מודל חסימת קנה הנשימה העוברי הטרנס-רחמי בעכברים

Summary

מודלים שונים של בעלי חיים של שבר דיאפרגמטי מולד וחסימת קנה הנשימה העוברי מציגים יתרונות וחסרונות לגבי סוגיות אתיות, עלות, קושי כירורגי, גודל, שיעורי הישרדות וזמינות של כלים גנטיים. מודל זה מספק כלי חדש כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת קנה הנשימה והלחץ המואצני המוגבר על התפתחות הריאות.

Abstract

חסימת קנה הנשימה העוברית (TO), שיטה לטיפול מבוסס, מקדמת צמיחת ריאות עוברית והישרדות בבקע דיאפרגמטי מולד חמור (CDH). בעקבות TO, שמירה על נוזל האפיתל המופרש מגבירה את הלחץ הזוהר וגורם לצמיחת ריאות. מודלים שונים של בעלי חיים הוגדרו כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של CDH ו TO. לכולם יתרונות וחסרונות משלהם כגון הקושי של הטכניקה, גודל החיה, עלות, שיעורי תמותה גבוהים, ואת הזמינות של כלים גנטיים. להלן, מודל טרנסוטריני חדשני של TO עוברי מורין מתואר. עכברים בהריון היו מורדמים, והרחם נחשף דרך לפרוטומיה בקו האמצע. קנה הנשימה של עוברים נבחרים היה קשור בתפר טרנספורמטריני יחיד שהונח מאחורי קנה הנשימה, עורק עורק ראשי אחד, ווריד עורק אחד. הסכר נסגר והורשה להתאושש. עוברים נאספו ממש לפני ההסתעפות. יחס משקל הריאה לגוף בעוברים TO היה גבוה מזה בעוברים בשליטה. מודל זה מספק לחוקרים כלי חדש כדי לחקור את ההשפעה של שניהם TO ולחץ לומינלי מוגבר על התפתחות הריאות.

Introduction

בקע דיאפרגמטי מולד (CDH) מתרחשת ב 1:2500 הריונות ותוצאות היפופלזיה ריאתי ויתר לחץ^דםריאתי יילודים 1^,2,^3,4,5,6. חסימת קנה הנשימה העוברית (TO) הוא טיפול טרום לידתי הוקמה בחולי CDH חמורים מעורבים fetoscopy בשבוע ההיריון 26-30 שבו בלון^ממוקם ממש מעל קרינה ולאחר מכן הוסר בשבוע ההיריון^32. TO זמני זה גורם לצמיחת ריאות עוברית ומשפר את ההישרדות. תסמונת חסימת High Airway מולדת היא מצב קטלני הקשור להיפרפלזיה של הריאות, אשר נתן השראה למנתחים לבצע חסימה מלאכותית של קנה הנשימה כדי לקדם את השמירה על נוזל האפיתל המופרש. חסימה זו הגבירה את הלחץ הזוהר וצמיחת ריאות המושרה⁷. עם זאת, החסימה צריכה להיות הפוכה כדי לאפשר התבגרות תא אפיתל.

מודלים שונים של בעלי חיים של CDH ו- TO - ביצית, ארנב, חולדה ועכבר - פותחו כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של CDH ו- TO. לכולם יתרונות וחסרונות משלהם כגון הקושי של הטכניקה, גודל החיה, עלות, שיעורי תמותה גבוהים, ואת הזמינות של כלים גנטיים. למרות הטכניקה הכירורגית המשמשת את מודל הביצית דומה מאוד לזה המשמש בבני אדם יכול להיות הפוך, החסרונות העיקריים של מודל זה הם על חשבון החיה, תקופת ההיריון הארוכה, ואת המספר המוגבל של ניתוחים אפשריים. לדגם הארנב תקופת הריון קצרה יותר והוא זול יותר מדגם הכבשים. עם זאת, מודל הארנב הוא בלתי הפיך^8,9. למודל המורין יש את העלות הנמוכה ביותר, את המספר הגבוה ביותר של עוברים להריון, את הגנום המאופיינת ביותר, וכלים זמינים נרחבים לניתוחים תאיים ומולקולריים. עם זאת, חיסרון מרכזי הוא חוסר ההפיכה של TO, מניעת הבנה מלאה של ההשפעה של TO. בזאת מוצגת שיטה המשלבת את כל היתרונות של הדגמים שהוזכרו לעיל ויוצרת מודל TO מכרסמים קל, בעל פוטנציאל הפיך ומינימום פולשני.

Protocol

כל הניסויים נענו למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה (NIH Publications מס' 80023, תוקן בשנת 1978). ההליך אושר בפרוטוקול IACUC #2016-0068 על ידי קרן המחקר לילדים של סינסינטי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים.

1. הכנה

1. כדי להזדווג עם עכברים מסוג פראי (WT) C57BL/6 תואמי גיל, הנח אותם באותו כלוב בשעה 18:00 .m והפרידו ביניהם בשעה 9:00 בבוקר.m למחרת.
2. כדי לקבוע את היום העוברי 0 (E0), להסתכל על תקע הנרתיק, אשר יש אזור חיצוני הומוגני מחובר לקיר הנרתיק ואזור פנימי כי הוא סיבי וכולל כמה זרעונים היוצרים גושים סבוכים מעורבב עם הסיבים של חומר התקע.
3. רשום את משקל העכברים בזמן ההזדווגות.
4. לשקול מחדש את העכברים על E10 כדי להבטיח הריון מתמשך.
5. בצע את הניתוח על E16.5 (שלב תעלות מוקדם).
6. לעקר את המכשירים כי הם הולכים לשמש במהלך הניתוח: מספריים, מחזיק מחט, מלקחיים, מלחציים, סכינים כירורגיות וידיות.
7. מחממים מראש את פלטפורמת הניתוח ל 24 מעלות צלזיוס ומכינים מלוחים חמים (24 מעלות צלזיוס) לפני הניתוח.
8. ליצור סביבה חמה להתאוששות, ולהשאיר מזון רטוב בתוך הכלוב להאכלה מוקדמת.
9. הישארו עם החיות המופעלות עד שיוכלו להאכיל את עצמם.
10. שמור את העכברים המופעלים לבד בכלובים האישיים שלהם לאחר הניתוח.

2. הרדמה

1. החל תת עורית 0.1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine על סכרים בהריון 1 שעות לפני ההליך.
2. השתמש בשאיפה של 5 מ"ל/שעה של isoflurane עבור אינדוקציה ו 2 מ"ל / שעה ברציפות במהלך ההליך להרדמה.
3. לפקח על התנועות של הסנטרים של העכברים ההרים.

3. לפרוטומיה

1. נקה את משטח הבטן עם אלכוהול ו povidone-יוד. שמור על תנאים סטריליים לאורך כל המבצע.
2. בצע חתך אנכי לפרוטומיה של סכרים בהריון. חותכים את כל השכבות בנפרד.
3. זהה קרני רחם מכל צד.
4. קבע את העוברים המועמדים לניתוח.
   הערה: אין לנתח את העוברים הקרובים ביותר לנרתיק.
5. לנתח על שני עוברים בכל קרן הרחם אם יש מספר זוגי של עוברים בכל צד (4 רוב הזמן), ועל 1 עובר בכל קרן הרחם אם יש מספר אי זוגי של הרחם(3 רוב הזמן).

4. חסימת קנה הנשימה

1. השתמש במשקפי הגדלה 2.5x להדמיה.
2. מקם את קרן הרחם בצורה רוחבית.
3. קח את הגורים, פונה כלפי מעלה, בין שתי אצבעות באמצעות העיניים של הגורים והזנב כמדריך למקם את העובר.
4. החל לחץ עדין על ראשו של הגור כדי לאפשר הארכה של הראש ולכן, הדמיה של הצוואר.
5. השתמש בתפר פוליפרופילן 6.0 עם מחט אטראומטית כדי לבצע TO (איור 1). שמור את השליה בצד ורחוק מנקודות הכניסה והיציאה של המחט.
6. הכנס את המחט רוחבית דרך הצד של הרחם הרחק השליה דרך החלק^1/3 הצדדי של הצוואר.
7. להזיז את המחט בעדינות עד קו האמצע של הצוואר ולכוון אותו לחלק השני, ואז לצאת את הצוואר בין קנה הנשימה ומול נדן הראש והרחם.
8. קשר את התפר, דואג לשמור על שלמות הממברנות ודפן הרחם, ולשמור על חבל הטבור בטוח במהלך הקשר.

איור 1: חסימת קנה הנשימה. (A) התפר הטרנס-רחמי העובר בצוואר. (B)ייצוג סכמטי של המבנים לאחר שהתפר עובר דרך ולפני הקשר. קיצורים: C = עורק ראשי; J = וריד הצוואר; T = קנה הנשימה; E = ושט; V = חוליה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. סגירת קיר בטן

1. החלף את קרן הרחם בבטן.
2. להזריק 2 מ"ל של מלוחים סטריליים חמים לתוך חלל הצפק לפני הסגירה.
3. שים תפר פוליגלקטין פועל 5/0 כדי לסגור את דופן הבטן, ולסגור את העור עם תפר משי שאינו פועל.
4. יש למרוח 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין תוך-פיוריטון על משככי כאבים, ולאפשר את התאוששות הסכר באינקובטור חם.

6. הקציר

1. יש למרוח הרדמה על הסכר ההריוני, ולקצור את כל העוברים ב-E18.5 בניתוח קיסרי.
2. בדוק את הכדאיות של העוברים על ידי צפייה בתנועות העוברים.
3. השתמש לפחות שתי טכניקות שונות עבור המתת חסד: אי ספיקת פחמן דו חמצני ונקע בצוואר הרחם.
4. הסר את הגופות בהתאם להסדרת המעבדה הווטרינרית.
5. לשקול את כל העוברים.
6. בצע חתך אנכי על בית החזה עבור בית החזה כדי להסיר את הריאות.
7. לנתח את הריאות של עוברים, ולשקול אותם כדי לחשב את יחס משקל הריאה הכולל לגוף (LBWR = (משקל ריאה שמאל + משקל ריאות ימין)/ משקל גוף x100).

7. היסטולוגיה

1. להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי, תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, וקרח יבש.
2. חותכים את הדגימות ב 10 μm סעיפים באמצעות cryostat, ולהרכיב אותם על שקופיות מצופה פולי ליסטין.
3. אופים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס לילה, ולהכתים את השקופיות האפויות עם המטוקסילין ואאוסין לפני הרכבה אותם לרכישת תמונה ב 10-20x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב.

8. עיבוד רקמות לניתוחי חלבונים ודנ"א

1. להקפיא את הריאות העובריות מנותח, הומוגניזציה אותם ב 300 μL של חיץ מבחני radioimmunoprecipitation. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ב 18,000 × גרם.
2. לחלץ ולכמת חלבון, DNA, ו RNA^10,12.

תוצאות

במחקר זה נבדקו 37 עוברים: 20 (54.1%) כ-TO לעומת 17 (45.9%) כשליטה. מכיוון שלא ניתן היה לחסן את קנה הנשימה ב-4 עוברים בקבוצת TO, הם לא נכללו במחקר. בשתי הקבוצות לא היה הבדל משמעותי בתמותה: 4 עוברים (25%) בקבוצת TO ו-2 עוברים (12%) בקבוצת הביקורת (p= 0.334, יחס יחסי זכייה (OR) 2.5, 95% רווח בר-סמך (CI) 0.39-16.05). מש...

Discussion

שיטה זו מתארת הליך כירורגי של חסימת קנה הנשימה העובר בעכברים והשפעתו על התפתחות הריאות. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בקפידה עבור TO מוצלח. החום של הפלטפורמה שבה הניתוח מתרחש ואת מלוחים הציג לתוך חלל הצפק הוא חיוני להתקדמות של ההריון. בנוסף, לחץ קל צריך להיות מיושם על ראש הגורי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine	Par Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	For regional anesthesia
Isoflurane	Halocarbon Life Sciences	NDC 66794-017-25	For general anesthesia
Magnification glasses	USA Medical-Surgical	SLR-250LBLK	At least 2.5x
Nikon 90i microscope	Nikon	3417	Motorized Fluorescence
Nucleospin Tissue Kit	Macherey-Nagel, Düren, Germany	740952.5	DNA isolation
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher, IL, USA	23225	Protein quantification
Polyglactin suture	Ethicon	VCP451H	4-0, 24 mm, cutting
Polylysine slides	VWR	48382-117	Microscope adhesion slides
Polypropylene suture	Ethicon	Y432H	6-0, 13 mm 1/2c Taperpoint
RIPA buffer	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	R0278-50ml	Protein isolation
Silk suture	Ethicon	VCP682G	4-0, 24 mm, cutting
Trizol	Invitrogen	15596026	RNA isolation