JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לגילוי ולוקליזציה של חלבון עובר Drosophila ו- RNA מאוסף להטבעה והטבעה מראש, אימונוסטיור ו- mRNA בהכלאה במקום .

Abstract

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים. כל פעילות תאית מהתפשטות תאים ואפופטוזיס, התפתחות והזדקנות, לפלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות קושרו עם קולטני ריאנודין (RyRs). למרות החשיבות של איתות סידן, המנגנון המדויק של תפקידו בהתפתחות מוקדמת אינו ברור. כאורגניזם עם תקופת הריון קצרה, העוברים של Drosophila melanogaster הם נושאי מחקר עיקריים לחקר ההפצה והלוקליזציה של חלבונים הקשורים CICR והרגולטורים שלהם במהלך הפיתוח. עם זאת, בגלל העוברים העשירים בשומנים שלהם וכוריון עשיר בכיטין, התועלת שלהם מוגבלת על ידי הקושי של הרכבה עוברים על משטחי זכוכית. בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול מעשי המגביר באופן משמעותי את ההתקשרות של עובר Drosophila על שקופיות ושיטות פירוט עבור היסטוכימיה מוצלחת, אימונוהיסטוכימיה, הכלאה in-situ . שיטת ציפוי החלקת הג'לטין של אלום כרום ושיטת טרום ההטבעה של העובר מגדילה באופן דרמטי את התשואה בחקר חלבון העובר של דרוזופילה וביטוי RNA. כדי להדגים גישה זו, חקרנו DmFKBP12 / Calstabin, רגולטור ידוע של RyR במהלך התפתחות עוברית מוקדמת של Drosophila melanogaster. זיהינו את DmFKBP12 כבר בשלב blastoderm הסינכיטיאלי ולדווח על דפוס הביטוי הדינמי של DmFKBP12 במהלך הפיתוח: בתחילה כחלבון מבוזר באופן שווה ב blastoderm סינסיטיאלי, ולאחר מכן לוקליזציה מראש לשכבת המרתף של קליפת המוח במהלך blastoderm הסלולר, לפני הפצה בארכיטקטורה העצבית והעיכול הפרימיטיבית במהלך שלב שלוש אבני חן בשלב גסטרולציה מוקדמת. התפלגות זו עשויה להסביר את התפקיד הקריטי ש-RyR ממלא במערכות האיברים החיוניות שמקורן בשכבות אלה: הגנגליון התת-ושט והסופר-ושט, מערכת העצבים הגחונית ומערכת השלד והשרירים.

Introduction

איתות שחרור סידן המושרה בסידן (CICR) ממלא תפקיד קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים, כגון שרירי שלד/חלק ותפקוד כלי הדם הלבביים, התפשטות התאים ואפופטוזיס, פיתוח, הזדקנות, פלסטיות סינפטית עצבית והתחדשות1,2,3,4,5,6 . קולטני ריאנודין (RyRs) ואינוזיטול 1,4,5-קולטני טריספוספט (IP3Rs) הם שחקנים מרכזיים במסלול איתות הסידן הנשלט על ידי הרגולטורים שלהם חלבון קינאז A (PKA), Ca2 +/calmodulin תלוי חלבון קינאז II (CaMKII), חלבונים מחייבים FK506 (FKBPs), קלסקסטרין (CSQ), טריאדין, ו junctin1,2,3,4,5,6 . ביטוי אנושי חריג ומוטציות בחלבונים אלה יכולים להוביל לפיזיולוגיה פתולוגית כגון הפרעות קצב7 והתפשטות אונקוגנית8,9.

FKBPs לווסת את שחרור הסידן מן הרשתית אנדופלסמית (ER) על ידי RyRs. תהליך זה חיוני למנגנון ההתכווצות, ולכן אחראי לכל תנועה מכנית שנוצרת על ידי התכווצות מיוזין-אקטין באמצעות שחרור סידן המושרה בסידן יחד עם RyRs עוברי 1,2. במודלים של עכבר, היעדר RyR2 והרגולטור שלו FKBP12/Calstabin הוא תמיד קטלני, בין אם במהלך התפתחות עוברית או בתקופה שלאחר הלידה המוקדמת10,11,12. עכברי נוקאאוט FKBP12/Calstabin מציגים מומים לבביים קריטיים עם צימוד עירור-התכווצות לא סדיר (EC) ובצקת מוחית במהלך התפתחות עוברית. זה מצביע על כך FKBP12/Calstabin ממלא תפקיד חיוני בוויסות ביטוי ערוץ RyR2, אשר חשוב הן להתפתחות הלב והן להתפתחות המוחית10.

ניצוצות סידן שנערכו על ידי RyR התגלו בתחילה בשלב היווצרות הזיגוטה של ביצי מדאקה מופרות13,14. עם זאת, חקירות מעטות בוצעו על הפונקציה של איתות סידן בהתפתחות עוברית מוקדמת. ב Drosophila melanogaster, תוצאות שהתקבלו DmFKBP12 S107 מוטציות לספק ראיות חזקות התומכות בחשיבות של גן זה להתפתחות זחל ותוחלת חיים בריאה, אשר מיוחס לתפקודו נגד סטרס חמצוני 15,16. לאחרונה, זיהינו את הלוקליזציה הדינמית של חלבון FKBP12 / Calstabin ו- RNA שליח במהלך פיתוח מלנוגסטר דרוזופילה מוקדם17. באמצעות הגישות המתוארות במתודולוגיה זו, הצלחנו לעקוב אחר הביטוי של FKBP12 / Calstabin ב D. melanogaster במהלך blastoderm סינסיטיאלי (0-2 שעות), blastoderm הסלולר (2-3 שעות), gastrula מוקדם (3-12 שעות) ו gastrula מאוחר (12-24 שעות). במאמר זה, אנו מציגים את הפרוטוקולים המפורטים של כל גישה במחקר הקודם, כולל הטמעה טרום-עוברית עבור חתך פרפין קלאסי, טיפול שקופיות טרום ציפוי עבור חלקים עובריים, היסטו-כימיה כתמים וחיסון, ו הכלאה mRNA in-situ לזיהוי ביטוי גנים.

Protocol

1. הכנת צלחות אגר מיץ ענבים

  1. מוסיפים 5 גרם אגר ו 5 גרם של סוכרוז ל 150 מ"ל של מים מזוקקים. מרתיחים אותו באמצעות מיקרוגל עד אגר וסוכרוז מומסים לחלוטין. מערבבים 50 מ"ל של 100% מיץ ענבים ואת הפתרון יחד.
  2. הוסף 1 מ"ל של 100% חומצה propionic כדי להפוך את הריכוז הסופי ל 0.5% חומצה propionic. יוצקים 25 מ"ל של הפתרון המוכן לתוך כל צלחת. לאחר אגר התגבש, לאחסן את המדיה ב 4 °C (70 °F).

2. שקופיות ציפוי

  1. טיפול מראש שקופיות עם חומר ניקוי. לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מי ברז ופעם עם מים מזוקקים. לאחר מכן יבש את השקופיות בתנור 45 °C (45 °F) במשך 2 שעות.
  2. לטבול את השקופיות בכ 450 מ"ל של פתרון חומצה גופרתית אשלגן dichromate (20 גרם של אשלגן dichromate, 40 מ"ל של מים מזוקקים, ו 400 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת) במשך 24 שעות. לשטוף את השקופיות 3 פעמים עם מי ברז ופעם עם מים מזוקקים.
    1. יבש את השקופיות בתנור 45 °C (45 °F) במשך שעתיים. יש לטבול ב-95% אתנול למשך יותר מ-2 שעות.
  3. מוסיפים 0.5 גרם של כרום אשלגן גופרתי ו 5 גרם של ג'לטין ל 1 L של מים מזוקקים. יש להמיס באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש. ג'לטין אלום כרום ניתן לאחסן ב 4 °C (50 °F) לתקופות ארוכות.
  4. טיפה 10 μL של ג'לטין אלום כרום על השקופית לכסות באופן מלא ושווה את כל פני השטח של השקופית עם הפתרון. מניחים את השקופית עם צד הג'לטין למעלה בתנור ב 42 °C (48 °F) במשך 48 שעות. ניתן לאחסן את השקופיות המוכנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: זהו צעד קריטי. הציפוי המלא הוא הכרחי. עבור זבוב הפירות והעובר שלו, גישת ציפוי שקופיות זו נראית יעילה יותר מציפוי פולי-ליזין.

3. הטמעת עובר Drosophila

  1. אוסף עוברים של Drosophila
    הערה: אספנו עוברים Drosophila בארבע תקופות של 0-2 שעות (blastoderm סינסיטיאלי), 2-3 שעות (blastoderm הסלולר), 3-12 שעות (gastrula מוקדם) ו 12-24 שעות (gastrula מאוחר)18. החלק היחסי של סוגי העוברים העיקריים בכל תקופה מוצג בטבלה 1.
    1. מניחים 400-500 זבובים בבקבוק איסוף פלסטיק ומכסים את הבקבוק בצלחת אגר מיץ ענבים המכילה תמצית שמרים. עוברים Drosophila מונחים על אגר מיץ ענבים בטמפרטורת החדר.
    2. לאסוף ארבע תקופות של עוברים, בעדינות להוסיף 2 מ"ל של PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) לכל צלחת כדי לצוף העוברים. מעבירים כ-200 עוברים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ושומרים אותו על הקרח למשך 2 דקות כדי ליישב את העוברים.
  2. הטבעה מראש
    1. מעבירים 200 עוברים דרוזופילה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שמור את הצינור על קרח במשך 2 דקות כדי ליישב את העוברים, ולאחר מכן להשליך את supernatant עם pipette בזהירות. מוסיפים 1 מ"ל של 50% אקונומיקה בצינור ומנערים אותו בעדינות במשך 2 דקות.
      הערה: האקונומיקה צריכה להכין טרי, וכמות האקונומיקה עשויה להשתנות בהתאם לכמות העוברים שנאספו.
    2. לאסוף בעדינות עוברים על ידי לשפוך על נייר סינון ולשטוף אותם 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS בכל פעם.
    3. מעבירים את העוברים בנייר סינון לכ-5 מ"ל של n-heptane.
    4. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של מתנול ומנערים אותו בעדינות. לאסוף עוברים לאחר משקע.
    5. הסר supernatant ולשטוף את העוברים ב 1 מ"ל של PBS 3-5 פעמים.
    6. תקן את העוברים עם 400 μL של הפתרון של Bouin (71% חומצה פיקרית רוויה, 24% פורמלין, 5% חומצה אצטית) במשך 30 דקות. לשטוף את העוברים הקבועים 3 פעמים ב 1 מ"ל של PBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    7. כדי לצבור עוברים, להעביר את הדגימות לתוך פקק גומי ולהסיר את PBS.
    8. הכן פתרון אגרוז-PBS של 1.2% ושמור על הפתרון בטמפרטורה של 60 °C (60 °F). הוסף 200 μL של 1.2% agarose-PBS פתרון על עוברים כדי לתקן אותם לתוך בלוק אגר.
    9. הוציאו את הבלוק מהמעצור ואחסנו את הבלוק ב-PBS.
      הערה: במהלך גישת טרום ההטבעה, תמיכה בהתחממות היא קריטית להצלחה. אנו ממליצים בחום כי צינורות צנטריפוגה וטיפים micropipette, אשר ישמש בשלב זה צריך להיות חם לחלוטין לפני ההפעלה.
  3. הטבעת פרפין
    1. טבול את בלוק אגר מוטבע מראש ב 35% אתנול, 50% אתנול, 75% אתנול, ו 85% אתנול במשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן לטבול 2 פעמים ב 95% אתנול ו 100% אתנול.
      הערות: על 5-10x של נפח בלוק של כל אחד ואחריו קבוע מדורג במשך 15-30 דקות יש צורך בהתאם למספר העוברים בבלוק.
    2. טבול את בלוק העוברים בתמיסת 100% אתנול וקסילן (יחס של 1:1) למשך 15 דקות.
    3. מעבירים את הבלוק לקסילן למשך דקה אחת כדי להפוך את רקמת העובר לשקופה.
    4. הטביעו את הבלוק בקסילן ופרפין (יחס של 1:1) למשך 30 דקות.
    5. הטביעו את הבלוק בפרפין I, בפרפין II ובפרפין III במשך 2 שעות בכל פעם.
    6. מלא את תיבת ההטבעה בפרפין מראש ולאחר מכן העבר בעדינות ובאופק את הבלוק לתחתית תיבת ההטבעה. לאחר הפרפין להתמצק באופן טבעי, בלוק פרפין מוצק ניתן לאחסן ב 4 °C (60 °F).
      הערות: ניתן להשתמש בדגימה המוטבעת מראש בקריוזקציה על-ידי ביצוע השלבים הבאים. לאחר העוברים מוטבעים מראש עם agarose כמתואר לעיל, הדגימות פשוט מוטבעות במתחם OCT. לאחר מכן, cryosection יכול להתבצע על פי פרוטוקול cryosection שגרתי. לאחר מכן, ניתן להשתמש בגישות מכתימות רגילות בקטעים.

4. מכתים המטוקסילין-אאוזין

  1. הכן קטעי עובר Drosophila . מניחים חלקים מוכנים בתנור ב 60 °C (60 °F) במשך 15 דקות ולאחר מכן להטביע את החלקים בקסילן 2 פעמים במשך 10 דקות כל אחד. הטביעו את החלקים פעם אחת ב-100% אתנול וקסילן (יחס של 1:1) למשך 2 דקות.
  2. לחות את החלקים 100% אתנול I, 100% אתנול II, 95% אתנול, 85% אתנול, 75% אתנול, 50% אתנול, ובמים מזוקקים במשך 3 דקות.
  3. מכתימים את החלקים בתמיסת המטוקסילין למשך 2 דקות. טובלים את השקופיות בתמיסת אלכוהול חומצית 1% (1 מ"ל של חומצה הידרוכלורית, 100 מ"ל של 70% אתנול) במהירות ושטפו את השקופיות במים מזוקקים.
  4. טובלים את השקופיות ב-50% אתנול, 75% אתנול, 85% אתנול ו-95% אתנול ברצף.
  5. מכתימים את החלקים בתמיסת אאוזין למשך דקה אחת.
  6. ייבשו את השקופיות ב-95% אתנול I, 95% אתנול II, 95% אתנול III, 100% אתנול I, 100% אתנול II ו-100% אתנול III למשך דקה אחת בכל פעם.
  7. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II, ו 100% קסילן III במשך 5 דקות בכל פעם.
  8. הר את השקופיות עם בלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

5. כתמי מתנין חומצה-כסף תקופתיים

  1. להפוך את החלקים של פרפין ללא דופן ולהעניק לחות לעובר דרוזופילה למים מזוקקים.
  2. לחמצן את החלקים ב 1% חומצה תקופתית במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. שוטפים את השקופיות במים מזוקקים 3 פעמים במשך 1 דקות כל אחד.
  4. דגירה על השקופיות בכ 40 מ"ל של פתרון עבודה מת'אנמין כסף מסונן טרי (3% מתאנמין, 5% כסף חנקתי, 5% פתרון נתרן בוראט) במשך 1 שעות ו 20 דקות ב 60 °C (60 °F). לאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקה.
  5. טון השקופיות ב 0.2% זהב כלוריד במשך 2 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקה.
  6. מניחים את השקופיות ב 3% נתרן thiosulfate במשך 3 דקות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במים מזוקקים במשך 1 דקות.
  7. Counterstain השקופיות hematoxylin עבור 30 s. לשטוף את השקופיות במי ברז זורמים במשך 3-5 דקות.
  8. ייבשו את השקופיות ב-70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול I, 95% אתנול II, 95% אתנול III, 100% אתנול I ו-100% אתנול II למשך 5 דקות כל אחד.
  9. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 5 דקות כל אחד.
  10. הר את השקופיות בבלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

6. אימונוהיסטוכימיה

  1. Deparaffinize ו rehydrate paraffin קטעים של עובר Drosophila ל- PBS בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי19.
  2. לטפל במגלשות עם 0.3% H2O2 במתנול במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהימנע מאור.
  3. מחממים מראש את מאגר אחזור האנטיגן המתאים לכ-100 מעלות צלזיוס במיכל עם השקופיות בספינת הקיטור הירקות. המיכל צריך להיות גם מכסה. שים את השקופיות במיכל. סגור את המכסה של ספינת הקיטור.
    1. שמור את המיכל בסיר הקיטור במשך 20 דקות מנקודה זו. שים לב כי המכסה של מיכל השקופית לא צריך להיות מהודק לחלוטין כך אדי מים יכולים להיכנס במהלך תהליך אידוי.
  4. אפשר לשקופיות לחזור לטמפרטורת החדר לפני שטיפה עדינה ב- PBS-T (PBS עם Tween-20, pH 7.2) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן שטפו את השקופיות ב- PBS 3 פעמים במשך דקה אחת כל אחת.
  5. חסום את השקופיות עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב- PBS למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לדגור על השקופיות עם נוגדן ראשוני (אנטי FKBP12 בשעה 1:1000) לילה ב 4 °C (60 °F) או בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
  7. לשטוף את השקופיות PBS-T 4 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  8. החל את השקופיות עם HRP שכותרתו פולימר מצומד עם נוגדנים משניים (אנטי ארנב, 1:5,000) במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. עשה זאת בחושך כדי להימנע מהלבנת תמונות.
  9. לשטוף את השקופיות PBS-T 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  10. לדגור על השקופיות עם 5% 3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride (DAB) במשך 2-10 דקות עד הצבע של מוצרי תגובה מתאים תחת מיקרוסקופ.
  11. נגד השקופיות hematoxylin עבור 30 s לשטוף את השקופיות במים מזוקקים 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
  12. לייבש את השקופיות ב 50% אתנול, 70% אתנול, 90% אתנול, 95% אתנול, ו 100% אתנול במשך 1 דקה כל אחד.
  13. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 5 דקות כל אחד.
  14. הר את השקופיות בבלזם ניטרלי בהתאם להוראות היצרן.

7. הכלאה בתוך מקום

הערה: קטעי עובר Drosophila הוכנו עם 0.01% דיאתיל pyrocarbonate (DEPC) מים שטופלו. כל האביזרים המשמשים בהכלאה במקום להחיל טיפול לילה DEPC מראש.

  1. הכנת ריבופרוב
    1. ליניאריזציה DNA תבנית על ידי חיתוך באתר אנזים הגבלה במורד הזרם מן להוסיף משובט באמצעות אנזים הגבלה שיוצר 5 ' overhangs. לאחר ליניאריזציה, לטהר את התבנית DNA באמצעות מיצוי פנול / כלורופורם, ומשקעים אתנול הבאים. השתמש בפרוטוקולים רגילים.
    2. הוסף 1 מיקרוגרם של DNA תבנית מטוהרת לצינור צנטריפוגה ללא RNase. מניחים את צינור הצנטריפוגה על קרח. הוסף מספיק מים שטופלו DEPC לנפח הכולל 13 μL.
      1. לאחר מכן להוסיף את ריאגנטים הבאים לפי הסדר: 2 μL של תערובת תיוג NTP 10x, 2 μL של מאגר שעתוק 10x, 1 μL של מעכב RNase מגן, 2 μL של RNA פולימראז SP6 או RNA פולימראז T7.
    3. מערבבים את התגובה על ידי צנרת וצנטריפוגה תוך זמן קצר. דגירה עבור 2 שעות ב 37 °C (50 °F).
      הערה: דגירה ארוכה יותר אינה מגדילה את התפוקה של RNA שכותרתו. ספין קצר (~ 800 סל"ד) המוחל על צינור התגובה הוא קריטי הכרחי לפני שתמשיך לשלב הבא. ספין זה יאפשר לכל התוכן, אשר יכול ליצור מן הדגירה, לבוא לתחתית הצינור.
    4. הוסף 2 μL של DNase חינם RNase I כדי להסיר DNA תבנית ודגור במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    5. הוסף 2 μL של 200 mM EDTA (pH 8.0) כדי לעצור את התגובה.
      הערה: ניתן לאחסן בדיקות RNA בעלות תווית DIG בטמפרטורה של -15 עד -25 °C (65 °F) באתנול למשך שנה אחת.
  2. טרום הכלאה של סעיף העובר Drosophila
    1. מניחים חלקים של עובר Drosophila בתנור 42 °C (42 °F) במשך 48 שעות.
    2. הפוך את השקופיות ל-100% קסילן למשך 10 דקות פעמיים.
    3. לחות את השקופיות על ידי טבילה רציפה 100% אתנול, 95% אתנול, 90% אתנול, 70% אתנול, ו 50% אתנול במשך 5 דקות.
    4. לדגור על השקופיות PBS במשך 5 דקות 3 פעמים כדי להסיר את הפתרון הקבוע / הפתרון של Bouin מן הרקמה.
    5. לשטוף את השקופיות עם 100 mmol / L גליצין / PBS פתרון 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    6. לשטוף את השקופיות עם PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    7. לדגור על השקופיות עם 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 15 דקות כדי לחלחל את הממברנות.
    8. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    9. דגירה את השקופיות ב 15 מיקרוגרם / מ"ל חלבון ללא RNase K במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    10. לדגור על השקופיות עם 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 3 דקות כדי לעצור את העיכול.
    11. לשטוף את השקופיות עם PBS 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    12. דגירה את השקופיות במאגר טריאתנולמין 100 מ"מ (pH 8.0) עם 0.25% (v/ v) אצטית אנהידריד 2 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    13. הוסיפו מי DEPC לתא הלחות של המגלשה. הוסף 20 μL של פתרון טרום הכלאה (המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל של DNA זרע סלמון) על השקופיות. שים את השקופיות לתוך תא הלחות שקופית. לדגור על השקופיות ב 42 °C (4 °F) עבור 4 שעות.
      הערה: יש צורך להבטיח את ההידוק של המכסה של הקופסה הרטובה וכי התיבה הרטובה נשמרת תמיד אופקית כדי למנוע תנודתיות וחריגה מן הרקמה של פתרון טרום הכלאה ואת פתרון הכלאה אחריו.
  3. הכלאה של סעיף העובר Drosophila
    1. הסר את פתרון טרום הכלאה ולשטוף את השקופיות עם 0.2x SSC (150 mM נתרן כלורי, 15 מ"מ נתרן ציטראט, pH 7.0) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד. לנגב עודף 0.2x SSC סביב דגימות הרקמה.
    2. החל 30 μL של פתרון הכלאה בדיקה (המכיל 2-6 ng של דיגוקסין שכותרתו RNA בדיקה על ידי דילול בפתרון טרום הכלאה) עם פיפטה. דגירה את השקופיות בתא לחות שקופית ב 42 °C (65 °F) עבור כ 20 שעות.
      הערה: ודא על הידוק המכסה כהצעה של ההערה האחרונה. אחרת, הייבוש שנגרם מדליפה של טרום הכלאה או טרום הכלאה תיצור רקע מלוכלך כולל פסאודו חיובי בשקופיות.
  4. הכלאה
    1. הסר את פתרון ההיברידיזציה ולשטוף את השקופיות עם פתרון SSC 4x 4 פעמים במשך 15 דקות כל אחד ב 37 °C (50 °F).
    2. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 2x עם 20 מיקרוגרם / מ"ל של RNase A במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F).
    3. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 1x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    4. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 0.5x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    5. לשטוף את השקופיות בתמיסת SSC 0.1x במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F).
    6. לשטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
    7. לשטוף את השקופיות במאגר כביסה (100 מ"מ חומצה גברית, 150 מ"מ NaCl, 0.3% (v / v) Tween 20, pH 7.5) במשך 1 דקות.
    8. לדגור על השקופיות ב 100 מ"ל של פתרון חסימה טרי מוכן (2% סרום כבשים במאגר חומצה maleic ללא Tween 20) במשך 30 דקות.
    9. לדגור על השקופיות ב 20 מ"ל של פתרון נוגדנים במשך 45 דקות.
      1. צנטריפוגה הנוגדן במשך 5 דקות ב 10,000 סל"ד בבקבוקון המקורי לפני כל שימוש, וצינור את הכמות הדרושה בזהירות מפני השטח. לדלל אנטי-digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU / mL) בפתרון חסימה.
    10. לשטוף את השקופיות ב 100 מ"ל של חוצץ כביסה 2 פעמים במשך 15 דקות כל אחד כדי להסיר מצומד נוגדנים מאוגדים.
    11. שיווי משקל את השקופיות ב 20 מ"ל של מאגר זיהוי (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) במשך 2-5 דקות.
    12. דגרו את השקופיות עם 10 מ"ל של פתרון מצע צבע טרי מוכן בתא לחות שקופית. התגובה מתחילה בתוך כמה דקות והיא הושלמה לאחר 16 שעות. אין לנער או לערבב בזמן התפתחות הצבע.
    13. לשטוף את השקופיות עם 50 מ"ל של מים מזוקקים במשך 5 דקות כדי לעצור את התגובה.
    14. ייבשו את הדגימה למשך הלילה בחושך.
    15. מייבשים את השקופיות ב-70% אתנול, 80% אתנול, 90% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול I ו-100% אתנול II למשך 3 דקות כל אחד.
    16. נקה את השקופיות ב 100% קסילן I, 100% קסילן II ו 100% קסילן III במשך 20 דקות כל אחד.
    17. הר את השקופיות עם בלזם ניטרלי.
    18. תעד תמונות וניתח באמצעות המיקרוסקופיה ההפוכה ותוכנת היצרן. בצע ניתוח הפצה באמצעות ImageJ על פי צפיפות של אות חיובי לאורך ציר אורך או בתוך אזור דיפרנציאלי של עוברים.
      הערה: במהלך הדגירה עם פתרון מצע הצבעים שהוכן זה עתה בשלב 7.4.12, ניתן לראות את צבע התגובה אפילו בעין חשופה. תצפית זו על איך פיתוח צבע ניתן לבדוק תחת סטריאוסקופ. ברגע שצבע התגובה סביר וניתן לבצע את השלב 7.4.13 כדי לעצור את התגובה.

תוצאות

הדמויות מתארות פרוטוקולים המשמשים להתגבר על האתגר של חיבור עוברי שומנים גבוהים המכילים שומנים וכיטין Drosophila (טבלה 1) למשטח שקופית הזכוכית לבדיקה וניסויים. תוך שימוש בשיטת ציפוי השקופיות של אלום כרום ג'לטין המוצגת באיור 1, שיפרנו את החיבור של עוברים Drosophila ?...

Discussion

RyRs ו- IP3Rs מתווך סידן איתות הוא מסלול בסיסי בתהליך פיזיולוגי ופתולוגי רבים של בעלי חוליות וחסרי חוליות כאחד 1,2,3,4. אצל בני אדם, מוטציות נקודתיות, כגון מוטציה R4496C הקשורה ל- CPVT, בגן RyR2 מובילות לדליפת סידן מהרשת הסרקופלסמית של ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (#31771377/ 31571273/31371256), תוכנית המדען המכובד הזר מהמחלקה הלאומית לחינוך (#MS2014SXSF038), הקרן הלאומית לחקר האוניברסיטאות המרכזיות של המחלקה הלאומית לחינוך (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), ו-XZ נתמכת על ידי קרן תזת הדוקטורט המצטיין (#2019TS082/2019TS079), תוכנית המפתח של מחלקת החינוך המחוזית שאאנשי (#20JS138), פרויקט הנוער של תוכנית המחקר הבסיסית למדעי הטבע של המחלקה למדע וטכנולוגיה במחוז שאאנשי (#2020JQ-885).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
-20°C RefrigeratorMeiling Biology &MedicalDW-YL270Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigeratorThermoForma 90 SeriesUsed for regent storage
AgarSigma-AldrichWXBB6360VPreparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsRoche11093274910For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubatorShanghai Bluepard InstrumentsLRH-250In-situ Hybridization
Bouin's solutionSinopharm Chemical Reagent at Beijing69945460Drosophila Embryo Embedding
CentrifugeEppendorf540BH07808In-situ Hybridization
Centrifuge tubeDenvilleC-2170Drosophila Embryo Collection
Chrome AlumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10001018Coating Slides
Constant temperature water bathJintan Henfeng InstrumentsKW-1000DCHematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection SystemDakoK5007In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPCSigma-AldrichD5758In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling KitRoche11093274910RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogasterBloomington Stock CenterBDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying ovenTianjin Taiste Instruments101-0ABFor coating slides and paraffin embedding
EosinSigma-Aldrich230251Hematoxylin-Eosin Staining
EthanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing100092680Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
GelatinSinopharm Chemical Reagent at Beijing10010328Coating Slides
Gold chlorideSigma-Aldrich379948Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
HematoxylinSigma-AldrichH3136Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification KitRoche11732668001For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity boxNingbo Jiangnan InstrumentsHWSFor fly maintenance
LE AgaroseHyAgarose14190108029Pre-embedding
MethanolSinopharm Chemical Reagent at Beijing10014108Drosophila Embryo Collection
MicroscopeZEISSObserver.A1Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope SlidesMeVid Labware ManufacturingP105-2001Coating Slides
Neutral GumSinopharm Chemical Reagent at Beijing10004160Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptaneSinopharm Chemical Reagent at Beijing40026768Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicerHuahai science instrumentHH-2508IIIIn-situ Hybridization
ParaffinSinopharm Chemical Reagent at Beijing69019461Paraffin Embedding
pH/mV MeterSartoriusPB-10For determing the pH value of a solution
Silver nitrateSinopharm Chemical Reagent at Beijing10018461Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meterThermoAFXI-0501-PIn-situ Hybridization
XyleneSinopharm Chemical Reagent at Beijing10023418Paraffin Embedding

References

  1. Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
  2. Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
  3. Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
  4. Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
  5. Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
  6. George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
  7. Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  8. Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
  9. Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
  10. Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
  11. Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
  12. Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
  13. Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
  14. Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
  15. Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
  16. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  17. Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
  19. Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
  20. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  21. Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
  22. Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
  23. Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
  24. Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
  25. Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the 'resolution revolution'. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

183Drosophilain situDmFKBPP12 Calstabin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved