JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.

Abstract

חילוף החומרים של השומנים הוא תהליך פיזיולוגי בסיסי הנחוץ לבריאות התאים והאורגניזמים. Dysregulation של חילוף החומרים של השומנים לעתים קרובות מעורר השמנת יתר ומחלות רבות הקשורות כולל הפרעות לב וכלי דם, סוכרת מסוג II, וסרטן. כדי לקדם את ההבנה הנוכחית של ויסות מטבולי השומנים, שיטות כמותיות כדי למדוד במדויק את רמות אחסון השומנים vivo בזמן ובמרחב הפכו חשובים ושימושיים יותר ויותר. הגישות המסורתיות לניתוח אחסון שומנים הן כמותיות למחצה להערכה מיקרוסקופית או חסר מידע מרחבי-זמני למדידה ביוכימית. מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) היא טכנולוגיית הדמיה כימית נטולת תוויות המאפשרת זיהוי מהיר וכמותי של שומנים בתאים חיים ברזולוציה תת-תאית. מכיוון שהניגוד מנוצל מתנודות מולקולריות מהותיות, מיקרוסקופיה SRS מאפשרת גם מעקב ארבע מימדי אחר שומנים בבעלי חיים. בעשור האחרון, מיקרוסקופיה SRS כבר בשימוש נרחב עבור הדמיה מולקולה קטנה במחקר ביו ולהתגבר על המגבלות העיקריות של כתמים פלואורסצנטיים קונבנציונליים ושיטות מיצוי השומנים. במעבדה, שילבנו מיקרוסקופיה SRS עם הכלים הגנטיים והביוכימיים הזמינים לאורגניזם המודל החזק, Caenorhabditis elegans, כדי לחקור את ההפצה וההטרוגניות של טיפות השומנים על פני תאים ורקמות שונים ובסופו של דבר לגלות מסלולי איתות שמורים חדשניים המווסתים את חילוף החומרים של השומנים. כאן, אנו מציגים את עקרונות העבודה ואת ההתקנה המפורטת של מיקרוסקופ SRS ולספק שיטות לשימוש בו לכימות אחסון השומנים בנקודות זמן התפתחותיות מובהקות של סוג פראי ואינסולין איתות מוטציה לקוי C. elegans.

Introduction

השמנת יתר הפכה לבעיה בריאותית עולמית המאיימת על שליש מהאוכלוסייה ברחבי העולם, והיא מציגה דאגה רפואית חמורה, בהתחשב בקשר שלה עם בריאות נפשיתירודה 1 ומחלות קטלניות כולל סוכרת2, מחלות לב וכלידם 3 וסוגים מסוימים של סרטן4. מחקר של חילוף החומרים של השומנים חיוני כדי להבין טוב יותר את הבעיות הביולוגיות מאחורי השמנת יתר. כימות מהיר וספציפי של אחסון השומנים כרוך בזיהוי חומצות שומן ונגזרותיהן, כמו גם מטבוליטים המכילים סטרול, עם רגישות גבוהה ועדיף עם מידע מרחבי. שומנים הם מטרות מאתגרות לתמונה כי הם חסרים פלואורסצנטיות מהותית ולא ניתן לתייג בקלות פלואורסצנטית. תגי הפלואורסצנט הם לעתים קרובות גדולים יותר מאשר מולקולות השומנים, ולכן, יכול להיות פולשני מבחינה כימית ולא מעשי עבור יישומי vivo. אסטרטגיית תיוג ללא תווית או מינימלית נחוצה כדי לשמר את המבנה ההידרופובי של מולקולות השומנים5. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות הדמיה יצרו הזדמנויות מרגשות להדמיה נטולת תוויות של שומנים בתאים חיים, רקמות ואורגניזמים.

גישות מסורתיות לניתוחי אחסון שומנים בדגימות ביולוגיות כוללות מבחנים ביוכימיים ופרוטוקולי כתמים עם צבעים ליפופיליים. מבחני כימות ביוכימי מעורבים ספקטרומטריית מסה (MS) הם ללא תחרות בפתרון מולקולרי שלהם, אבל הם דורשים כמויות מדגם גדולות מאוד הכנה מדגם בדרך כלל לוקח כמה שעות, הגבלת היישום שלהם עבור הדמיה בזמן אמת של מערכותחיים 5. מגבלה מרכזית נוספת של מבחנים אלה היא היעדר מידע מרחבי. מצד שני, צבעים ליפופיליים כגון שמן אדום O סודן שחור לספק רקמות והפצה הסלולר של organelles אחסון השומנים לעומת טכניקות טרשת נפוצה, שיטות כתמים אלה הם גם בעלות נמוכה וקל לבצע. עם זאת, פרוטוקולי הכתמה אלה דורשים קיבעון, אשר יכול להשפיע על האופי ההידרופובי של טיפות השומנים, ליצור שינויים מלאכותיים במבנה שלהם לגרום חוסר עקביות בין ניסויים6. הקשיים הטכניים הקשורים לטכניקות ביוכימיות וכתמים הובילו לחיפוש שיטות נטולות תוויות לדימוי מולקולות שומנים ולעלייה המהירה בשימוש במיקרוסקופיה קוהרנטית של פיזור ראמאן (CRS) בהדמיית שומנים.

אפקט ראמאן הוכר לראשונה על ידי ראמאן וקרישנן, שם דיווחו כי באינטראקציה עם פוטון, מולקולה יכולה ליצור אור מפוזר ללא שינוי באורך הגל (הנקרא פיזור ריילי) או לעתים רחוקות עם אורך גל שונה (הנקרא פיזור ראמאן) ושינוי זה באורך הגל אופייני לקבוצות הכימיות הפונקציונליות בתוך המולקולה7. כאשר הקשרים הכימיים בתוך מולקולה מתרגשים לרמת אנרגיה רטט גבוהה יותר על ידי אירוע פוטון, הנקרא משאבת פוטון, האנרגיה של פוטון מפוזר, הנקרא פוטון סטוקס, להיות נמוך יותר. אחרת, הקשרים הכימיים יכולים להגיע לרמת אנרגיה רטט נמוכה יותר אם הם במקור ברמה גבוהה יותר, והפוטון המפוזר צובר אנרגיה כדי להיות פוטון אנטי סטוקס. הבדל התדרים בין האירוע לבין פוטונים מפוזרים ידוע בשם משמרת ראמאן. לכל קשר כימי בתוך מולקולה יש שינוי ראמאן אופייני וניתן לכימות. לדוגמה, אג"ח CH2 יש משמרת ראמאן של 2,845 ס"מ-1, אשר שופע שרשראות חומצות שומן8. אות ראמאן ספונטני זה הוא בדרך כלל חלש מאוד, אשר הגביל במידה ניכרת את מהירות ההדמיה במיקרוסקופיה ראמאן ספונטנית קונבנציונלית. במהלך השנים פותחו גישות שונות להגברת מהירות ההדמיה והרגישות של מיקרוסקופיה ראמאן ספונטנית. מיקרוסקופיית פיזור ראמאן קוהרנטית, כולל מיקרוסקופיה קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן פיזור (CARS) ומיקרוסקופיה של פיזור ראמאן מגורה (SRS), היא ההתקדמות האחרונה. למכוניות ול-SRS יש עקרונות עבודה שונים במקצת, אך שתיהן טכניקות נטולות תוויות בעלות יכולת הדמיה חיה, יכולות להניב מידע מרחבי וטמפורלי על דינמיקת אחסון השומנים, ודורשות רק גודל דגימה קטן. מיקרוסקופיה של CARS סובלת מרקע לא מהדהד, שמקורו בתהליכים לא ליניאריים שונים, ולאותות CARS יש גם קשר לא ליניארי עם ריכוז המולקולה, אשר יחד מסבכים את תהליך הכימות9. שלא כמו מיקרוסקופיה של CARS, מיקרוסקופיה SRS אינה מייצרת אותות רקע שאינם מהדהדים ומציעה תלות ליניארית בריכוז המולקולה המעניינת. לכן, כיום מיקרוסקופיה SRS נעשה שימוש נרחב יותר עבור הדמיית שומנים.

במיקרוסקופיה SRS, אותות ראמאן ספונטני חלש ניתן להגביר כאשר נרגש על ידי שתי קרני לייזר מסונכרנות עם הפרש התדרים שלהם התאמת תדר רטט הקשר הכימי. המולקולה תחווה מעבר משופר למצב נרגש עקב עירור קוהרנטי. כתוצאה מכך, קצב ייצור הפוטונים של סטוקס מוגבר. כתוצאה מכך, עוצמת קרן "סטוקס" המשודרת עולה (מגורה רווח ראמאן, SRG) ואת עוצמת הקרן "משאבה" מועבר פוחתת (מגורה אובדן ראמאן, SRL). זיהוי אותות SRG או SRL עומד בבסיס הדמיית מיקרוסקופיה של מיקרוסקופיה של מולקולות עם קשרים כימיים ספציפיים10. אם הפרש התדרים בין שתי קרני הלייזר אינו תואם לתדר הרטט של הקשר הכימי בתוך מולקולה בעלת עניין, לא ייווצרו אותות SRG ולא SRL. מהירות ההדמיה של מיקרוסקופיה SRS היא סביב 2 μsec לפיקסל או 1 שנייה לכל מסגרת, וזה הרבה יותר מהר מאשר מיקרוסקופיה ראמאןספונטנית 11. רזולוציה רוחבית אופיינית עבור מיקרוסקופיה SRS מוגבלת עקיפה סביב 300 ננומטר. בנוסף, התהליכים האופטיים של שני פוטונים של מיקרוסקופיה SRS מאפשרים הדמיה תלת-ממדית נפחית של דגימות רקמה עבות יחסית ועומק ההדמיה יכול להגיע ל-300-500 מיקרומטר. בסך הכל, מיקרוסקופיה SRS מציגה טכניקת הדמיה יעילה, ללא תווית, כדי לזהות ביומולקולות ספציפיות, במיוחד שומנים.

טיפות השומנים הן אברונים חד-קרום, שהם אתר האחסון הסלולרי העיקרי עבור שומנים ניטרליים, כולל triacylglycerols (TAGs) ואסטרים כולסטרול (CEs). CH2 קשרים בשרשראות חומצות שומן של מולקולות השומנים האלה ליצור אותות SRS חזקים ב 2,845 ס"מ-1 כאשר נרגש8, ובכך מאפשר זיהוי וכימות של רמות השומנים אחסון בתאים שלמים, קטעי רקמות ואפילו אורגניזמים שלמים12,13,14,15. בפרט, C. elegans שימושיים עבור מחקרי הדמיה שומנים בשל השקיפות שלהם. כמו יונקים, C. elegans גם לאחסן שומנים טיפות השומנים ואת מסלולי סינתזה השפלה של מולקולות השומנים שמורים מאוד16. בפרוטוקול זה, אנו נספק את עקרון העבודה של מיקרוסקופיה SRS, ההתקנה הבסיסית שלה ולתאר את השיטות לשימוש בהדמיית שומנים ב- C. elegans.

Protocol

1. התקנה אינסטרומנטלית למיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

הערה: מערכת מיקרוסקופיה SRS בנויה על לייזר picosecond עם משאבה משולבת מתנד פרמטרי אופטי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. המתנד מספק שתי רכבות דופק picosecond, כולל קרן סטוקס ב 1,064 ננומטר וקרן משאבה כוונון בין 700-990 ננומטר. חפיפה זמנית ומרחבית של שתי הקורות מושגת בתוך הלייזר. אפנן אלקטרו-אופטי מובנה (EOM) תוכנן במיוחד עבור מיקרוסקופיה SRS. פרוטוקול זה יתמקד בצימוד הלייזר באמצעות המיקרוסקופ, ובהפעלה היומיומית של מערכת זו (איור 1). התצורה של מערכת מיקרוסקופ SRS מתפתחת בעשור האחרון. יש לציין שהתיאור הבא מייצג רק אחת מהתצורות.

  1. האכלת קרני לייזר למיקרוסקופ
    1. הגדר את periscope כדי להרים את הקרן מיציאת מקור אור picosecond ליציאת קלט לייזר IR בסורק של המיקרוסקופ.
      התראה: קרא את המדריך למערכת הלייזר לפני הניתוח ולנקוט בכל אמצעי הזהירות הנדרשים מכיוון שקרינה אינפרא אדום הקרובה הנוצרת על ידי מערכת לייזר Class IV זו עלולה לגרום נזק חמור לעיניים ולעור. השלם את ההכשרות הנדרשות על ידי המחלקות המוסדיות לבטיחות סביבתית. יש ללבוש משקפי מגן וחלוק מעבדה עם שרוולים אזוקים.
    2. ראשית, להגדיר את קרן המשאבה ב 750 ננומטר ולהוריד את כוח הלייזר ל 50 mW, אשר ניתן לבדוק חזותית, שיוך היישור. לאחר מכן, השתמשו במרחיב קרן(איור 1, L1 ו-L2) להתאמת קוטר הקרן כך שיתאים לצמצם האחורי של מטרות המיקרוסקופ. השתמש בשתי מראות ממסר(איור 1, M1 ו- M2) כדי להנחות את קרן הלייזר ל periscope(איור 1, P1 ו- P2). פריסקופ יהיה להרים את הקרן לגובה של פתיחת הסורק וישמש מראה היגוי ליישור גם כן.
    3. הניחו את הידיות על פריסקופ במרכז טווח הכוונון ובחרו את המיקום והזווית הראשוניים של כל מראה כך שקרן הלייזר תפגע במרכז המראה, בערך.
    4. בצע את היישור הגס באמצעות יציאה ריקה על הצריח האובייקטיבי והנח את גשוש מד הכוח כדי למדוד את כוחו של האור המשודר. הגדר את הסורק של המיקרוסקופ בזום הגבוה ביותר (50x), ולאחר מכן למדוד את כוחו של האור המועבר עם נקודת קרן לייזר ממוקדת. מטב את הידיות על כל מראה, M1 ו- M2, באופן איטרטיבי כדי להשיג את עוצמת הלייזר המשודרת הגבוהה ביותר.
    5. בצע את היישור העדין באמצעות כלי היישור. שים את מכסה היישור של יעד הפלואורסצנטיות על המושב האובייקטיבי הריק והתאם את הידיות של M1 למרכז הנקודה. לאחר מכן, להציג את הצינור הרחבה עבור היעד ולכוונן את הידיות של M2 כדי למרכז את המקום.
    6. חזור על שלבים 1.1.4 ו- 1.1.5 עד שהקרן תרכז את המטרה בשתי העמדות.
  2. חיבור זיהוי ואלקטרוניקה
    1. הגדר את מודול הזיהוי של SRS. מניחים קוביר מפצל קרן לאחר המוליך כדי לכוון את הלייזר המועבר למודול photodiode. המודול כולל טלסקופ כדי להעביר ולשנות את גודל הקרן כדי להתאים את האזור הפעיל של photodiode, כמו גם מסנן אופטי כדי להסיר את קרן סטוקס מווסת ולתת קרן המשאבה לעבור להורדה בדרגה.
    2. הגדר את חיבור האלקטרוניקה (איור 1). עוצמת קרן סטוקס מווסתת על ידי EOM מובנה במהירות של 20 מגה-הרץ בתוך הלייזר הניתן לכוונון picosecond. פלט תדר האפנון מהלייזר הוא קלט לתוך מגבר הנעילה כתדירות הייחוס להדגמה בדרגה. הזן את אות הפלט של הפוטודיודה במגבר הנעילה להורדה בדרגה של ה- SRL.
      הערה: ניתן לשדרג את מערכות הלייזר החד-פעמיות ולכן המפרטים שלהן עשויים להשתנות בהתאם לתאריך ייצור שונה. הגרסה הקודמת של מערכת לייזר מתכווננת picosecond, בשימוש בפרוטוקול זה, יש קרן סטוקס של 1,064 ננומטר, אבל הגרסה האחרונה יש קרן סטוקס של 1,031 ננומטר. תדר האפנון של EOM המשמש בפרוטוקול זה מותאם אישית ל- 8 מגה-הרץ, אך תדר אפנון ברירת המחדל עבור המערכת האחרונה יכול להיות 10 או 20 מגה-הרץ.
    3. לבסוף, הזן את פלט מגבר הנעילה לתיבה האנלוגית של המיקרוסקופ כדי להמיר אות אנלוגי חשמלי לאות דיגיטלי. המערכת צריכה להיות מוכנה לעיבוד אות ה- SRS.
  3. מיטוב תנאי דימות
    1. הפוך מדגם כימי ליישור המערכת. לדוגמה, השתמש dodecane כדי לייעל את המיקרוסקופ, כי dodecane יש אות SRS חזק מאוד מאג"ח C-H. השתמש חותם מאובטח כדי להפוך תא מיני; לשים 5 μL של דודקיין ולכסות אותו עם coverlip.
      הערה: החלף את דגימת דודקיין ברגע שזה נראה לא ברור או מציג פסולת, עם מדגם חדש אשר יכול לשמש ליישור במשך 2-3 חודשים.
    2. מניחים את הדגימה על במת המיקרוסקופ. כראוי להתמקד טיפת הנוזל. זה יכול להיעשות מהר יותר על ידי מחפש את הקצה של כרית dodecane. כוונן את המרוכס לתאורה של קולר.
    3. הגדר את פרמטרי הדימות. בדוק אם שלב ההשהיה נמצא במספרים הנכונים. הגדר את אורך הגל של קרן המשאבה ל-795.8 ננומטר. באמצעות כרטיס חיישן IR ומציג IR, בדוק אם נתיב קרן המשאבה עדיין נכון.
    4. הגדר את העוצמה של קרן המשאבה ל 200 mW ואת קרן סטוקס ל 400 mW על לוח הבקרה של מערכת picosecond.
      הערה: תפוקות הלייזר מיציאת לייזר למטרת פוסט של שתי הקורות הן כ-25% למשאבה ו-14% לסטוקס להתקנת מערכת זו. לכן, כוח אובייקטיבי פוסט של קרן משאבה הוא כ 50 mW ועבור קרן סטוקס זה סביב 56 mW. רוחב הדופק של מערכת לייזר picosecond האחרונה השתנה מ 6 ps ל 2 ps, ולכן, כוח לייזר להחיל צריך להיות אפילו נמוך יותר.
    5. הגדר את הרווח המרבי של מגבר הנעילה. פתח את התריס עבור שתי הקורות, כמו גם את התריס הראשי של הלייזר.
    6. סרוק את הדגימה ובדוק את התמונה על מסך המחשב. שנה את מצב התצוגה ל- Hi-Lo בתוכנת ההדמיה. התאם את הטווח כדי לראות רוויה של ~ 50%. בדקו אם הרוויה ממורכזת בתמונה. אם לא, כוונן בזהירות את מראות ההיגוי, M1 ו- M2, כדי למקסם את עוצמת התמונה ולמרכז את עוצמת השיא.
    7. כוונן את שלב ההשהיה ומצא את עוצמת האות המרבית של SRS מדגם הדודקן. לאחר מכן המערכת מוכנה לשימוש.

2. הכנת דגימות C. elegans להדמיית מיקרוסקופיה SRS

הערה: כאורגניזמים מודל, אלגנים Caenorhabditis הוכחו להיות מאוד שימושי עבור טכניקות הדמיה מרובות. הם שקופים בכל הגוף, ולכן רקמות שונות ניתן לדמיין את החיה שלם ללא צורך ניתוח. ב C. elegans, שומנים ניטרליים מאוחסנים טיפות השומנים הממוקם במעי, אשר מורכב 20 תאי אפיתל הממוקם ביסמטי סביב לומן המעי16. תאים hypodermal וביצית גם לאחסן שומנים. הצורה העיקרית של שומנים אחסון C. elegans טיפות השומנים הם triacylglycerols (TAGs)17, אשר מייצרים אותות SRS חזקים בשל שפע של CH2 אג"ח נוכח בשרשראות חומצות השומן שלהם. סעיף זה יתמקד כיצד להכין דגימות C. elegans עבור הדמיה מיקרוסקופית SRS וכימות של רמות אחסון השומנים במעיים הכולל שלהם.

  1. הכנת שקופיות ההדמיה
    1. ראשית, להכין 2% פתרון agarose ב Hמזוקק 2O, ולוודא את כל agarose נמס לפני הכנת רפידות agarose.
    2. הוסף טיפה אחת של 2% agarose חם על שקופית ריקה (כ 100 μL) כי הוא ממוקם בין שקופיות תמיכה עם שתי שכבות של קלטת מעבדה במהירות למקם שקופית שנייה על גבי השקופית הראשונה. לחץ בעדינות כדי ליצור כרית דקה, אפילו agarose.
    3. הצב שקופיות אלה בצד במצב סגור ואל תפריד ביניהן עד שהתולעים יהיו מוכנות לטעינתן. הכן שקופיות טריות לפני כל הפעלת הדמיה, שכן הרפידות יתייבשו לאחר יום אחד.
      הערה: השתמש בתאי הדמיה מרובי בארות, אם הדמיה מספר תולעים במסכים גנטיים בעלי תפוקה גבוהה18. השתמש בהגדרות הדמיה חיה כדי לדמיין דינמיקה מרחבית-טמפורלית של חילוף החומרים של השומנים באמצעות פיתוח והזדקנות19.
  2. הרכבה של התולעים
    1. הכן את סוכן הרדמה על ידי הוספת נתרן אזיד או levamisole במאגר M9 לריכוז הסופי של 100 מ"מ או 1 מ"מ, בהתאמה.
      הערה: השתמש levamisole אם התולעים צריך להיות התאושש לאחר הדמיה עבור genotyping לאחר מסכים גנטיים.
      התראה: מספר חומרי הרדמה, כולל נתרן אזיד ולבמיסולה, מזיקים אם הם בשאיפה. ללבוש כפפות מגן ובגדים, כמו גם להשתמש מכסה המנוע אדים כימיים בעת הכנת פתרונות עבודה אלה.
    2. מניחים טיפה של חומר הרדמה לכיסוי (כ 4-5 μL עבור 10-20 תולעים).
      הערה: התאם את כמות חומר ההרדמה בהתאם למספר התולעת כדי לשמור על התולעים קרובות זו לזו ככל האפשר. שימוש בנוזל רב מדי עבור תולעים מעטות עלול לגרום לתולעים להתפשט על כרית agarose.
    3. בחר את התולעים כדי להיות בתמונה תחת מיקרוסקופיה ניתוח ולהעביר אותם טיפת סוכן הרדמה. לאחר שכל התולעים מתווספות לטיפת, הזז אותן ממקום למקום באמצעות בורר התולעים וודא שהן אינן חופפות זו לזו.
    4. הפרד את שקופיות הזכוכית (משלב 2.1) מבלי להטריד את כרית ההתעוררות.
    5. כסו את טיפת התולעת בשקופית הזכוכית המכילה את כרית ההתעוררות. ודא כרית agarose פונה לכיוון התולעים. לחלופין, טיפת ההזדקנות המרדים ניתן להוסיף גם על כרית agarose ותולעים ניתן לכסות עם כיסוי.
    6. לבסוף, סמן את מיקום התולעים באמצעות סמן קבוע בשקופית הזכוכית.

3. רכישה וניתוח של תמונות

  1. רכישת התמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופ SRS.
    1. לפני הדמיה של דגימה כלשהי, קבע את פרמטרי ההדמיה ואמת אותות SRS (כפי שמוסבר בפרוטוקול 1).
    2. טען את השקופית עם החלקה הפונה לעדשה האובייקטיבית. הפעל את מקור אור השדה הבהיר והכוון אותו אל העינית כדי לאתר את התולעים.
      הערה: השתמש בעדשה אובייקטיבית 20x כדי לדמות את אחסון השומנים במעי כולו. שקול להשתמש בעדשה אובייקטיבית 60x כדי תמונה אחסון שומן hypodermal או לכמת טיפת השומנים גודל / מספר.
    3. להביא את התולעים לפוקוס ולהתאים את מיקום המקדם בהתאם.
    4. כבה את מקור אור השדה הבהיר ועבור ליחידת סריקת הלייזר. התחל לסרוק את התולעת הראשונה בקצב סריקה מהיר (למשל, 512 x 512 פיקסלים), והתאם את המיקוד העדין כדי למצוא את תחום העניין. כדי לדגום את הדגימה הראשונה, התאם את כוחות הלייזר לרמה שבה אותות SRS אינם רוויים.
    5. עבור לקצב סריקה איטי יותר (למשל, 2 מיקרומטר/פיקסל) ולרזולוציה גבוהה יותר (למשל, 1024 x 1024 פיקסלים) כדי להשיג את תמונת ה-SRS.
      הערה: שמור על כוחות הלייזר קבועים כדי שכל מדגם יצויד במהלך הפעלת ההדמיה.
    6. שמור את תמונת ה- SRS בתבנית הרצויה המאפשרת רזולוציה גבוהה (כגון קובץ .tiff). בהתאם לתוכנת הדימות ולתוכנית ההתקנה שבהן נעשה שימוש, שמור את המיקום של התולעת הראשונה לפני המעבר לתוכנה הבאה.
    7. הדמיה מלאה של כל התולעים שהורכבו בשקופית. כבה את התריס כדי לחסום את קרני הלייזר. אל תכבה את מקור הלייזר עד שכל הדגימות יצוצו.
    8. הסר את השקופית לפני מיקום השקופית הבאה לדוגמה. חזור על שלבים 3.1.2–3.1.7.
    9. לאחר כל הדגימות כבר תמונה, לשים את מקור הלייזר על המתנה ולכבות את הציוד המשויך כולל המגבר, הגלאי, המיקרוסקופ והמחשב.
  2. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ
    1. פתח את קובצי התמונה (בדרך כלל .tiff) לכימות ב- ImageJ, על-ידי בחירת הקבצים וגרירה ושחרור שלהם לחלון ImageJ. הורד את יישומי ה- Plug-in המתאימים של ImageJ, אם אתה משתמש בתבניות מיקרוסקופ מסוימות של האולימפוס (כגון קבצי .oib).
    2. בחר את המאפיינים שיש לנתח (נתח > הגדרת מדידות). עבור כמות כוללת של אחסון שומנים, בחר ערך שטח, מינימום ומקסימום אפור וערך אפור ממוצע.
    3. השתמשו בכלי בחירת המצולע ושרטטו את האזור במעי התולעת לכימות. כדי למדוד את הפרמטרים שנבחרו בשלב 3.2.2, לחץ על נתח > מידה. חלון חדש עם תוצאות המדידה יהיה מוקפץ. חזור על שלב זה עבור כל התמונות הפתוחות.
    4. בחר את המידות עבור כל התולעים בגנוטיפ נתון והעתק/הדבק את התוצאות לגיליון אלקטרוני חדש. חזור על השלבים 3.2.1–3.2.4 עבור כל הגנוטיפים באותה הפעלת הדמיה.
    5. בחר אזור בקרבת התולעת שאין בו אות SRS, לכימות כרקע. ודא שהאזור שנבחר למדידת רקע אינו מכיל חיידקים או פסולת שיכולים גם לתת אות SRS.
    6. הפחת את הרקע פירושו ערך אפור מהמידות של כל תולעת בודדת. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן של ערכי אפור ממוצעים מופחתי רקע מכל התולעים בקבוצת גנוטיפ/בדיקה נתונה. נרמל ערך זה לממוצע של קבוצת הביקורת.
    7. לבסוף, בצע את הניתוח הסטטיסטי המתאים באמצעות הערך האפור הממוצע כמדד לרמות השומנים בכל תולעת. בדרך כלל, השתמש במבחן tשל סטודנט עבור שתי קבוצות והשתמש ב- ANOVA חד-כיווני עם מבחן השוואה מרובה מתאים עבור יותר משתי קבוצות.
      הערה: בשעת בחירת תמונות למצגת איורים, ודאו שלתמונות שנבחרו יש התפלגות עוצמת פיקסל זהה. הגדר את הבהירות והניגודיות לאותם ערכים עבור כל התמונות באותו איור (תמונה > כוונון > בהירות וחדות).

תוצאות

איתות אינסולין הוא מסלול אנדוקריני חשוב המשפיע על התפתחות, רבייה, תוחלת חיים ומטבוליזם. בתולעים, איתות אינסולין מורכב כ 40 ליגנדים פפטיד דמויי אינסולין, אורתולוג קולטן פקטורי גדילה דמויי אינסולין DAF-2, במורד הזרם PI3K / AKT קינאז מפל, ואת אורתולוג גורם שעתוק FoxO, DAF-1620. מוטציות daf-2,

Discussion

בהגנה מפני השמנת יתר והפרעות מטבוליות הקשורות שלה, מאמצי מחקר חשובים יושמו כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הרגולטוריים של הומאוסטזיס השומנים. לגילוי כמותי של מולקולות שומנים בדגימות ביולוגיות, הדמיה ללא תווית על ידי מיקרוסקופיה SRS הוכח כחלופה אמינה מבחנים ביוכימיים ושיטות כתמים אחרות. ה?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקי R01AG045183 (M.C.W.), R01AT009050 (M.C.W.), R01AG062257 (M.C.W.), DP1DK113644 (M.C.W.), מרץ של קרן דימס (M.C.W.), קרן וולש (M.C.W.), ועל ידי חוקר HHMI (M.C.W.). אנו מודים למרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) על זני C. elegans.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A/D converterOlympusAnalog Unit
AgaroseGeneMate3119For making agarose pads
Alignment tool - adapterThorlabsSM1A4For mounting the tool on scope
Alignment tool - targetThorlabsVRC2SM1For viewing IR laser
Alignment tool - tubeThorlabsSM1L40Length can vary
Autocorrelator (Optional)APEpulseCheck
Bandpass filterminicircuitsBBP-21.4+ if modulated at 20MHz or KR Electronics 2724 if modulated at 8 MHzFor signal with modulation frequency filtering
BNC cables
Dissection microscopeNikonSMZ800For handling and picking worms for imaging
DodecaneSigma-Aldrich44010Used for calibration of the SRS signal
FilterChroma Technology890/220 CARSFor removing Stokes beam
General purpose laboratory labeling tapeVWR89097For making agarose pads
Glass coverslipsVWR48393-106For covering worms for imaging
Glass microscope slideVWR16004-422For making agarose pads
Laser scanning microscopeOlympusFV3000
LensThorlabsL1: AC254-050-B
L2: AC254-075-B		For beam expander
Lock-in amplifierZurichHF2LI
Lowpass filterminicircuitsBLP-1.9+For power supply noise suppression
MirrorsThorlabsBB1-E03For relay and periscope
ObjectiveOlympusUPlanSAPO 20x 0.75, UPlanSAPO 60XW 1.20
PhotodiodeThorlabsFDS1010
Picosecond laser sourceAPEpicoEmerald
Power supplyTEKPOWERTP1342UFor photodiode, reversed 50V voltage
Sodium azideSigmaS2002For anaesthesizing the worms
Worm pickerWormStuff59-AWP

References

  1. Luppino, F. S., et al. Overweight, obesity, and depression: a systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. Archives of General Psychiatry. 67 (3), 220-229 (2010).
  2. Eckel, R. H., et al. Obesity and type 2 diabetes: what can be unified and what needs to be individualized. Diabetes Care. 34 (6), 1424-1430 (2011).
  3. Poirier, P., et al. Obesity and cardiovascular disease: pathophysiology, evaluation, and effect of weight loss. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (5), 968-976 (2006).
  4. Bhaskaran, K., et al. Body-mass index and risk of 22 specific cancers: a population-based cohort study of 5.24 million UK adults. Lancet. 384 (9945), 755-765 (2014).
  5. Shen, Y., Hu, F., Min, W. Raman imaging of small biomolecules. Annual Review of Biophysics. 48, 347-369 (2019).
  6. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  7. Syed, A., Smith, E. A. Raman imaging in cell membranes, lipid-rich organelles, and lipid bilayers. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 271-291 (2017).
  8. Thomas, G. J. Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 1-27 (1999).
  9. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 883-909 (2008).
  10. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  11. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  12. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nature Methods. 8 (2), 135-138 (2011).
  13. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  14. Wei, L., et al. Live-cell imaging of alkyne-tagged small biomolecules by stimulated Raman scattering. Nature Methods. 11 (4), 410-412 (2014).
  15. Ramachandran, P. V., Mutlu, A. S., Wang, M. C. Label-free biomedical imaging of lipids by stimulated Raman scattering microscopy. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 31 (2015).
  16. Srinivasan, S. Regulation of body fat in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Physiology. 77, 161-178 (2015).
  17. Vrablik, T. L., Petyuk, V. A., Larson, E. M., Smith, R. D., Watts, J. L. Lipidomic and proteomic analysis of Caenorhabditis elegans lipid droplets and identification of ACS-4 as a lipid droplet-associated protein. Biochimca Et Biophysica Acta. 1851 (10), 1337-1345 (2015).
  18. Yu, Y., Mutlu, A. S., Liu, H., Wang, M. C. High-throughput screens using photo-highlighting discover BMP signaling in mitochondrial lipid oxidation. Nature Communications. 8 (1), 865 (2017).
  19. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12 (10), 2081-2096 (2017).
  20. Murphy, C. T., Hu, P. J. Insulin/insulin-like growth factor signaling in C. elegans. WormBook. , 1-43 (2013).
  21. Shi, X., et al. Regulation of lipid droplet size and phospholipid composition by stearoyl-CoA desaturase. Journal of Lipid Research. 54 (9), 2504-2514 (2013).
  22. Watts, J. L., Ristow, M. Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans. Genetics. 207 (2), 413-446 (2017).
  23. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277 (5328), 942-946 (1997).
  24. Kwon, E. S., Narasimhan, S. D., Yen, K., Tissenbaum, H. A. A new DAF-16 isoform regulates longevity. Nature. 466 (7305), 498-502 (2010).
  25. Chen, A. T., et al. Longevity genes revealed by integrative analysis of isoform-specific daf-16/FoxO mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (2), 613-629 (2015).
  26. Lee, R. Y., Hench, J., Ruvkun, G. Regulation of C. elegans DAF-16 and its human ortholog FKHRL1 by the daf-2 insulin-like signaling pathway. Current Biology. 11 (24), 1950-1957 (2001).
  27. Mutlu, A. S., Gao, S. M., Zhang, H., Wang, M. C. Olfactory specificity regulates lipid metabolism through neuroendocrine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 11 (1), 1450 (2020).
  28. Chen, A. J., et al. Fingerprint Stimulated Raman Scattering imaging reveals retinoid coupling lipid metabolism and survival. Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (19), 2500-2506 (2018).
  29. Li, X., et al. Quantitative imaging of lipid synthesis and lipolysis dynamics in Caenorhabditis elegans by Stimulated Raman Scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (3), 2279-2287 (2019).
  30. Lin, C. J., Wang, M. C. Microbial metabolites regulate host lipid metabolism through NR5A-Hedgehog signalling. Nature Cell Biology. 19 (5), 550-557 (2017).
  31. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  32. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metabolism. 8 (3), 266-274 (2008).
  33. Elle, I. C., Rodkaer, S. V., Fredens, J., Faergeman, N. J. A method for measuring fatty acid oxidation in C. elegans. Worm. 1 (1), 26-30 (2012).
  34. Ezcurra, M., et al. elegans eats its own intestine to make yolk leading to multiple senescent pathologies. Current Biology. 28 (16), 2544-2556 (2018).
  35. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  36. Long, R., et al. Two-color vibrational imaging of glucose metabolism using stimulated Raman scattering. Chemical Communications. 54 (2), 152-155 (2018).
  37. Zhao, Z., Shen, Y., Hu, F., Min, W. Applications of vibrational tags in biological imaging by Raman microscopy. Analyst. 142 (21), 4018-4029 (2017).
  38. Liao, C. S., et al. In vivo and in situ spectroscopic imaging by a handheld Stimulated Raman Scattering Microscope. ACS Photonics. 5 (3), 947-954 (2018).
  39. Lee, H. J., et al. Assessing cholesterol storage in live cells and C. elegans by stimulated Raman scattering imaging of phenyl-Diyne cholesterol. Scientific Reports. 5, 7930 (2015).
  40. Wang, P., et al. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angewandte Chemie (International Edition in English). 53 (44), 11787-11792 (2014).
  41. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  42. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman Scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  43. Brinkmann, M., et al. Portable all-fiber dual-output widely tunable light source for coherent Raman imaging. Biomedical Optics Express. 10 (9), 4437-4449 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171SRSC elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved