שימוש בניתוח תמונה מבוסס מחשב כדי לשפר את כימות גרורות הריאות במודל סרטן השד 4T1

Summary

אנו מתארים שיטה עקבית ומזרזת יותר לכמת גרורות ריאות במודל סרטן השד 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ.

Abstract

סרטן השד הוא ממאירות הרסנית, המהווה 40,000 מקרי מוות של נשים ו -30% מאבחוני סרטן הנשים החדשים בארצות הברית בשנת 2019 בלבד. הגורם המוביל למקרי מוות הקשורים לסרטן השד הוא הנטל גרורתי. לכן, מודלים פרה-קליניים לסרטן השד צריכים לנתח נטל גרורתי כדי להיות רלוונטיים מבחינה קלינית. מודל סרטן השד 4T1 מספק באופן ספונטני גרורות, מודל העכבר לכימות עבור שלב IV סרטן השד האנושי. עם זאת, רוב פרוטוקולי 4T1 לכמת את הנטל גרורתי על ידי ספירה ידנית מושבות מוכתמות על צלחות תרבות הרקמות. אמנם זה מספיק עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך יותר, טעות אנוש בספירה ידנית גורמת לתוצאות לא עקביות ומשתנות כאשר צלחות הן confluent וקשה לספור. שיטה זו מציעה פתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. כאן, אנו מעריכים את הפרוטוקול באמצעות הריאה, רקמה גרורתית מאוד במודל 4T1. תמונות של לוחות מוכתמים בכחול מתילן נרכשים ומועלים לניתוח בפיג'י-ImageJ. פיג'י-ImageJ קובע את אחוז האזור הנבחר בתמונה הכחול, המייצג את אחוז הלוח בעומס גרורתי. גישה מבוססת מחשב זו מציעה תוצאות עקביות ומזרזות יותר מאשר ספירה ידנית או הערכה היסטופתולוגית לרקמות גרורתיות ביותר. העקביות של תוצאות Fiji-ImageJ תלויה באיכות התמונה. ניתן לבצע שינויים קלים בתוצאות בין תמונות, ולכן מומלץ לנקוט במספר תמונות ולתוצאות ממוצעות. למרות המגבלות המינימליות שלה, שיטה זו היא שיפור לכמת נטל גרורתי בריאה על ידי מתן תוצאות עקביות ומהירות.

Introduction

אחת מכל שמונה נשים תאובחנו עם סרטן השד בחייה, ובכל זאת למרות אפשרויות טיפול מרובות סרטן השד הוא הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן אצל נשים^{אמריקאיות 1}. הנשים האלה לא מתות מהגידול העיקרי בשד שלהן. במקום זאת, הנטל גרורתי אחראי על התמותה של מחלה זו כפי שהוא מתפשט בדרך כלל לריאות, עצם, מוח, כבד, ובלוטות^{הלימפה 2}. בגלל זה, מודלים סרטן השד צריך להעריך גרורות לתרום לריסון התמותה של מחלה זו. מודל סרטן השד 4T1 מורין הוא פרוטוקול מעולה כדי להשיג זאת. השיטה המתוארת כאן מציעה שיפור לדגם 4T1 באמצעות Fiji-ImageJ לכימות גרורות ריאות, תוך הפקת תוצאות עקביות ומזרזות.

מודל 4T1 מבוסס היטב, כאשר רוב המעבדות משתמשות בפרוטוקולים כגון אלה שתוארו על ידי פולסקי ואוסטראן-רוזנברג בשנת 2001³. קו התא 4T1 הוא 6-Thioguanine (6TG) עמיד ונציג של שלב IV, סרטן השד^{שלילי משולש 3,4,5}. זה רלוונטי מבחינה קלינית כפי שהוא מודל אורתוטופי באופן ספונטני גרורות לאותם איברים כמו בסרטן השד האנושי^3,4. תאי 4T1 שולחים גרורות באופן ספונטני בקצב צפוי בהתבסס על כמות התאים שהוזרקו^3,4. חשוב לציין, הבדלים גנטיים בין עכברים המשמשים כאן גרמו שונות בין-אינדיבידואלית צפויה בנטל גרורתי. כדי להעריך גרורות, רקמות נקצרות כדי לאסוף ולכמת תאים סרטניים באתרים מרוחקים באמצעות בחירת 6TG וכתמים כחולים מתילן. התוצאה היא אוסף של צלחות תרבות רקמה עם נקודות כחולות המייצגות מושבות גרורתיות. עם זאת, פרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג מכמת מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית שלהן, ולכן זה היה האמצעי הסטנדרטי להערכת גרורות במודל זה. אמנם זה קל עבור רקמות עם נטל גרורתי נמוך, רקמות כמו הריאות הם לעתים קרובות עמוס גרורות. כמו לוחות ריאות יכול להיות מאוד confluent, מדויק ובדיוק כימות מושבות גרורתיות על ידי ספירה ידנית קשה נוטה לטעות אנוש. כדי לכמת טוב יותר את העומס גרורתי, אנו מתארים שימוש בפיג'י-ImageJ לפתרון מבוסס מחשב לשגיאת ספירה אנושית. ניתוח היסטופתולוגי עם hematoxylin ו eosin (H&E) כתמים הוא אמצעי נוסף לכמת גרורות ריאות, ומעניין גם שופרה עם פיג'י-ImageJ^{תוכנה 6,7}. עם זאת, מכיוון שניתוח היסטופתולוגי מתבונן בפרוסה אחת של הריאה, הוא יכול להיות לא מדויק ולא מיוצג. הסיבה לכך היא כי מודל 4T1 גורם מספר נגעים גרורתיים לאורך האיבר כי הם לא מופצים באופן שווה. בעוד המגמות הכוללות בין ניתוח היסטופתולוגי וספירה^{ידנית יכול להיות דומה 8}, ערכים בודדים יכולים להיות שונים ולכן ניתוח היסטופתולוגי לא צריך לשמש כאמצעי היחיד לכמת. אנו מדגימים את התועלת בהשוואה לניתוח ההיסטופתולוגי ולאי העקביות בספירה ידנית בין מונים שונים, תוך הפגנת העקביות של השימוש בפיג'י-ImageJ. בנוסף, אנו מראים כי שיטה זו יכולה להפחית את זמן הדגירה מ 10-14 ימים עד 5 ימים, כלומר חוקרים יכולים לנתח נתונים מהמחקר שלהם הרבה יותר מוקדם מאשר כאשר מסתמכים על ספירה ידנית.

שיטה זו היא אוסף של התאמות פשוטות לפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג³. מכיוון שמודל 4T1 נמצא בשימוש נרחב, ומכיוון שגרוריות ריאות הן פרמטר קריטי למדידה במודלים פרה-קליניים, אנו מאמינים כי שיטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב ובעלת ערך רב לחוקרי סרטן השד. האספקה הנוספים היחידה הדרושה היא מצלמה וגישה למחשב עם Fiji-ImageJ, תוכנה חופשית המשמשת לעתים קרובות בניתוח תמונה⁹. שיטה זו מתמקדת במיוחד גרורות ריאות, אבל זה יכול לשמש עבור רקמות אחרות עם נטל גרורתי משמעותי.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של וירג'יניה טק ובהתאם למדריך הלאומי של מכוני הבריאות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. ביצוע פרוטוקול זה דורש אישור מהמוסדות המתאימים ודבקות בכל ההנחיות המתאימות.

1. תרבות התאים

1. הפוך מדיה תרבותית מלאה (RPMI + 10% סרום חזיר עוברי +1% עט סטרפטוקומפ). להחיות תאים 4T1 על פי פרוטוקול ATCC¹⁰ ו דגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO₂ בבקבוק T-25 עד confluent. שנה את המדיה יום לאחר ההחייאה כדי להסיר תאים מתים, ושוב אם המדיה מבוזבזת לפני שהתאים נוחים מספיק למעבר.
2. לאחר בקבוק T-25 הוא confluent, לעבור תאים לבקבוק T-75 על ידי השלכת מדיה, שטיפת בקבוק עם 5 מ"ל של 1x פוספט אגירה מלוחים (DPBS), והוספת 500 μL של טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק.
   1. לאחר הניתק, הוסף 5 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה מחוממת לתאים. שאפו והעבירו את ה-5 מ"ל לבקבוק T-75 המכיל 15 מ"ל של מדיה תרבותית שלמה מחוממת.
3. תאי מעבר בבקבוקי T-75 לפחות ארבע פעמים. לעשות זאת פעם הבקבוק הוא confluent על ידי כביסה עם 8 מ"ל של 1x DPBS, הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA עבור ניתוק תאים, הוספת 10 מ"ל של מדיה מחוממת לתאים, ודילול 1:6-1:8 לתוך דש T-75 חדש המכיל 20 מ"ל של מדיה תרבותית מלאה מחוממת.
4. תאי מעבר עד למספר המתאים של בקבוקונים T-150 המכיל 40 מ"ל של מדיה תרבותית מלאה מחוממת עבור מספר העכברים להיות מוזרק. רוב המחקרים ידרשו מספר רב של בקבוקונים T-150 כדי להבטיח מספיק תאים להזרקה.
5. כאשר עכברים מוכנים להזרקה (בני 8 שבועות או שוקלים מעל 20 גרם, בהתאם לפרוטוקולים IACUC או מוסדי), קציר תאים על ידי השלכת מדיה, שטיפת כל בקבוקון עם 10 מ"ל של 1x DPBS והוספת 2 מ"ל של טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד התאים להתנתק.
6. לשטוף בקבוק עם 10 מ"ל של מדיה מלאה ולהעביר את כל התוכן (10 מ"ל של מדיה + 2 מ"ל של תערובת תא טריפסין-EDTA) לבקבוק הבא. המשך לשטוף ולאסוף תאים מכל בקבוקון באמצעות אותו 10 מ"ל של מדיה, כדי למנוע שימוש בכמות מוגזמת של מדיה.
   1. לאחר איסוף כל הבקבוקים, העבר את התוכן לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאסוף מדגם 10 μL לספירה בצינור microcentrifuge צנטריפוגה צינור חרוט 50 מ"ל ב 125 x גרם במשך 5 דקות.
7. בעוד תאים להיות צנטריפוגה, להוסיף 10 μL של טריפאן כחול ל 10 μL של דגימת תא. לספור תאים באמצעות המוציטומטר. לאחר שנקבע המספר הכולל של תאים, לחשב את ריכוז התאים הדרושים כדי להזריק עכברים עבור 1.2 x 10^{6 תאים} לכל עכבר (לכל 100 μL).
8. לאחר צנטריפוגה, מדיה decant ו גלולת תא resuspend בכמות הנכונה של DPBS סטרילי 1x עבור 1.2 x 10^{6 תאים} לכל 100 μL. לפצל את תערובת התא / DPBS לתוך צינורות microcentrifuge לגישה קלה עם המזרק בעת שאפת תאים להזרקה. שמור תאים על קרח ולהזריק זמן קצר לאחר מכן כמו תאים יתחילו למות לאחר היותו על קרח במשך פרקי זמן ממושכים.

2. זריקות

1. הכן תאים להזרקה על ידי הקשה או ערבוב עדין של צינור microcentrifuge כדי לנצל מחדש את התאים, ולאחר מכן שאף 600 μL למזרק 1 מ"ל. להפוך את המזרק כלפי מעלה ולמשוך את הבוכנה למטה כדי להביא תאים מפתיחת המזרק. הקש על המזרק כדי להיפטר מבועות אוויר.
2. חבר את המחט משופע ולחלק תאים בחזרה לתוך צינור microcentrifuge עד רק 500 μL להישאר במזרק. שים מזרק שטוח על קרח.
   הערה: תאי 4T1 נופלים מההשעיה במהירות. לכן, חשוב לערבב תאים בחזרה להשעיה על ידי הקשה לעתים קרובות.
3. הרדמה 8 שבוע ישן / >20 גרם נקבה BALB / c עכבר באמצעות isoflurane או סוכן הרדמה מאושר אחר. לפקח על הנשימה של העכבר כדי להעריך את עומק ההרדמה.
4. לאחר העכבר הוא הרדמה כראוי כפי שצוין על ידי חוסר רפלקס הקרנית, מניחים את העכבר על גבו. באמצעות האגודל, המצביע והאצבע האמצעית, החזק בעדינות את העכבר לחוץ. השתמשו במצביע ובאצבעות האמצעיות כדי להחזיק את פלג הגוף העליון והאגודל של העכבר לרגלו השמאלית האחורית. תהיה עדין אבל תקיף.
5. עם שפוע של המחט למעלה, להזריק 100 μL של תאים תת עורית לתוך כרית שומן חלב הבטן השמאלית של העכבר. לפקח על bleb טוב וכל דליפה, ולהבטיח את העכבר מתעורר וזז בקלות לאחר ההזרקה.
   1. להחליף מחטים בין כל עכבר.
      הערה: אין לאפשר למחט להיכנס לחלל ההנצחה. זה יגרום לסרטן להתפשט במהירות ולא להיות נציג של המודל. כדי להבטיח זריקה תת עורית, בעדינות למשוך כלפי מעלה על המחט כאשר מוכנס כרית שומן חלב הבטן השמאלית. אם המחט מורמת בקלות כלפי מעלה, היא ממוקמת כראוי תת עורית.

3. ניטור

1. לפקח על עכברים לפחות 3 פעמים בשבוע עבור משקל, ציון מצב הגוף, גודל הגידול, מצב הגידול, נשימה, רמת פעילות, מראה, ותנועה. לאחר הגידול מגיע 0.7-0.8 ס"מ קוטר, להתחיל לפקח מדי יום.
   1. שקול המתת חסד כאשר גודל הגידול מגיע 1.5 ס"מ, או ירידה במשקל מגיע 20%, או ירידה קלינית חמורה ציון מצב הגוף, מצב הגידול, הנשימה, רמת הפעילות, המראה, או התנועה נצפו על סמך הנחיות מוסדיות.
      הערה: ציון מצב הגוף הוא חיוני כדי לפקח כמו משקל הגוף עשוי להגדיל כמו הגידול עולה בגודל, שליל אובדן מצב הגוף עקב נטל המחלה. פרוטוקולי ניטור מדויקים יהיו תלויים בפרוטוקולי IACUC או המוסדי המאושרים.

4. נקרופסיה

1. המתת לחץ לחץ באמצעות CO_{2 בעקבות} הנחיות מוסדיות.
2. לרסס עכבר עם 70% אתנול כדי לחטא. בצע חתך במעלה קו האמצע הגחוני של העכבר כדי לחשוף את חלל הגוף.
3. הסר את הכליה. המשך לחתוך את קו האמצע עד הסרעפת גלוי. השתמש במספריים כדי לנקב את הסרעפת כדי לנפח את הריאות. חתוך את הסרעפת כדי לקבל גישה טובה יותר לחלל.
4. השתמש במספריים קהים כדי לחתוך את מרכז בית החזה. הצמד את בית החזה בחזרה כדי לחשוף את הריאה והלב.
5. לנטרל את הלב עם 2 מ"ל של DPBS 1x לא סטרילי על ידי החדרת מחט לתוך לשיא הלב עד שהוא בריכות בחלל הבטן שבו הכליה הוסרה.
6. כדי להסיר את הלב והריאות, השתמש במספריים קהים כדי לחתוך את הוושט ואת קנה הנשימה ישירות מעל הלב. באמצעות מדפים, להתחיל למשוך את הלב מהגוף לחתוך בכל רקמת חיבור שמירה על זה מחובר. הריאות יצאו עם הלב.
7. זהה את הריאות מרובות השפתיים (מימין) והריונות החד-קרקעיות (השמאליות). שמור את הלב מחובר לעיון, אבל ברגע שהריאות מזוהות, לחתוך את הלב משם.
8. תייג צלחת 12 באר המכילה פתרון מלוחים מאוזן (HBSS) של האנק 1x בכל באר. כל עכבר צריך 2 בארות. מניחים את הריאה מרובת השפתיים (מימין) בצלחת 12 היטב להערכת גרורות ולשמור על קרח. שמור על באר השכנה ריקה לעת עתה.
   הערה: חשוב להשתמש באותה ריאה (מרובת אונים) מכל עכבר כדי להבטיח שכל דגימה קרובה בגודלה. לאחר מכן ניתן להשתמש בריאה החד-קרקעית לניתוח אחר, כמו היסטופתולוגיה.
   הערה: דגימות יציבות על קרח או ב 4 °C (60 °F) במשך כמה שעות.

5. עיבוד רקמות

הערה: יש לעשות את כל השלבים בסעיף זה בטכניקה סטרילית.

1. תווית 1 צינור חרוט 15 מ"ל לכל עכבר ולהוסיף 2.5 מ"ל של סוג IV קולגן תערובת 30 יחידות של אלסטאז לכל צינור. כדי להפוך את סוג IV קולגנס תערובת, להמיס 2 מ"ג של קולגן מסוג IV לכל mL 1x HBSS ומסנן סטרילי. זה יכול להיות מאוחסן עד 12 חודשים ב -20 °C (69 °F) ומופשר בעת הצורך.
2. העבר את הריאה השני, נקי 1x HBSS היטב עבור מדגם זה. מערבולת באמצעות מדפים כדי להסיר את כל הדם שנותר. מעבירים ריאה נקייה לצלחת תרבות רקמה ריקה של 3.5 ס"מ. ריאות טחון עם מספריים. יש לשטוף צלחת עם 2.5 מ"ל של 1x HBSS, להעביר 1x HBSS וחתיכות ריאות לתוך צינור חרוט 15 מ"ל כבר המכיל קוקטייל קולגנס / אלסטאז (5 מ"ל בסך הכל).
3. דגירה במשך 75 דקות ב 4 °C (60 °F). המשך ערבוב דגימות במהלך תקופה זו, כך למקם צינורות על נדנדה או גלגל מסתובב. במהלך שלב דגירה זה, תווית צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל ו 10 ס"מ רקמות צלחות תרבות עבור כל עכבר. אם עושים דילול, תווית מספיק 10 ס"מ רקמות צלחות תרבות עבור דילול.
   הערה: סמן את המכסה של לוחות תרבות הרקמה. אם תיוג הלוח עצמו, הכתיבה תפריע לניתוח פיג'י-ImageJ.
4. הביאו נפח של כל צינור עד 10 מ"ל בסך הכל עם HBSS 1x. יוצקים תוכן מעל מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מ"ל עבור כל מדגם. השתמש הבוכנה של מזרק 1 מ"ל לטחון בעדינות את המדגם דרך מסננת כדי לאפשר תאים נוספים לסנן דרך.
5. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 350 x גרם בטמפרטורת החדר (RT). השלך את גלולת העל לשטוף עם 10 מ"ל של 1x HBSS. חזור על שלב זה פעמיים.
6. גלולה resuspend ב 10 מ"ל של 60 מיקרומטר 6TG מדיה תרבות מלאה, או RPMI או IMDM. דגימות צלחת ב 10 ס"מ צלחות תרבות התא, באמצעות ערכת דילול אם תרצה. דגירה ב 37 °C (69 °F, 5% CO₂ במשך 5 ימים.
   הערה: 1:2, 1:10 ו- 1:100 הם דילולים נפוצים שיש לקבוע באופן אמפירי בהתבסס על פרמטרי המחקר.
   התרגם: 6TG רעיל. נקוט זהירות בעת טיפול ופעל בהתאם לכל הנחיות הבריאות והבטיחות הסביבתית לסילוק.

6. צלחות מכתים

1. יוצקים מדיה תרבותית מצלחות לתוך מיכל פסולת מתאים. לתקן תאים על ידי הוספת 5 מ"ל של מתנול לא מזוהה לכל צלחת דגירה במשך 5 דקות ב RT, הקפדה על מערבולת מתנול, כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.
   התריעה: מתנול מסוכן אם הוא נבלע, שואף או על העור. השתמש ברדס אדים לשלב זה.
2. יוצקים מתנול מהצלחות לתוך מיכל פסולת מתאים. שוטפים צלחות ב-5 מ"ל מים מזוקקים לצלחת ויוצקים מים לתוך מיכל פסולת מתאים. מוסיפים 5 מ"ל של 0.03% מתילן כחול לצלחת ודגירה במשך 5 דקות ב RT, הקפדה על פתרון כחול מתילן מערבולת כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.
3. יוצקים כחול מתילן לתוך מיכל פסולת מתאים. לשטוף צלחות שוב עם 5 מ"ל של מים מזוקקים לכל צלחת. הופכים צלחות וכתמים על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. מניחים צלחת על המכסה שלה ולתת אוויר להתייבש לילה ב RT.
   הערה: מושבות גרורתיות יהיו כחולות. לאחר צלחות מיובשות, הם יכולים להיות מאוחסנים ב RT ללא הגבלת זמן.

7. ניתוח תמונה

1. הסר מכסים המסווים מהצלחות, תוך הקפדה על זיהוי ברור של דגימות. בשורה את כל לוחות הריאות מוכתמים על משטח נקי וקל כדי לצלם את כל הצלחות בתמונה אחת.
2. צלם תמונה של אוסף הצלחות באזור מואר היטב, הקפד למזער השתקפויות מכיוון שהצלחות מחזירות אור מאוד. השתקפויות בצלחות ישפיעו על ניתוח התמונה ולכן יש להימנע.
   הערה: פיג'י-ImageJ יש גבול עליון של 2 ג'יגה-פיקסל. רוב הטלפונים החכמים המודרניים יהיו מספיק מצלמות. אין להשתמש במצלמה בפחות מ-8 מגה-פיקסל. המצלמה ששימשה בניסוי זה הייתה 12.2 מגה פיקסל על פיקסל 2 של גוגל.
3. חותכים את התמונה כך שתכלול את הלוחות, אך לא כוללים את המכסים או כל דבר אחר ברקע התמונה. העלה את התמונה החתוכה לתוך פיג'י-ImageJ.
4. שנה את התמונה לשחור-לבן באמצעות הפקודות הבאות: תמונה, התאמה, סף צבע, שיטת סף: ברירת מחדל, צבע סף: B&W, רווח סף: Lab. בטלו את הבחירה בתיבת הרקע הכהה. התמונה צריכה להיות עכשיו שחור ולבן. שחור מייצג את רקע האור, ולבן מייצג את המושבות גרורתיות כחולות.
5. באמצעות הכלי עיגול בסרגל הכלים פיג'י-ImageJ, בחר את האזור שיש לנתח. ציירו עיגול אחד לשימוש עבור כל הלוחות כדי להבטיח שכל לוח ינותח עבור אותו אזור בגודל. בחרו גודל שמגדיל את האזור המנותח על הלוחות תוך מזעור רעשי הרקע המופיעים בקצה הלוחות. הגודל מופיע בסרגל הכלים בעת ציורו, כך שניתן ליצור עיגול מושלם על-ידי ניטור הגובה והרוחב בעת ציור העיגול.
6. נתח את העיגול הנבחר כדי לקבוע איזה אחוז מהאזור הוא לבן, המייצג את אזור הלוח הכולל מושבות גרורתיות כחולות. השתמש בפקודות הבאות:
   לנתח, לנתח חלקיקים, גודל^{(פיקסל 2}): 0-אינסוף, מעגליות: 0.00-1.00, הצג: כלום, וסמן את התיבה לסכם. הכה בסדר.
7. רשום את התוצאה % אזור. זהו אחוז האזור שנבחר שהוא לבן, ולכן מייצג את הנטל גרורתי.
   הערה: מומלץ לשמור את התוצאות בפיג'י-ImageJ או להעתיק/להדביק את דף התוצאות כולו במסמך נפרד. אם % תוצאות האזור אינן צפויות או חשודות, ניתן לראות אם אחת מהמידות האחרות הייתה גם חשודה או אם % Area נרשם באופן שגוי.
8. הזז את העיגול, מבלי לשנות את גודלו על ידי תפיסתו במרכזו, לצלחת הבאה בתמונה. חזור על שלבים 7.6 ו- 7.7 עבור כל הלוחות בתמונה.
9. חזור על שלבים 7.1 – 7.8 בשתי תמונות נוספות לפחות. לאחר שניתחו את כל הלוחות והתמונות, ממוצע תוצאות % אזור בין תמונות שונות עבור כל לוח כדי לצמצם את חוסר העקביות בין התמונות.

תוצאות

שיטה זו מכילה התאמות פשוטות מפרוטוקול פולסקי ואוסטראן-רוזנברג 4T1³ ו ניתן לדמיין אותן איור 1. כאשר 3 חוקרים נפרדים ספרו ידנית מושבות גרורתיות עבור 12 צלחות ריאה (דילול של 1:10), התוצאות היו מאוד לא עקביות בין מונים שונים (איור 2A). כל החוקרים הופנו "לספו...

Discussion

כפי שהוכח, ספירה ידנית של המושבות גרורתיות על כל לוח ריאות יכולה להיות שיטה לא מדויקת ולא מדויקת לכימות גרורות ריאות, המדגימה את הצורך באמצעי כימות טוב יותר (איור 2). הניתוח ההיסטופתולוגי היה שונה במקצת הן מספירה ידנית והן מניתוח פיג'י-ImageJ (איור 2B ו- 4D

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Anesthetic agent	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
BALB/c Female Mice	The Jackson Laboratory	000651
Blunt scissors	Roboz	RS-6700
Calculator	Any	Any
Camera	Any	Any	Minimum of 8 megapixels
Centrifuge	Any	Any	Needs to be capable of 125 x g and 300 x g
CO2 euthanasia setup	See comments	See comments	Use approved materials in your institution's policies
Cold room, refrigerator, cold storage	Any	Any
Computer with Fiji-ImageJ	Any	Any	Needs to be capable of running Fiji-ImageJ
Counting Chamber	Fisher Scientific	02-671-10
Curved scissors	Roboz	RS-5859
Distilled water	Any	Any
Elastase	MP Biomedicals	100617
Electronic scale	Any	Any
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D Systems	S11150
Forceps	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubator	See comments	See comments	Needs to be capable of 5% CO2 and 37 °C
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Methylene blue	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Penicillin Streptomycin	ATCC	30-2300
Pins or needles	Any	Any	For pinning down mice during necropsy
Plastic calipers	VWR	25729-670
RMPI-1640 Medium	ATCC	30-2001
Rocker or rotating wheel	Any	Any
Sharp scissors	Roboz	RS-6702
Sterile disposable filter with PES membrane	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flasks	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flasks	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flasks	Fisher Scientific	13-680-65
Tri-cornered plastic beaker	Fisher Scientific	14-955-111F	Used to weigh mice
Trypan blue	VWR	97063-702
Trypsin-EDTA	ATCC	30-2101
Type IV collagenase	Sigma-Aldrich	C5138
3.5 cm tissue culture plates	Nunclon	153066
1 mL syringe	BD	309659
1.7 mL microcentrifuge tubes	VWR	87003-294
10 cm tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-22
12 well plate	Corning	3512
15 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Dulbecco's Phostphate Buffered Saline (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 in needles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® CRL­2539™)	ATCC	CRL-2539
50 mL centrifuge tube	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 μM cell strainer	Fisher Scientific	22-363-548
70% ethanol	Sigma Aldrich	E7023	Dilute to 70% with DI water