מודל תרבית תאי אדיפוציטים לחקר ההשפעה של אפנון חלבון ומיקרו-RNA על תפקוד אדיפוציטים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להעברת אוליגונוקלאוטידים כגון RNA מפריע קטן (siRNA), מיקרו-RNA מחקה (miRs), או אנטי מיקרו-RNA (אנטי-miR) לתוך אדיפוציטים בוגרים כדי לווסת חלבון וביטוי מיקרו-RNA.

Abstract

שינוי בתפקוד אדיפוזיטים תורם לפתוגנזה של מחלות מטבוליות כולל סוכרת מסוג 2 ועמידות לאינסולין. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. אפנון הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים נותר מאתגר מאוד. מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי להבדיל בין פיברובלסטים מורין לאדיפוציטים בוגרים ולווסת את הביטוי של חלבונים ומיקרו-RNAs באדיפוציטים בוגרים באמצעות תעתיק הפוך באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA) ומיקרו-RNA מחקה (מחקה חיקוי) אוליגונוקלאוטידים. פרוטוקול תעתיק הפוך זה כרוך בדגורה של ריאגנט טרנס-זיהום והאוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בלוח תרביות התא שאליו מתווספים האדיפוציטים הבוגרים. לאחר מכן, אדיפוציטים מורשים לחבר מחדש למשטח הלוח החסידי בנוכחות קומפלקס הריאגנט אוליגונוקלאוטידים/טרנספקטריון. ניתוחים פונקציונליים כגון המחקר של איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, ליפוגנזה, ליפוליזה יכול להתבצע על אדיפוזיטים בוגרים 3T3-L1 כדי לחקור את ההשפעה של חלבון או מניפולציה מיקרו-RNA על תפקוד אדיפוזיט.

Introduction

השמנת יתר נחשבת לגורם סיכון מרכזי למחלות מטבוליות רבות, כולל תנגודת לאינסולין (IR), סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות לב וכלי דם¹. הטיפולים הנוכחיים לא הצליחו לעצור את השכיחות הגואה המתמדת של מחלות אלה, וניהול IR של חולי שמנים וחולי סוכרת נותר נושא קליני חשוב. רקמת השומן ממלאת תפקיד מכריע בשליטה על הומאוסטזיס אנרגיה, וההתרחבות הפתולוגית שלה במהלך השמנת יתר תורמת להתפתחות של IR ו- T2D^2,3. זה מדגיש את הצורך להבין טוב יותר את המנגנון המולקולרי המעורב בתפקוד אדיפוציטים לפתח טיפולים חדשים נגד מחלות הקשורות להשמנת יתר. מחקרים רבים חקרו את התפקיד של RNAs קידוד חלבון בפיזיולוגיה אדיפוציטים ואת הקשר שלהם עם השמנת יתר.

לאחרונה, הגילוי של RNAs שאינם קידוד (ncRNAs), במיוחד מיקרו-RNAs (miRs), זייף מושגים חדשניים הקשורים למנגנון הרגולציה של תוכניות ביטוי גנים. מחקרים הראו כי ncRNAs הם רגולטורים חשובים של תפקוד אדיפוציטים, וכי dysregulation שלהם ממלא תפקיד חשוב במחלות מטבוליות⁴. לכן, מניפולציה של חלבונים ו NCRNAs ב adipocytes הוא חיוני כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת השפעתם על פתולוגיות כגון T2D. עם זאת, מניפולציה של ביטוי של חלבונים ו ncRNAs ב vivo, כמו גם adipocytes ראשוני נשאר מאתגר מאוד, העדפת השימוש במודלים אדיפוציטים במבחנה.

פיברובלסטים מורין 3T3-L1 בקלות להבדיל לתוך adipocytes בוגר, פונקציונלי, תנגודת לאינסולין, שהם קו תאים מאופיין היטב המשמש לחקר תפקוד אדיפוזיט (למשל, איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, lipolysis והפרשת אדיפוקינים)^5,6,^7,8,9,10. מאפיינים אלה הופכים את 3T3-L1 לאידיפוציטים מודל אטרקטיבי כדי לווסת את הביטוי של קידוד חלבונים ו- NC-RNAs כדי לפענח את תפקידם בתפקוד אדיפוציטים ואת תפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר. למרבה הצער, בעוד 3T3-L1 פיברובלסטים קל להעביר באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית, מודיפוציטים 3T3-L1 מובחנים הם אחד מקווי התא הקשים ביותר כדי להעביר. זו הסיבה שמחקרים רבים המתמרנים ביטוי גנים בתאי 3T3-L1 התמקדו בבידול אדיפוציטים ולא בתפקוד אדיפוציטים.

במשך זמן רב, הטכניקה היעילה היחידה כדי טרנספקט adipocytes היה electroporation⁵, וזה מייגע, יקר, והוא יכול לגרום נזק לתא. מאמר זה מדווח על טכניקת טרנס-טרנס-זיהום באמצעות ריאגנט תעתיק נפוץ, אשר מפחית את הזמן מעשי עבור transfection, אין השפעה על הכדאיות התא, והוא הרבה פחות יקר מאשר electroporation. פרוטוקול זה מתאים באופן מושלם לתרגום של siRNA ואוליגונוקלאוטידים אחרים כגון מיקרו-RNA מחקה (מחקה miR) ואנטי-miRs. העיקרון של פרוטוקול טרנס-טרנס-זיהום הפוך הוא לדגור על ריאגנט הטרנס-זיהום ואת האוליגונוקלאוטידים כדי ליצור קומפלקס בצלחת תרבית התא ואז לזרוע את אדיפוציטים בוגרים לתוך הבארות. לאחר מכן, אדיפוציטים לחבר מחדש את פני הלוח דבק בנוכחות קומפלקס ריאגנט אוליגונוקלאוטידים / transfection. מתודולוגיה פשוטה, יעילה וזולה זו מאפשרת לחקור את תפקידם של RNAs ו- miRs קידוד חלבונים בתפקוד אדיפוציטים ותפקידם הפוטנציאלי במחלות הקשורות להשמנת יתר.

Protocol

הערה: השתמש בטכניקות סטריליות כדי לבצע את כל שלבי הפרוטוקול במכסה המנוע של תרבית תא זרימה למינארית. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים אודות כל הריאגנטים והציוד.

1. הבחנה של פיברובלסטים מורין 3T3-L1 לאדיפוציטים

1. לגדל את פיברובלסטים 3T3-L1 במנות 100 מ"מ בתרבות בינונית DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל שזה עתה נולד, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין(איור 1A). מניחים את הכלים באינקובטור תרבית רקמות (7% CO₂ ו 37 מעלות צלזיוס).
2. יומיים לאחר המפגש, לשנות את המדיום התרבותי, להחליף עם DMEM ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% סרום עגל עוברי (FCS), ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 0.25 mM 3-Isobutyl-1-מתילקסנתין (IBMX), 0.25 μM דקסמתזון, 5 מיקרוגרם / mL אינסולין, ו 10 μM רוזיגליצון.
   הערה: זה לוקח 5 ימים כדי להגיע למפגש כאשר התאים נזרעים ב 300,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ.
3. יומיים לאחר מכן, להחליף את המדיום התרבותי עם DMEM ללא פירובט, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין בתוספת 5 מיקרוגרם / mL אינסולין ו 10 מיקרומטר רוזיגליטזון ודגרה במשך יומיים. לאחר מכן, הזן את התאים כל יומיים עם DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 mM, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין (איור 1B).
4. מעבירים את אדיפוציטים 3T3-L1 7-8 ימים לאחר תחילת פרוטוקול הבידול.
   הערה: חשוב להגיע לרמה גבוהה של בידול (>80%) לפני transfection כדי למנוע את התפשטות של פיברובלסטים הנותרים לאחר transfection, אשר יוביל לאוכלוסייה מעורבת של תאים שעלולים להטות את התוצאות.

2. הכנת צלחות מראש

1. ביום שלפני או כמה שעות לפני transfection, להכין פתרון של סוג קולגן אני ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 30% אתנול מפתרון מלאי ב 1 מ"ג / מ"ל. הוסיפו 250 מיקרו-אל של קולגן לבאר של צלחת של 12 בארות ו-125 מיקרול לבאר של צלחת של 24 בארות, ומפזרים את הפתרון על פני הבאר.
2. השאירו את הצלחת ללא המכסה מתחת למכסה המנוע התרבותי עד שהקולגן יתייבש. יש לשטוף פעמיים עם תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (D-PBS) של דולבק.
   הערה: לוחות מראש זמינים לרכישה.

3. הכנת תערובת הטרנס-זיהום

הערה: הריכוז הסופי של siRNA הוא בין 1 ל 100 nM (1 עד 100 pmol של siRNA לכל באר של צלחת 12-באר). הריכוז הסופי של חיקוי miR הוא 10 ננומטר (10 pmol / well). קבע את הריכוז הטוב ביותר של כל siRNA, מחקה miR או אוליגונוקלאוטיד אחר לפני תחילת הניסוי כדי למנוע השפעות מחוץ למטרה. בצע ניסויי טרנספטיציה במשולש כדי להקל על ניתוח סטטיסטי של התוצאות. הכן את כל הריאגנטים עודף כדי להסביר אובדן נורמלי במהלך pipetting.

1. ערבבו לפי צנרת (נפח/נפח) את ה-siRNA (או אוליגונוקלאוטידים אחרים) עם מדיום מינימלי חיוני משופר(טבלה 1). דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הוסף את ריאגנט transfection ואת המדיום החיוני המינימלי המשופר לסירנ"א, וצינור לערבב (טבלה 1). דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (במהלך תקופה זו, המשך לסעיף 4). מוסיפים את תערובת התמהיל לכל באר של הצלחת מצופה הקולגן.

4. הכנת אדיפוציטים 3T3-L1

1. לשטוף את התאים בצלחת פטרי 100 מ"מ פעמיים עם D-PBS. הוסף 5x טריפסין לתאים (1 מ"ל לכל צלחת 100 מ"מ), הקפד לכסות את כל פני השטח עם טריפסין. המתן 30 s ולהסיר בזהירות את טריפסין.
2. לדגור על צלחת פטרי במשך 5-10 דקות ב 37 °C (57 °F) באינקובטור. הקישו על צלחת 100 מ"מ כדי לנתק את התאים.
3. יש להוסיף 10 מ"ל של DMEM ללא פירובט, גלוקוז 25 מ"מ, 10% FCS ו-1% פניצילין וסטרופומיצין כדי לנטרל את הטריפסין. בזהירות pipet המדיום למעלה ולמטה כדי לנתק את התאים הומוגניזציה ההשעיה של התא.
4. לספור את התאים באמצעות תא ספירה Malassez או מונה תאים אוטומטי, ולהתאים את הריכוז של התאים ל 6.25 x 10⁵ תאים / מ"ל של בינוני. זרע 800 μL של השעיית התא / באר של צלחת 12-well (5 x 10⁵ תאים) או 400 μl של השעיית התא / באר של צלחת 24-well (2.5 x 10⁵ תאים) המכיל את תערובת transfection.
   הערה: צלחת פטרי אחת 100 מ"מ של אדיפוציטים תאפשר הכנת צלחת אחת 12-well או צלחת אחת 24-well. צלחת 100 מ"מ מכילה בדרך כלל 6-7 x 10⁶ אדיפוציטים, אשר תואמים 5 x 10⁵ אדיפוציטים לכל באר של צלחת 12-well.
5. לדגור על הלוחות באינקובטור תרבית תאים (7% CO₂ ו 37 °C (37 °C), ולא להפריע לתאים במשך 24 שעות. למחרת, בזהירות להחליף את supernatant עם DMEM טרי ללא pyruvate, 25 mM גלוקוז, 10% FCS, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין.
   הערה: ניתן גם לזרוע את התאים לתוך קולגן מראש 48 ו 96-באר צלחות אבל לנקוט אמצעי זהירות נוספים בעת החלפת התקשורת כדי למנוע ניתוק של אדיפוציטים.

5. ניתוח פונקציונלי של אדיפוציטים 3T3-L1 שהודבקו

1. מטרת המחקר 24-48 שעות ו-48-96 שעות לאחר siRNA או miR מחקים משלוח עבור mRNA וחלבון, בהתאמה.
2. בצע ניתוחים פונקציונליים של אדיפוזיטים שהודבקו כדי לחקור איתות אינסולין, ספיגת גלוקוז, הפרשת אדיפוקין, ליפוזיס וליפוגנזה.

תוצאות

באמצעות ההליך של טרנס-טרנס-זיהום הפוך המתואר כאן כדי לווסת את הביטוי של חלבונים או מיקרו-RNAs ב 3T3-L1 adipocytes, adipocytes הוכחו כדי לשמר את המורפולוגיה שלהם לאחר transfection (איור 1B,C). ואכן, 2 ימים לאחר transfection, adipocytes היו מפוזרים היטב מחוברים לצלחת והציג טיפות שומני...

Discussion

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידול ולהדבקה של אדיפוציטים בוגרים. שיטת טרנס-טרנס-זיהום הפוכה זו היא שיטה פשוטה, חסכונית ויעילה ביותר להדבקת אוליגונוקלאוטידים כגון, אך לא רק, siRNAs, מיקרו-RNA מחקה, ואנטי מיקרו-RNAs לתוך אדיפוציטים 3T3-L1, שהוא אחד מקווי התא הקשים ביותר לבצע תעתיק. לשיטה זו יש כמה מגבל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL