הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי

Summary

אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.

Abstract

זיהומים חיידקיים תוך עיניים מהווים סכנה לחזון. חוקרים משתמשים במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את הגורמים המארחים והחיידקיים ואת מסלולי התגובה החיסונית הקשורים לזיהום כדי לזהות מטרות טיפוליות קיימא ולבדוק תרופות למניעת עיוורון. טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית משמשת להזרקת אורגניזמים, סמים או חומרים אחרים ישירות לחלל הירך בחלק האחורי של העין. כאן, הדגמנו טכניקת הזרקה זו כדי ליזום זיהום בעין העכבר ואת הטכניקה של כימות חיידקים תוך עיניים. Bacillus cereus גדל במדיה נוזלית עירוי לב המוח במשך 18 שעות ו resuspended לריכוז 100 מושבה להרכיב יחידות (CFU)/0.5 μL. עכבר C57BL/6J היה הרדמה באמצעות שילוב של קטמין וקסילאזין. באמצעות מיקרו-מיינר פיקוליטר ומחטי נימי זכוכית, הוזרק 0.5 מיקרו-ל' של ההשעיה של בצילוס אל תוך זיבת האמצע של עין העכבר. עין הבקרה ההפוך הוזרקה עם מדיה סטרילית (שליטה כירורגית) או לא הוזרקה (שליטה מוחלטת). ב 10 שעות לאחר זיהום, עכברים היו המתת דם, ועיניים נקצרו באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית והוכנסו לצינור המכיל PBS סטרילי μL 400 ו 1 מ"מ חטוזי זכוכית סטרילית. עבור ELISAs או מיאלופרוקסידאז, מעכב פרוטאינאז נוסף לצינורות. עבור חילוץ RNA, מאגר התיזה המתאים נוסף. העיניים היו הומוגניות ב homogenizer רקמות במשך 1-2 דקות. הומוג'נים דוללים באופן סדרתי פי 10 ב-PBS ומעקב מדולל על צלחות אגר. שאר ההומוגנים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות נוספות. צלחות היו דגירה במשך 24 שעות CFU לכל עין היה לכמת. טכניקות אלה לגרום זיהומים לשחזור בעיני העכבר להקל על כימות של חיידקים קיימא, התגובה החיסונית המארחת, ו omics של ביטוי גנים מארח חיידקי.

Introduction

אנדופתלמיטיס בקטריאלי הוא זיהום הרסני שגורם לדלקת, ואם לא מטופלים כראוי, יכול לגרום לאובדן ראייה או עיוורון. אנדופתלמיטיס נובעת כניסת חיידקים לתוך הפנים של^{העין 1,2,3,4,5}. פעם אחת בעין, חיידקים לשכפל, לייצר רעלים וגורמים מזיקים אחרים, והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאי רשתית עדינים ורקמות. נזק עיני יכול להיגרם גם על ידי דלקת, עקב הפעלת מסלולים דלקתיים המוביל זרם תאים דלקתיים לתוך^{הפנים של העין 1,5,6}. אנדופתלמיטיס יכול להתרחש לאחר ניתוח תוך עיני (לאחר הניתוח), פציעה חודרת לעין (פוסט טראומטית), או מהתפשטות גרורתית של חיידקים לתוך העין מאתר אנטומי אחר (אנדוגני)^7,8,9,10. הטיפולים בדלקת אנדופתלמית חיידקית כוללים אנטיביוטיקה, תרופות אנטי דלקתיות,^{או התערבות כירורגית 3,4,11}. אפילו עם טיפולים אלה, ראייה או העין עצמה עלולה ללכת לאיבוד. הפרוגנוזה החזותית לאחר אנדופתלמיטיס חיידקית משתנה בדרך כלל בהתאם ליעילות הטיפול, חדות הראייה במצגת, ואת הארסיות של האורגניזם המדביק.

בצילוס cereus (B. cereus) הוא אחד הפתוגנים החיידקיים העיקריים הגורמים אנדופתלמיטיס פוסט^{טראומטית 7,12}. רוב המקרים B. cereus אנדופתלמיטיס יש כמובן מהיר, אשר יכול לגרום לעיוורון בתוך כמה ימים. סימני ההיכר של B. cereus endophthalmitis כוללים דלקת תוך עינית המתפתחת במהירות, כאבי עיניים, אובדן מהיר של חדות ראייה, וחום. B. cereus גדל במהירות בעין לעומת חיידקים אחרים אשר בדרך כלל לגרום^{לדלקות עיניים 2,4,12} ויש לו גורמי ארסיות רבים. לכן, החלון להתערבות טיפולית^{מוצלחת הוא קצר יחסית 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25}. טיפולים בזיהום זה הם בדרך כלל מוצלחים בטיפול אנדופתלמיטיס הנגרמת על ידי פתוגנים פחות ארסיים אחרים, אבל B. cereus endophthalmitis בדרך כלל תוצאות יותר מ 70% מהחולים הסובלים מאובדן ראייה משמעותי. כ -50% מהחולים האלה עוברים סילוק או חינוך של העין הנגועה^7,16,22,23. האופי ההרסני והמהר של B. cereus endophthalmitis דורש טיפול מיידי ונכון. ההתקדמות האחרונה בהבחנה המנגנונים הבסיסיים של התפתחות המחלה זיהו יעדים פוטנציאליים^{להתערבות 19,26,27}. מודלים ניסיוניים של העכבר של B. cereus אנדופתלמיטיס ממשיכים להיות שימושיים בהבחנה במנגנונים של זיהום ובדיקת טיפולים פוטנציאליים שעשויים למנוע אובדן ראייה.

זיהום תוך עיני ניסיוני של עכברים עם B. cereus כבר מודל אינסטרומנטלי להבנת גורמים חיידקיים ומארח, כמו גם האינטראקציות שלהם, במהלך אנדופתלמיטיס²⁸. מודל זה מחקה אירוע פוסט-טראומטי או פוסט-אופרטיבי, שבו חיידקים מוחכנסים לעין במהלך פציעה. מודל זה ניתן לשחזור רב והיה שימושי לבדיקת טיפולים ניסיוניים ולספק נתונים לשיפורים בסטנדרט הטיפול^1,6,19,29,30. כמו מודלים רבים אחרים של זיהום, מודל זה מאפשר שליטה עצמאית בפרמטרים רבים של זיהום ומאפשר בדיקה יעילה ובלתי ניתנת לשחזור של תוצאות הזיהום. מחקרים במודל דומה בארנבים בעשורים האחרונים בחנו את ההשפעות של גורמי ארסיות B. cereus ^{בעין 2,4,13,14,31}. על ידי הזרקת B. cereus מוטציה זנים חסרים גורמים בודדים או ארסיים מרובים, התרומה של גורמים אלה ארסיות לחומרת המחלה ניתן למדוד על ידי תוצאות כגון ריכוז של חיידקים בשעות שונות של postinfection או^{אובדן תפקוד חזותי 13,14,27,31,32}. בנוסף, נבדקו גורמים מארחים במודל זה על ידי להדביק זני עכבר^{נוקאאוט חסרים גורמי מארח דלקתיים ספציפיים 26,29,33,34,35}. המודל שימושי גם לבדיקת טיפולים פוטנציאליים למחלה זו על ידי הזרקת תרכובות חדשניות לתוך העין לאחר^{זיהום 30,36}. בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט הכולל הדבקת עין העכבר עם B. cereus, קצירת העין לאחר זיהום, כימות עומס חיידקי תוך עיני, ושמירה על דגימות כדי לסמן פרמטרים נוספים של חומרת המחלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ובהצהרה של האגודה לחקר הראייה והרופא לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (מספרי פרוטוקול 15-103, 18-043 ו-18-087).

1. מחטי זכוכית סטריליות

1. הפעל את מושך פיפטה מחט.
2. כוונן את ידית התנור עד שהצג יציג 12.6.
3. פתחו את הדלת והאכילו ידנית את צינור נימי 5 μL דרך המהדק העליון ואת נימי התנור עד שחצי הצינורית משתרעת מתחת לתנור (איור 1A).
4. ודא כי צינור נימי הוא חריץ "V" במהדק העליון. הדק את המהדק העליון.
5. כאשר המהדק התחתון פתוח, כוונן ידנית את השקופית האנכית למעלה עד שהמהדק התחתון יגיע לקצה העליון שלו. ודא כי הצינור הוא חריץ "V" במהדק התחתון. הדק את המהדק התחתון.
6. סגור את הדלת ותאשר שהאור 'מוכן' דום. לחץ על לחצן התחל כדי ליזום את רצף התנור והממשוך (איור 1B).
7. ודא שהתנור נכבה באופן אוטומטי לאחר שהחום וכוח המשיכה מושכים את צינור נימי זה מזה (איור 1C), והמגלשה נעה כלפי מטה.
8. פתח את הדלת. תוך החזקת החלק העליון של צינור נימי, לזמן את המהדק העליון. מוציאים את צינור נימי העליון ומניחים אותו בצד.
9. החזק את צינור נימי במגלשה התחתונה ו untighten המהדק התחתון. מוציאים את צינור נימי התחתון ומניחים אותו בצד.
10. השתמש beveler microelectrode עם 0.05 מיקרומטר אלומינה לוח שחיקה שוחקים כדי שפשופ צינור נימי משך כדי ליצור את מחטי ההזרקה.
11. פיפטה מספיק מים על צלחת השחיקה כדי לכסות את פני השטח (איור 1D).
12. הפעל את הבולבול כך שיתחיל להסתובב במהירות של 60 סל"ד. מניחים את צינור נימי משך לתוך מהדק פיפטה בגרוב "V". הדקו את המהדק והתאיימו את זווית המהדק ל-30°.
13. התאימו את קצה הקצה המחודד של הצינור נימי במרחק של כשני שלישים ממרכז הסיבוב של צלחת השחיקה.
14. מנמיך את צינור נימי מהודק על ידי התאמת ידית הבקרה גס בחלק העליון של המניפולטור. ממשיכים להנמיך את צינור נימי עד קצה צינור נימי משתרע מתחת לפני השטח של המים ומגע פני השטח שוחקים של צלחת שחיקה.
15. נטר את התקדמות המיתר באמצעות המיקרוסקופ המחובר לשומר. לאחר 5 דקות, להתאים את השליטה בסדר כדי להעלות את מחט הזכוכית מצלחת השחזה.
16. הסר את מחט הזכוכית והצב אותה תחת הגדלה של פי 10 כדי לבדוק את קצה צינור נימי (איור 1E, F).
17. כדי להבטיח כי אין חסימות, להכניס את מחט הזכוכית לתוך מחזיק פיפטה על מזרק ולדחוף אוויר לתוך צינור 1 מ"ל של 99% אתנול. אם בועות אוויר טופס בקצה המחט, המחט אין חסימות והוא יכול לשמש microinjection. תהליך זה גם מבטיח את הסטריליות של מחטי הזכוכית.
18. צינור נימי אחד יכול להחזיק עד 5 μL נוזל. סמן את הצינור נימי לתוך 10 חלקים כדי לחשב את המרחקים על המחט כדי לסמן עבור 0.5 כרכים μL. סמן סולם עם מרחק זה המחזיק 0.5 μL להכנה עתידית. עבור מחט 5 μL, מרחקים של 0.7 מ"מ זה מזה להשוות 0.5 μL (איור 1G).

2. תרבות בצילוס צריוס

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
2. מלאי מקפיא פסים של B. cereus ATCC 14579 לבידוד מושבה אחת על צלחת אגר דם כבשים 5% ודגירה לילה ב 37 °C(איור 2A).
3. פיפטה 5 מ"ל של עירוי לב המוח סטרילי (BHI) מרק לתוך צינור 10 מ"ל סטרילי כובע הצמד (איור 2B). באמצעות לולאה סטרילית או מחט, לבחור מושבה אחת של B. cereus ATCC 14579 מצלחת אגר לחסן את BHI נוזלי.
4. וורטקס הדגימה לזמן קצר. מניחים את צינור כובע ההצמדה באינקובטור מסתובב. הגדר את הטמפרטורה ב 37 °C (69 °F) ומהירות ב 200 סל"ד. לאחר 18 שעות, הסר את התרבות מהחממה (איור 2B).

3. דילול בקטריאלי להזרקה תוך-ואטראלית

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
2. לחשב את הנפח של תרבות B. cereus לילה להוסיף 10 מ"ל של BHI טרי כדי להשיג 200 מושבה להרכיב יחידות למיקרוליטר (CFU / μL). לדוגמה, תרבות לילה של B. cereus ב BHI משכפלת כ 2 x 10⁸ CFU / מ"ל, אשר לאחר מכן ניתן לדלל ל 200 CFU / μL על ידי צינורות 10 μL של תרבות לילה לתוך 10 מ"ל של BHI טרי.
3. Pipette 1 מ"ל של התרבות הטרייה המדוללת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. יש לשמור את הצינור על הקרח עד להזרקה תוך-ואטראלית. בצע את הזרקת תוך ויטראלי בתוך 60 דקות של דילול התרבות החיידקית.

4. הזרקת עכבר תוך-ויטריאלי

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
2. הכן את אתר ההליך על ידי הצבת משטחים רפואיים על שולחן הניתוחים.
3. הפעל את microinjector ולפתוח את שסתום הגז על מיכל האוויר הדחוס מחובר microinjector. התאימו את ווסת המיכל עד להספקת הגז כ-60 psi.
4. במיקרו-מיינר, הקש Mode עד שהמסך מציג את איזון. הקש על איזון והצב את עכבר המחשב על שולחן ההפעלה. חבר את מחזיק פיפטה נירוסטה צינורות מחובר 'מילוי / פלט' של המזרק. הצינור הזה תמיד מחובר למזרק.
5. הכנס את מחט נימי לקצה השני של מחזיק פיפטה על ידי בורג חזק מחבר מחזיק פיפטה סביב המחט.
6. הפעל את המיקרוסקופ עיניים והדליק את האור שלו בעוצמה של 50%. התאם את המיקרוסקופ על אתר ההליך בטבלת ההפעלה והתאם את המיקרוסקופ למוקד הרצוי.
7. לפני תחילת ההליך, לאשר כי העכבר הוא הרדמה נאותה על ידי בדיקת רפלקס נסיגת הדוושה. הקפד לפעול בהתאם לפרוטוקול המאושר של IACUC להרדמת.
8. מניחים את העכבר הרדמה על החלק התחתון הרפואי עם אפו הצביע ימינה נשען על הצד השמאלי שלה.
9. הביטו בעין ימין של העכבר דרך המיקרוסקופ העיניים ופתחו את העפעפיים על ידי פתיחת מלקחיים של פעולה הפוכה משני צדי העין כדי לחשוף את אתר ההזרקה (איור 3C).
10. מלאו את מחט נימי בדילול של 200 CFU/μL על ידי לחיצה שמאלית על משטח העכבר המחובר למיקרו-מיינר (איור 3D).
11. אבטחו את ראש החיה ביד שמאל והמקם את קצה המחט בלימבוס של העין. עם המחט במצב משופע למעלה ובזווית של 45 מעלות, לנקב את עין העכבר, אבל להבטיח כי רק את הקצה החד של המחט (~ 0.5 מ"מ) מוכנס בעת ההזרקה.
12. לאחר קצה המחט מוכנס, להזיז את היד השמאלית מן הראש העכבר אל כרית העכבר ולחץ ימינה על כרית העכבר כדי להזריק 0.5 μL של דילול B. cereus. כדי למנוע דליפה, השאירו את קצה המחט בתוך עין העכבר למשך 2.3 שניות לפני ההסרה (איור 3E)^{1,19,26,27,32,34,36,37,38}.
13. שחררו את המדפים והכנסו את העכבר לכלוב שיושב על משטח התחממות. לפקח על עכברים אלה עד שהם התאוששו מהרדמה (איור 3F).
14. ברגע שהעכברים יתאוששו מההרדמת, החזירו את הכלוב למדף הנכון שלו. אם העכברים יהיו נתונים לניתוח תפקוד רשתית על ידי אלקטרורטינוגרפיה, יש להחזיר כלובים לחדר חשוך להסתגלות כהה נאותה.

5. הכנת צינור קציר

1. מניחים 1 מ"מ בחנוזי זכוכית סטריליים לתוך צינורות כובע בורג 1.5 מ"ל.
2. לעקר את הצינורות האלה במקלעת אוטומטית על סביבה יבשה. תן את הצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. הוסף 10 מ"ל של 1x מלוחים סטריליים פוספט מאגר (PBS) לצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל.
4. הוסף 1 טבליה של טבלית קוקטייל מעכבי פרוטאז לתוך הצינור. מערבבים במערבולת^{19,27,29,34,35}.
5. פיפטה 400 μL של 1x פוספט מאגר מלוחים (PBS) המכיל מעכב פרוטאז לתוך כל צינור קציר autoclaved. תייג את הצינורות ומקום על קרח. (איור4A).

6. קצירת העיניים

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
2. המתת לחץ הפוך את העכבר על ידי שאיפת CO_2. השתמש בשיטה משנית כדי לאשר המתת חסד.
3. החזק את ראש העכבר המתת דם מאובטח ולפתוח את מדפים קצה בסדר משני צדי העין הנגועה. לדחוף כלפי מטה לכיוון הראש כדי להניע את העין. ברגע המלקחיים הם מאחורי כדור הארץ של העין, לסחוט את המלקחיים יחד. משוך מעצורים מהראש כדי לנתק את גלגל העין (איור 4B).
4. מיד מניחים את גלגל העין לתוך צינור קציר שכותרתו. מניחים צינורות על קרח לא יותר מ-60 דקות (איור 4C).

7. ספירת חיידקים תוך עינית

1. בצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תנאי Biosafety רמה 2.
2. ודאו שכל צינורות הקציר סגורים היטב ומאוזנים בזמן שהם נמצאים בהומוגניזציה של הרקמה (איור 5A). הפעל את homogenizer רקמה במשך 1 דקות כדי homogenize את הדגימות. חכה 30 שניות, ואז תדליק עוד דקה. מניחים צינורות על קרח (איור 5B,C).
3. לדלל באופן סדרתי כל מדגם 10-פי על ידי העברה רציפה 20 μL של הומוגנטי לתוך 180 μL של PBS סטרילי 1x. מדללים עד לקבלת פקטור של^10-7 (איור 5D).
4. תייג כל שורה של צלחת BHI מרובעת וחמה עם גורמי הדילול הנכונים. העבר 10 μL של כל דילול ברציפות לצלחת BHI העליון כי הוא מוטה כ 45°. תן לדגימה לרוץ עד שהיא כמעט מגיעה לתחתית הצלחת, ולאחר מכן הנח את הלוח שטוח (איור 5E)³⁹.
5. כאשר המדגם נספג לתוך אגר BHI, להעביר את הצלחת אינקובטור 37 °C (69 °F). מושבות צריך להתחיל להיות גלוי 8 שעות לאחר שהוצב באינקובטור.
6. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור לפני שצמיחת מושבות B. cereus מפריעה לזיהוי מושבות בודדות (איור 5F).
7. לייצוג מדויק של הריכוז המדגם, ספור את השורה שיש בה בין 10-100 מושבות. לדוגמה, שורה עם שבר דילול של^10-4 שיש לו 45 מושבות יהיה ריכוז של 4.5 x 10⁵ CFU / מ"ל.
8. כדי לחשב את המספר הכולל של חיידקים לכל עין, להכפיל את הריכוז על ידי 0.4, המייצג את נפח מיליליטר של 1x PBS המשמש הומוגניזציה העין. לדוגמה, ריכוז 4.5 x 10⁵ CFU /mL יתורגם ל- 1.8 x 10⁵ CFU B. cereus לכל עין.

8. שימור דגימות

1. מניחים דגימות הומוגניות בקופסת מקפיא מסומנת וממקמים את הקופסה הזו במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. דגימות אלה ניתן להשתמש מאוחר יותר לניתוח מתווך דלקתי על ידי ELISA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

יצירת inoculum לשחזור ודיוק של הליך הזרקת תוך ויטראלי הם צעדים מרכזיים בפיתוח מודלים של אנדופתלמיטיס מיקרוביאלית. כאן, הדגמנו את הליך ההזרקה תוך-ויטרית באמצעות גרם חיובי Bacillus cereus. הזרקנו 100 CFU/0.5 μL של B. cereus לאמצע זקיף של חמישה עכברי C57BL6. לאחר 10 שעות לאחר ההידלקות, ראינו צמיחה תוך עינית <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אפילו עם הזמינות של אנטיביוטיקה חזקה, תרופות אנטי דלקתיות, ניתוח vitrectomy, אנדופתלמיטיס חיידקי יכול לעוור את המטופל. מחקרים קליניים היו שימושיים בחקר אנדופתלמיטיס; עם זאת, מודלים ניסיוניים של אנדופתלמיטיס מספקים תוצאות מהירות לשחזור שניתן לתרגם להתקדמות ברמת הטיפול, וכתוצאה מכך תוצאה חזותי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-20 µL pipette	RANIN	L0696003G	NA
37oC Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	NA
Bacto Brain Heart Infusion	BD	90003-032	NA
Cell Microinjector	MicroData Instrument, Inc.	PM2000	NA
Fine tip forceps	Thermo Fisher Scientific	12-000-122	NA
Glass beads 1.0 mm	BioSpec	11079110	NA
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific	NB-I2400	NA
Microcapillary Pipets 5 Microliters	Kimble	71900-5	NA
Micro-Pipette Beveler	Sutter Instrument Co.	BV-10	NA
Microscope Axiostar Plus	Zeiss		NA
Microscope OPMI Lumera	Zeiss		NA
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	Model 607	NA
Multichannel pipette 30-300 µL	Biohit	15626090	NA
Multichannel pipette 5-100 µL	Biohit	9143724	NA
Needle/Pipette Puller	Kopf	730	NA
PBS	GIBCO	1897315	Molecular grade
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693159001	Molecular grade
Reverse action forceps	Katena	K5-8228	NA