החתך והעבירה תרחיף תאים (תמיסה עכורה) לחלל שבין קצות עצב הראייה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אובדן תאי גנגליון ברשתית בעקבות מעטפת עצב הראייה המשמרת חתך עצב הראייה. רשתית שלמה מייצגת שטוחה מעיניים עם (A) עצב ראייה שלם, (B) מעטפת עצב ראייה המשמרת חתך עצב הראייה, (C) חתך עצב ראייה מסורתי, או (D) ריסוק עצב הראייה 14 יום לפני כן היו בעלי תווית חיסונית לגמא סינוקלאין (SNCG). התמונות התקבלו ממיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרה של פי 10, תוקנו להצללה ותפרו ליצירת תמונה אחת. אובדן גופי תאי גנגליון רשתית (RGC) ברחבי הרשתית ניכר בעיניים נגועות. שיבוצים מראים תמונות הגדלה גבוהות יותר של הרשתית ומדגימים אובדן משמעותי של RGCs בעקבות פגיעות בעצב הראייה. (E) כימות הישרדות RGC מדגים אובדן RGC משמעותי בעקבות פגיעות בעצב הראייה בהשוואה לעצבי ראייה שלמים. *P< 0.05 בהשוואה לשלם; ANOVA חד כיווני עם מבחן Tukey פוסט-הוק. n = 3 בעלי חיים לקבוצה; פסי שגיאה מייצגים SD. SP-ONT, חתך עצב ראייה משמר נדן; ONT, חתך עצב הראייה; ONC, ריסוק עצב הראייה. פסי קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. פסי קנה מידה בכניסות = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מקטעים של עצבי ראייה בעקבות פגיעות בעצב הראייה. תמונות מייצגות של חתך אורכי דרך עצבי הראייה 14 יום לאחר (A-C) חתך משמר מעטפת עצב הראייה, (D-F) חתך עצב הראייה המסורתי, או (G-I) ריסוק עצב הראייה. (א,ד,ג) תיוג חיסוני עבור חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) מתאר את היקף הנגע בעוד שתיוג DNA (B,E,H) עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדגים תאיות רציפה לאורך עצב הראייה ובתוך אתר הנגע. (ג,ו,י) תמונות ממוזגות המדגימות לוקליזציה של רקמה עצבית חיובית ל-GFAP ותאיות באתר הנגע. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: חתך של עצב ראייה בעקבות מעטפת עצב הראייה המשמרת חתך עצב הראייה. תמונות מייצגות של חתך אורך דרך עצב ראייה 14 יום לאחר מעטפת עצב הראייה המשמרת חתך עם מעקב אקסון אנטרוגרדי עם הזרקת תת-יחידה B של רעלן כולרה תוך-זגוגית (CTB). (A) אפשר להבחין בנגעים מלאים של אקסוני RGC שמסומנים ב-CTB שמשתרעים מהגלובוס (משמאל) לכיוון המוח (מימין). (B) תיוג חיסוני עבור חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) מתאר נגע נרחב שכולל את כל הקוטר של עצב הראייה. (C) תיוג DNA עם 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדגים תאיות בתוך אתר הנגע. (D) תמונה ממוזגת המדגימה לוקליזציה של אקסונים המסומנים ב-CTB, רקמה עצבית חיובית ל-GFAP ותאית באתר הנגע. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: חתך אורך של עצב ראייה שעבר טרנסקטציה שקיבל שתל תא. תמונות מייצגות של חתך אורך דרך עצב ראייה 14 יום לאחר מעטפת עצב הראייה המשמרת חתך והשתלה של תאי גזע עצביים (NSCs) המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי tdTomato. (A) תיוג חיסוני לחלבון חומצי סיבי גליה (GFAP) הדגים הפרדה מוחלטת של קצוות עצב הראייה הטרנסקט. (B) תאי גזע עצביים שמבטאים tdTomato נכללו בתוך החלל שנוצר על ידי הטכניקה המתוארת והמשיכו לשרוד לאחר ההשתלה. (C) תאי גזע עצביים מושתלים הוצמדו ישירות לשני הקצוות החתוכים של עצב הראייה הטרנסקט. מוטות קנה מידה, 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוצדורות כירורגיות המתארות את מודל חתך עצב הראייה פורסמו בעבר⁶. עם זאת, הטכניקות המפורטות בפרוטוקולים אלה כוללות חיתוך של מעטפת קרום המוח כדי לחצות את עצב הראייה. יתר על כן, על מנת להעריך את התחדשות אקסון RGC במודלים קודמים של חתך, נדרשו מניפולציות מיקרו-כירורגיות מאתגרות כדי להצמיד את קצות עצב הראייה החתוכים או השתלת עצב היקפי לגדם עצב הראייה הפרוקסימלי^10,13. הפרוטוקול המתואר כאן משבש באופן מינימלי את מעטפת עצב הראייה תוך כדי מעבר עצב הראייה ומאפשר הערכות של התחדשות אקסון RGC במודל חתך ללא צורך במניפולציות מיקרו-כירורגיות מאתגרות מבחינה טכנית.

מספר שלבים הם קריטיים בפרוטוקול זה. יש להקפיד להימנע מפגיעה בעורק העיניים ובכלי הדם המספקים את ראש עצב הראייה. לכן, יש להשלים את שלב 5.1 לפחות 1.5-2.0 מ"מ אחורי הגלובוס. אם מתרחש נזק לעורק העיניים ומשבש את אספקת הדם ברשתית, יש להוציא את העין מניסויים נוספים מכיוון שסביר להניח שפתיסיס יבוא בעקבותיו. בשלבים 5.4-5.6, חשוב לשמור על שלמות מעטפת עצב הראייה ולמזער את גודל הפתח שדרכו נכנסת פיפטת הזכוכית לעצב הראייה. פעולה זו יוצרת אטימה הדוקה סביב קצה הפיפטה כדי להפחית את ריפלוקס הנוזלים ומאפשרת יצירת לחץ הידרוסטטי מספיק כדי לחצות את עצב הראייה. שיפוע קצה פיפטות הזכוכית ישפר את הקלות שבה הפיפטה נכנסת לעצב הראייה מבלי לגרום לנזק משני.

ישנם שינויים פוטנציאליים שהמפעילים יכולים לבצע כדי לשפר את הנגישות של שיטה זו. ההליכים המתוארים כוללים דיסקציה מינימלית והסרה של רקמת המסלול עם שימור עצב הפנים והטריגמינל. בעוד שזה מפחית תחלואה וסיכונים לדימום, רקמות כמו שומן אורביטלי ובלוטת הדמעות עשויות להגביל את ההדמיה של מבנים חיוניים. ייתכן שיהיה צורך בהסרה זהירה של רקמה החוסמת את שדה הניתוח כדי לשפר את ההדמיה, במיוחד בבעלי חיים מבוגרים. ניתן להשתמש בגישה רוחבית גם כדי לשפר את הגישה לעצב הראייה. עם זאת, דיסקציה לרוחב מסתכנת בנזק למבנים נוספים כולל העצב הטריגמינלי, מעורבת יותר, ועלולה להציב אתגרים משלה להכוונת מכשור להזרקות.

מגבלה אפשרית של שיטה זו היא חוסר היכולת לתפעל ישירות את עצב הראייה ולדמיין לחלוטין את כל החתך. לכן, קיימת אפשרות של חתך לא שלם. עם זאת, ראינו כי אישור חזותי של הפרדת קצוות העצבים במהלך שלב 5.8 הוא אינדיקטור אמין לחתך מוצלח ושלם. אם קצות העצבים לא מצליחים להיפרד, מיקום מחדש של פיפטת ההזרקה או הגדלת לחץ ההזרקה ב-50% אמור לספק כוח מספיק כדי לחצות את העצב לחלוטין.

ביחס לשיטות הקיימות, גישה זו שומרת על שלמות מעטפת עצב הראייה. בשמירה על שלמות מעטפת עצב הראייה, קצות עצב הראייה המועבר אינם חשופים לסביבת המסלול ולמערכת החיסון ההיקפית, ובכך מגבילים את החשיפה לגורמים חיסוניים שעלולים להשפיע על תגובות RGC. בנוסף, שמירה על שלמות מעטפת עצב הראייה תוך מעבר עצב הראייה יוצרת מרחב פיזי סגור התחום על ידי קצות עצב הראייה ומעטפת עצב הראייה. ניתן להשיג אספקה מקומית של גורמים, תאים או פולימרים נוירוטרופיים לתא האקסונלי של ה-RGCs הפגועים על ידי הזרקה לחלל החדש שנוצר. ¹⁴ לחלופין, ניתן להעריך את התחדשות אקסון RGC במודל חתך על ידי מתן אפשרות לקצוות עצב הראייה העוברים אנסטומוזה ללא צורך בטכניקות מיקרו-כירורגיות מאתגרות.

היישומים של שיטה זו כוללים הערכה של התא האקסונלי הפגוע RGC עם התערבויות ספציפיות לאקסון כדי לזהות מסלולים האחראים לניוון אקסונלי ולמנוע אובדן אקסונלי בעקבות פגיעה בחתך. יתר על כן, שיטה זו הופכת מחקרים על התחדשות אקסונלית של RGC במודל חתך לנגישים לקהילת המחקר הרחבה יותר על ידי ביטול הצורך בהליכי אנסטומוזה של עצב הראייה הקשים מבחינה טכנית. ניתן להעריך התערבויות שמטרתן לקדם התחדשות אקסון RGC באמצעות מודל פציעה חמור זה ולספק תוצאות עקביות וניתנות לשחזור ללא חשש לאקסונים חסוכים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Polyglactin suture	Ethicon	J315H
9-0 Polypropylene suture	Ethicon	1754G
Acepromazine	Butler	003845	0.5-4 mg/kg Stock Concentration: 10 mg/mL Final Concentration: 0.25 mg/mL
Ampicillin	Sandoz	0781-3404-85	80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/mL
Anesthesia System	VetEquip	901806
Animal incubator	Precision Incubators	Chick Chalet II
Banamine	Schering-Plough	0061-0851-03	2.5-5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/mL Final Concentration: 0.5 mg/mL
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150F-4
Colibri forceps	Katena	K5-1500
Dumont #5/45 forceps	Fine Science Tools	11251-35
Heat therapy pump	Kent Scientific	HTP-1500
Isoflurane	Covetrus	29404
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz	RS-7440
Ketamine	Putney	26637-411-01	40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 25 mg/mL
Microinjection system (Picospritzer II)	General Valve, Inc
Microliter syringe 5 µL	Hamilton	88000
Micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-77 Brown-Flaming
Neomycin/Polymyxin B sulfates/Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	Bausch + Lomb
PBS	Millipore	BSS-1005-B
Povidone-iodine	Healthpets	BET16OZ
Proparacaine hydrochloride 0.5%	Bausch + Lomb
Ringers	Abbott	04860-04-10	2-3 mL/injection
Stereotaxic Frame	Kopf
Surgical Microscope	Zeiss
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09
Xylazine	Lloyd	0410	2.5-8 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/mL Final Concentration: 5.8 mg/mL