השתלה תוך-שרירית של הידרוג'ל להזרקה בטעינת MSC לאחר אוטם שריר הלב במודל מורין

Summary

טיפול מבוסס תאי גזע התפתח כאסטרטגיה יעילה לתיקון רקמות לב פגועות לאחר אוטם שריר הלב. אנו מספקים יישום vivo אופטימלי להשתלת תאי גזע באמצעות הידרוג'לים ג'לטין המסוגלים להיות מקושרים אנזימטית.

Abstract

אחת הבעיות העיקריות הניצבות בפני טיפולים נוכחיים בתאי גזע לב למניעת אי ספיקת לב לאחר לידה היא שיעורי ההחזקה וההישרדות הנמוכים של תאים מושתלים בתוך שריר הלב הפגוע, המגבילים את יעילותם הטיפולית. לאחרונה, השימוש ביו-חומרים פיגומים צברה תשומת לב לשיפור ומקסום הטיפול בתאי גזע. מטרת פרוטוקול זה היא להציג טכניקה פשוטה וישירה להשתלת תאי גזע mesenchymal נגזר מח עצם (MSCs) באמצעות חומצה הידרוקסיפניל propionic להזרקה (GH) הידרוג'לים; הידרוג'לים הם חיוביים כפלטפורמת אספקת תאים עבור יישומים הנדסת רקמת לב בשל יכולתם להיות מקושרים במקום תאימות ביולוגית גבוהה. אנו מציגים שיטה פשוטה לפברק הידרוג'לים GH טעינת MSC (MSC / הידרוג'לים) ולהעריך את הישרדותם והתפשטותם בתרבות תלת מימדית (3D) במבחנה. בנוסף, אנו מדגימים טכניקה להשתלה תוך-שרירית של MSC/הידרוג'ל בעכברים, המתארת הליך כירורגי כדי לגרום לאוטם שריר הלב (MI) באמצעות קשירת עורקים כלילית קדמית שמאלית (LAD) והשתלת MSC/הידרוגלס לאחר מכן.

Introduction

טיפול בתאי גזע לב התפתח כגישה פוטנציאלית לתיקון שריר הלב והתחדשות^1,2. למרות התוצאות החיוביות האחרונות במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים, היישום של טיפול מבוסס תאי גזע לתיקון שריר הלב מוגבל עקב שימור נמוך והישרדות לקויה של תאים מוזרקים ברקמות הלב האוטמות^3,4. כתוצאה מכך, השימוש בהנדסת רקמות מבוססות תאים, כולל ביו-חומרים^{להזרקה 5}, מדבקות לב⁶, ויריעות תאים⁷, נחקר באופן אינטנסיבי כדי לשפר את שימור התא ואינטגרציה בתוך שריר הלב המארח.

בין הגישות הפוטנציאליות השונות לתיקון רקמת לב bioengineered, הידרוג'לים להזרקה בשילוב עם סוגי תאים מתאימים, כגון תאי גזע mesenchymal (MSCs), תאי גזע עובריים (ESCs), ותאי גזע פלוריפוטנטי המושרה (iPSCs), הם אפשרות אטרקטיבית ביעילות לספק תאים לאזורים שריר הלב^8,9. ג'לטין, פולימר טבעי ידוע, יכול לשמש כמטריצה להזרקה בשל תאימות ביולוגית גדולה שלה, מתכלות ניכרת, אימונוגניות מופחתת בהשוואה למגוון רחב של ביו-חומרים המשמשים ביישומים ביו-רפואיים. למרות פלטפורמות להזרקה מבוססי ג'לטין יש פוטנציאל גדול, הישימות שלהם vivo נשאר מוגבל מבוסס על נוקשות מכנית נמוכה שלהם השפלה קלה בסביבה הפיזיולוגית.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, עיצוב חדשני ופשוט של הידרוג'לים מבוססי ג'לטין המורכבים מחומצה הידרוקסיפניל פרופיונית הוצע עבור יישומי vivo. ג'לטין-hydroxyphenyl propionic חומצה (GH) מצומדים יכול להיות מקושר באתרו בנוכחות אנזים, חזרת peroxidase (HRP), ולאחר מכן לתמצת תרופות שונות, biomolecules, או תאים בתוך הידרוג'ל, מה שמרמז על פוטנציאל גדול ביישומים הנדסת^{רקמות 10,11,12,13,14}. בנוסף, חקרנו לאחרונה את ההשפעות הטיפוליות של הידרוג'לים GH המכילים MSCs encapsulated והדגים את השימוש בהם תיקון לב מוצלח והתחדשות לאחר MI במודל מורין¹⁵. בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה פשוטה עבור אנקפסולציה במבחנה תלת מימדית (3D) התפשטות של MSCs בתוך הידרוג'לים GH. אנו גם מציגים הליך כירורגי שנועד ליצור מודל MI מורין באמצעות קשירת עורקים כליליים והשתלה תוך שרירית של הידרוג'ל GH טעינת MSC לתוך הלב האוטם.

Protocol

כל הליכי המחקר בבעלי חיים ניתנו בהתאם לחוק רווחת בעלי חיים במעבדה, המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה וההנחיות והמדיניות לניסויים במכרסמים שסופקו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) בבית הספר לרפואה של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה.

1. הכנת MSCs והידרוגלים ג'לטין להזרקה

1. תרבות MSCs בצלחת תרבות 100 מ"מ ב 37 °C (77 °F) ו 5% CO₂. כאשר צמיחת MSCs מגיעה למפגש של 80%, שטפו את המנה פעמיים עם DPBS והוסיפו 1 מ"ל של טריפסין-תחליף ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
   הערה: MSCs היו מבודדים ממח העצם מורין בעקבות הליכים קונבנציונליים¹⁶, בתרבית בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו 1% אנטיביוטיקה-פתרון אנטי-מיקוטי, ושימש בין המעבר 7 \u20129 למחקר זה.
2. הוסף 9 מ"ל של מדיום תרבות וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 3 דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant וכתוצאה מכך, resuspend התאים ב 1 מ"ל של PBS, ולשמור על השעיית התא על הקרח.
3. לדלל 10 μL של השעיית תאים עם 10 μL של כחול Trypan ולקבל את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי.
4. התחדש והעבר MSCs לצינור של 1 מ"ל בצפיפות של 1 x 10⁷ תאים/מ"ל.
5. הכן 6.25 wt% של פתרון GH מצוות PBS ונפרד לתוך 2 בקבוקונים. לאחר מכן, לערבב את פתרונות GH עם או 6 מיקרוגרם / מ"ל של HRP (פתרון GH A) או 0.07 wt% של H₂O₂ (פתרון GH B).
   הערה: הכן ג'לטין-הידרוקסיפניל פרופיוניל (GH) מצוות על פי פרוטוקולים שפורסמו^12,15.
   1. שמור על יחס נפחי של 9:1 של פתרון GH להצטרף HRP (פתרון GH A) ו GH להצטרף פתרון H₂O₂ (פתרון GH B), בהתאמה.
6. לפני ערבוב MSCs עם פתרון GH A, בקצרה צנטריפוגה השעיית התא ב 1,000 x g בזהירות לשאוף את supernatant וכתוצאה מכך. לאחר מכן, לערבב את גלולה המכילה MSCs עם פתרון GH A.

2. במקום MSC-טעינה ותרבות חוץ מימדית במבחנה

1. טען פתרון GH A (המכיל MSCs) ופתרון GH B לשני צדי המזרק הכפול. צלחת 300 μL של פתרונות GH משולבים עם MSCs בצפיפות סופית של 5 x 10⁶ תאים / מ"ל על שקופית תא שמונה באר.
2. לאחר היווצרות הידרוג'ל situ ואנקפסולציה MSC הבאים באמצעות קישור צולב אנזימטי, להוסיף 700 μL של DMEM המכיל 10% FBS ו 1% פתרון אנטיביוטי אנטי מיקוטי.
3. הדגירה את השקופית ב 37 °C (77 °F) ו 5% CO₂ ולהחליף את מדיום התרבות כל 2 \u20123 ימים.

3. אישור של התפשטות במבחנה והישרדות של MSCs בתוך הידרוג'לים GH

1. כדי לקבוע את הכדאיות של MSCs מתורבתים 3D בתוך הידרוג'לים GH, להשתמש חי / מת תא מכתים מבחני לאחר זמן הדגירה שנקבע מראש.
2. לאחר הדגירה של MSCs encapsulated ב הידרוג'לים GH במשך 3, 5, 7 או 14 ימים, לשאוף את המדיום ולשטוף את הבאר פעמיים עם PBS.
3. הכן פתרון מכתים המכיל 5 μL של calcein AM ו 20 μL של ethidium homodimer-1 (EthD-1) ב 10 מ"ל של DPBS.
4. מוסיפים 200 μL של פתרון הכתם לבאר ודגר במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
5. שאפו את פתרון הכתמים ושטפו את הבאר פעמיים עם PBS.
6. בזהירות להפריד את התא מן המגלשה ומניחים כיסוי מלא מעל הידרוג'לים GH. השתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין את מידת ההתפשטות והשינויים המורפולוגיים של MSCs האנקפסולציה.
   הערה: תמונות פלואורסצנטיות נרכשו תחת הגדלה של פי 200 ותמונות באורכי הגל של עירור/פליטה של 470/540 ננומטר עבור calcein ו- 516/607 ננומטר עבור EthD-1.

4. אינדוקציה של אוטם שריר הלב בעכברים

1. הרדמה 7 שבועות זכר C57BL/6 עכברים (20\u201222 גרם) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של זולטיל (30 מ"ג/ק"ג) ורומפון (10 מ"ג/ק"ג) מלוחים.
2. לפני הניתוח, depilate את חזה העכבר באמצעות קרם להסרת שיער לעקר את העור עם יוד.
3. מניחים את העכבר על שולחן הפעלה וצנררים על ידי החדרת קטטר לתוך קנה הנשימה כדי לספק חמצן משלימה באמצעות אוורור מכני.
4. חותכים בעדינות דרך העור באמצעות מספריים כירורגיים ולאחר מכן לחדור את השרירים הבין צלעיים על ידי מספריים מיקרו. הפרד את הצלעות השמאליות השנייה והשלישית באמצעות תפר משי 5-0 כדי לשמור על חלל חזה פתוח.
5. בזהירות ligate השמאלית ירידה (LAD) עורק כלילי באמצעות מחזיק מחט עם 8-0 תפר פוליפרופילן לחתוך את התפר באמצעות electrocautery.
6. שימו לב לשינוי צבע מיידי בקיר החדר השמאלי.

5. השתלה תוך-שרירית של הידרוג'לים GH טעינת MSC

1. לאחר גרימת אוטם שריר הלב על ידי קשירת LAD, להזריק 10 μL של פתרונות GH טעינת MSC לשתי נקודות שונות באזור הגבול אוטם (סה"כ: 2 x 10⁵ MSCs/20 μL) באמצעות מזרק כפול מצויד מחט 26G.
   1. בהתאם לאותו הליך המתואר בשלב 1, הכן והעבר פתרונות GH נטענים של MSC למזרק כפול.
      הערה: כדי להעריך את החריטה של הידרוג'לים GH טעינת MSC בתוך האזור האוטם, MSCs ו GH מצומדים היו מראש שכותרתו עם PHK26 ו פלואורסצנטין isothiocyanate (FITC), בהתאמה.
2. לשחזר את חלל החזה שנפתח ולסגור את השרירים והעור באמצעות 5-0 תפרים.
   הערה: לפני סגירת החזה, יש להסיר את האוויר באמצעות מזרק קטטר.
3. הסר את צינור קנה הנשימה ומניחים את העכבר בכלוב תחת מנורת אינפרא אדום במהלך ההתאוששות.
4. עבור משככי כאבים לאחר הניתוח, לנהל זריקות קטופרופן תת עורי (5 מ"ג / קילוגרם ליום) עבור מינימום של 72 שעות. כל העכברים צריכים להיות במעקב צמוד לזמן מתאים כדי להבטיח התאוששות נאותה לאחר ניתוחים, כמו גם טיפול בכאב נאות.

6. אקו לב

1. ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, בתחילה להרדים את העכבר עם 5% isoflurane ולאחר מכן להתאים את ריכוז isoflurane ל 1%.
2. Depilate את החזה באמצעות קרם להסרת שיער ומניחים את העכבר על כרית חימום. החל ג'ל מתמר אולטרסאונד על החזה.
3. לרכוש תצוגות ציר קצר parasternal דו מימדי ולהקליט מעקבים במצב M ברמה של שריר הפפילרי.
   הערה: מקם מתמר מערך ליניארי (7\u201215 MHz) בקו הפאראסטרנלי השמאלי והצג את המבנים האנטומיים.
4. מדוד קווים מתאימים עבור LVAW, LVID ו- LVPW כדי לקבל עובי דופן לב, ממד תא וקיצור שברים.
   הערה: השווה את תפקוד הלב כולל שבר הפליטה (EF), קיצור שברים (FS) ונפח סוף-סיסטולי (ESV) ברמת שריר הפפילרי כדי להבטיח הערכה נאותה באותו מיקום אנטומי.

7. הערכה היסטולוגית

1. בזמן שנקבע מראש לאחר ההשתלה של הידרוג'לים GH טעינת MSC לתוך הלב האוטם, המתת העכבר בתא CO₂ ולאסוף את הלב לניתוח היסטולוגי¹⁵.
2. עבור כתמי המטוקסילין ואאוסין (H&E) והטריכרום (MT) של מאסון, תקן את רקמות הלב המנותחות ב- 4% paraformaldehyde (PFA) והטמע בפרפין. לאחר מכן, לחתוך בלוקים לב מוטבע פרפין לתוך 4 קטעים טוריים μm באמצעות microtome ולהכתים את החלקים עם כתם MT על פי פרוטוקולים סטנדרטיים¹⁷.
3. רכוש תמונות בסורק שקופיות בהגדלה של פי 20 וחשב את הגודל האוטם של קבוצות הטיפול.
   גודל אוטם (%) = היקף אוטם כולל / היקף LV כולל x 100
4. חשב את שני ההיקפים לפי מדידת אורך קו אמצע. עבור היקפי קו האמצע של LV, מדוד את אורכי קו האמצע בין המשטחים האנדוקרדיאליים והאפיקרדיאליים. עבור היקפים אוטם קו האמצע, למדוד את אורכי האוטם כולל יותר מ 50 % של עובי שלם של שריר הלב¹⁸.
   הערה: כל ניתוחי התמונות בוצעו באמצעות תוכנת ImageJ.
5. למדוד את עובי הקיר של הצלקת ברמות שריר הפפילרי.
6. חשב את השבר של אזור הקולגן.
   אזור קולגן (%) = שטח כולל של אזור פיברוזיס/מיוציטים ביניים x 100

תוצאות

כדי לספק ביעילות MSCs ל שריר הלב האוטם, נעשה שימוש בטעינת MSC בהידרוג'לים הניתנים לחיבור צולב של situ המתוארים באיור 1 בפרוטוקול זה. לפני השתלת vivo, התפשטות והישרדות של MSCs ב הידרוג'לים GH אושרו על ידי 3D במבחנה חי / תא מת מכתים assay (לחיות: ירוק; מת: אדום). כפי שמוצג באיור 2,...

Discussion

הידרוג'לים GH להזרקה יש פוטנציאל גדול עבור יישומי in vivo בגלל היכולת שלהם לשלב הומוגנית סוכנים טיפוליים מגוונים באתרו. יתר על כן, התכונות הפיזיות והביוכימיות שלהם ניתן לתפעל בקלות בהתבסס על דרישות תלויות מחלה. במובן זה, הידרוג'לים להזרקה הוצעו כדי להתמודד עם המגבלות העיקריות בטיפול הנוכחי בת...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 % paraformaldehyde (PFA)	Intron	IBS-BP031-2
5-0 silk suture	AILEE	SK534
8-0 polypropylene suture	ETHICON	M8732H
8-well chamber slide	Nunc LAB-TEK	154534
Angiocath Plus (22GA) catheter	BD Angiocath Plus	REF382423
Antibiotic-antimyocotic	Gibco	15240-062
Centrifuge	GYROGEN	1582MGR
Confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Cover slipe	MARIENFELD	101242
Deluxe High Temperature Cautery kit	Bovie	QTY1
DMEM	Gibco	11995-065
DPBS	Gibco	14040-133
Dual-syringe
EOSIN	SIGMA-ALDRICH	HT110116
Ethanol	EMSURE	K49350783 739
FBS	Gibco	16000-044
Fechtner conjunctiva forceps titanium	WORLD PRECISISON INSTRUMENTS	WP1820
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC)	SIGMA-ALDRICH	F7250
Forcep	HEBU	HB0458
Hair removal cream	Ildong Pharmaceutical
Heating pad	Stoelting	50300	Homeothermic Blanket System
		50301	Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm)
Hematoxylin	SIGMA-ALDRICH	HHS80
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg)	SIGMA-ALDRICH	P8375
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O)	SIGMA-ALDRICH	216763
Iodine	Green Pharmaceutical
LIVE/DEAD cell staining kit	Thermo Fisher	R37601
Mechanical ventilator	Harvard Apparatus
Micro centrifuge	HANIL	Micro 12
Micro needle holder	KASCO	37-1452
Micro scissor	HEBU	HB7381
Microscope	OLYMPUS	SZ61
MT staining kit	SIGMA-ALDRICH	HT1079-1SET	Weigert’s iron hematoxylin solution
		HT15-1KT	Trichrome Stain (Masson) Kit
Paraffin	LK LABKOREA	H06-660-107
PBS buffer	Gibco	10010-023
PHK26 staining kit	SIGMA-ALDRICH	MINI26
Slide scanner	Leica	SCN400
Surgical scissor	HEBU	HB7454
Surgical tape	3M micopore	1530-1
Tissue cassette	Scilab Korea	Cas3003
Transducer gel	SUNGHEUNG	SH102
Trout-Barraquer needle holder curved	KASCO	50-3710c
Ultrasound system	Philips	Affiniti 50
Xylene	JUNSEI	25175-0430