JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה אינו פולשני גורם היפרגליקמיה ב zebrafish עד 8 שבועות. באמצעות פרוטוקול זה, מחקר מעמיק של ההשפעות השליליות של היפרגליקמיה יכול להתבצע.

Abstract

דגי זברה(דניו ריו)הם מודל מצוין לחקור את ההשפעות של היפרגליקמיה כרונית, סימן ההיכר של סוכרת מסוג II (T2DM). פרוטוקול טבילה חלופי זה הוא שיטה לא פולשנית, צעד חכם של גרימת היפרגליקמיה עד שמונה שבועות. דגי זברה בוגרים חשופים לסירוגין לסוכר (גלוקוז) ומים למשך 24 שעות כל אחד. דג הזברה מתחיל את הטיפול בתמיסת גלוקוז של 1% למשך שבועיים, לאחר מכן פתרון של 2% למשך שבועיים, ולבסוף פתרון של 3% במשך 4 השבועות הנותרים. בהשוואה לבקרות מטופלים במים (מתח) ומניטול (אוסמוטי), לזברה שטופלה בגלוקוז יש רמות סוכר גבוהות משמעותית בדם. הזברה שטופלה בגלוקוז מראה את רמות הסוכר בדם של פי 3 מאלה של פקדים, מה שמרמז כי לאחר ארבעה ושמונה שבועות ניתן להשיג היפרגליקמיה. היפרגליקמיה מתמשכת הייתה קשורה לחלבון חומצי גילאי מוגבר (GFAP) ולהגברת רמות הגורם הגרעיני קאפה B (NF-kB) ברשתית וירידה בתגובות פיזיולוגיות, כמו גם גירעונות קוגניטיביים המצביעים על כך שניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לדגמן סיבוכים במחלות.

Introduction

זברהפיש(דניו rerio)הופכים במהירות מודל בעלי חיים בשימוש נרחב לחקור הן מחלה קוגניציה1. הקלות של מניפולציה גנטית ושקיפות עוברית בשלבים ההתפתחותיים המוקדמים, הופכים אותם למועמדים עיקריים לחקור מחלות אנושיות עם בסיס גנטי ידוע. לדוגמה, דגי זברה שימשו לחקר תסמונת הולט-אורם, קרדיומיופתיות, מחלת כליות גלומרולוציסט, ניוון שרירים וסוכרת (DM) בין מחלות אחרות1. בנוסף, מודל זברה הוא אידיאלי בגלל גודלו הקטן של המין, קלות התחזוקה, פוריות גבוהה2,3.

הלבלב של דג הזברה דומה הן מבחינה אנטומית והן מבחינה תפקודית ללבלב היונקים4. לכן, המאפיינים הייחודיים של גודל, פוריות גבוהה, ומבנים אנדוקריניים דומים להפוך זברהפיש מועמד מתאים ללימוד סיבוכים הקשורים DM. ב זברה, ישנן שתי שיטות ניסיוניות המשמשות כדי לגרום היפרגליקמיה ממושכת האופיינית DM: זרם של גלוקוז (דוגמנות סוג 2) והפסקת הפרשת אינסולין (דוגמנות סוג 1)5,6. באופן ניסיוני, כדי לעצור את הפרשת האינסולין, תאי β הלבלב יכולים להיהרס כימית באמצעות זריקות סטרפטוזוטוצין (STZ) או Alloxan. STZ שימש בהצלחה מכרסמים וזברה, וכתוצאה מכך סיבוכים הקשורים רטינופתיה7,8,9, ליקויים קוגניטיביים10, והתחדשות הגפיים11. עם זאת, ב zebrafish, β תאים להתחדש לאחר הטיפול, גרימת "זריקות המאיץ" של STZ להיות נחוץ כדי לשמור על תנאי סוכרת12. לחלופין, ניתן להסיר את הלבלב של דג הזברה6. שניהם הליכים פולשניים מאוד, בשל זריקות מרובות, וזמן התאוששות נרחב.

לעומת זאת, היפרגליקמיה יכולה להיגרם באופן לא פולשני באמצעות חשיפה לגלוקוז אקסוגני. בפרוטוקול זה, דגים שקועים בתמיסת גלוקוז מרוכזת מאוד במשך 24 שעות5,13 או ללא הרף במשך שבועיים14,15,16. גלוקוז אקסוגני נלקח transdermally, על ידי בליעה, ו /או על פני הזימים וכתוצאה מכך רמות סוכר גבוהות בדם. מכיוון שטכניקה לא פולשנית זו אינה מבצעת מניפולציה ישירה ברמות האינסולין, היא אינה יכולה לטעון שהיא מעוררת DM מסוג 2. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לבחון סיבוכים הנגרמים על ידי היפרגליקמיה, שהוא אחד הסימפטומים העיקריים של סוג 2 DM.

לאחרונה, מוטציית הזברה pdx1-/- פותחה על ידי מניפולציה של גן homeobox הלבלב והתריסריון 1, גן הקשור לגורם הגנטי של סוג 2 DM בבני אדם. באמצעות מוטציה זו, חוקרים הצליחו לשכפל הפרעה להתפתחות הלבלב, רמת סוכר גבוהה בדם, וללמוד רטינופתיה סוכרתית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה17,18.

במאמר זה, אנו מתארים שיטת אינדוקציה היפרגליקמיה לא פולשנית המשתמשת בפרוטוקול טבילה לסירוגין. פרוטוקול זה שומר על תנאים היפרגליקמיים עד 8 שבועות עם סיבוכים הבאים שנצפו. בקצרה, דגי זברה בוגרים ממוקמים בתמיסת סוכר במשך 24 שעות ולאחר מכן פתרון מים במשך 24 שעות. בניגוד לטבילה מתמשכת בפתרונות גלוקוז חיצוניים, ימים מתחלפים בין סוכר למים מחקים את עלייתו ונפילתו של רמת הסוכר בדם בסוכרת. פרוטוקול גלוקוז לסירוגין מאפשר גם היפרגליקמיה להיות המושרה לפרקי זמן ארוכים יותר, כמו זברהפיש אינם מסוגלים לפצות על תנאי גלוקוז חיצוניים גבוהים. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים נתונים המראים כי היפרגליקמיה הנגרמת באמצעות פרוטוקול זה משנה כימיה רשתית ופיזיולוגיה.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה האמריקאית.

1. הכנת מיכלי הפתרון

  1. השג שישה מיכלים, שניים לכל קבוצת ניסוי (גלוקוז, מניטול ומים). סמן את אחד משני הטנקים 'מיכל דיור' (הוא יאכלס את הדגים) ותתייג את 'מיכל הפתרון' השני (הוא יחזיק את הפתרון).
    הערה: קבוצת הטיפול במניטול היא השליטה האוסמוטית, וקבוצת הטיפול במים היא בקרת טיפול/מתח. חשוב להפריד בין הטנקים, חברות התעופה/אבני האוויר, המכסים ואספקת הניקוי לכל קבוצת טיפול
  2. השתמש במיכל 2 L אם המספר הכולל של דגים בשימוש הוא פחות מ 20. השתמש במיכל 4 L אם המספר הכולל של דגים בשימוש הוא יותר מ 20.
    הערה: יש להשתמש ב-N של 5-10 לכל קבוצת טיפול לכל נקודת זמן דגימה.
  3. שמור את המיכלים באמבט מים ב 28-29 מעלות צלזיוס כדי לשמור על טמפרטורת המים.
  4. ביום הראשון, הניחו את הדגים בפתרונות הטיפול המתאימים להם (גלוקוז, מניטול, מים) למשך 24 שעות ('מים לטיפול'). ביום השני, העבירו את הדגים מפתרונות הטיפול שלהם למים למשך 24 שעות ('טיפול למים'). ביום השלישי מעבירים את הדגים ממים לפתרונות טיפול ('מים לטיפול'). חשיפה מתחלפת זו נמשכת עד סוף הניסוי (איור 1). מעבירים מדי יום דגי בקרה מטופלים במים למים.
  5. ודא כי הדגים ניזונים ומועברים בתוך אותו חלון של שעתיים בכל יום לאורך כל הניסוי.

2. הכנת הדגים

  1. השתמש זברה למבוגרים (4 חודשים – 1 שנה)5.
  2. להאכיל את הדגים הקרקע פתיתי Tetramin מדי יום עם ההגעה למעבדה.
  3. רשום את ה- pH ואת הטמפרטורה של כל המיכלים ותעד את מצבם הכללי של הדגים.

3. העברת דגים

  1. מעבירים דגים בכל קבוצת טיפול ממיכל הדיור למיכל הפתרון המתאים באמצעות רשת דגים סטנדרטית.
  2. מניחים את המיכל המכיל את הדג בחזרה באמבט המים, להחליף את אבן האוויר ואת מכסה הטנק. טנק זה הוא כיום "מיכל הדיור" והמיכל שהחזיק בעבר את הדגים הוא כיום "מיכל הפתרון".
  3. השלך את הפתרון הישן ונקה את המיכל, יחד עם מכסי המיכלים, חברות התעופה, אבני האוויר והרשתות כדי למנוע הצטברות של גלוקוז ומניטול.
    הערה: אין לשטוף פריטים עם סבון. השתמש במים מברשת קרצוף ייעודי / ספוג עבור כל מצב טיפול כדי לנקות כראוי את המיכלים.
  4. יבש את 'מיכלי הפתרון' החדשים שנוקו במגבת נייר. הכן את הפתרונות ליום המחרת באמצעות טנק זה. ודא שהפריטים האחרים מיובשים ומופרדים על ידי קבוצות טיפול מתאימות.
    הערה: שמור יומן של הפתרונות שהדגים מועברים מהם ולתוך כל יום, כמו גם את הפתרונות המוכנים ליום המחרת. לדוגמה: דגים מועברים מגלוקוז ל- H2O, פתרון גלוקוז חדש של 1% שהוכן למחר.

4. הכנת פתרון לאחר ההעברה

  1. הכנת פתרונות סוכר
    1. מלאו כל מיכל פתרון ב-2 ליטר (או 4 ליטר) של מי מערכת (מי מערכת מוגדרים כמים שטופלו ביחס הנכון לפתרון המלח והם באותה טמפרטורה כמו מיכלי מלאי וטיפול).
    2. למדוד את הכמות הנכונה של גלוקוז מניטול (ראה שלב 5 להלן) באמצעות סולם טעינה העליון סירות לשקול נפרד עבור כל כימיקל.
    3. מוסיפים את גלוקוז שקל או aliquot מניטול למיכל פתרון מתאים, ניקה, אשר מכיל רק מים מערכת.
    4. מערבבים את פתרונות הגלוקוז והמניטול עם מוטות ערבוב זכוכית נפרדים עד שהסוכרים מומסים לחלוטין.
    5. להחזיר מיכלי פתרון לאמבט המים ולכסות עם העפעפיים המתאימים שלהם.
  2. הכנת פתרונות מים
    1. מלא מיכלי ניסוי (2 L או 4 L) במי מערכת.
    2. החזירו את 'מיכלי הפתרון' האלה לאמבט המים וכסו במכסים המתאימים להם.

5. שינוי אחוזים

  1. לשמור על הדג בתמיסה 1% במהלך 2 השבועות הראשונים של הטיפול: 40 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.
  2. לשמור על הדג בתמיסה 2% במהלך שבועות 3 ו 4 של טיפול: 80 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.
  3. לשמור על הדג בתמיסה 3% עבור 4 השבועות האחרונים של הטיפול: 120 גרם של גלוקוז או מניטול במיכל 4 L.

6. מדידת רמות הגלוקוז בדם ואיסוף רקמות

  1. יש למרדים דגים 2 בכל פעם בתמיסת 0.02% טריקאין.
  2. ערפו את ראשם של הדגים ממש מאחורי הזימים בעזרת סכין גילוח.
  3. למדוד את ערך הסוכר בדם.
    הערה: אנו משתמשים מד גלוקוז בדם (למשל, פריסטייל לייט) כדי למדוד את רמת הגלוקוז בדם ומניחים את רצועת הבדיקה ישירות על הלב החשוף (דגימת דם לב).
  4. לנתח את הרקמה המבוקשת מהדגים (מוח, שריר וכו ').
  5. יש לאחסן רקמות שנאספו על ידי הקפאת בזק על קרח יבש ואחסון במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס, תיקון ב-4% paraformaldehyde, או הצבת פתרון חיץ לשימוש מיידי.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה (איור 1), ערכי הסוכר בדם גבוהים באופן משמעותי לאחר טיפול של 4 שבועות ו-8 שבועות (איור 2A), כאשר היפרגליקמיה מוגדרת כ-3x מהממוצעים בשליטה הן מקבוצות שטופלו במים והן מקבוצות המטופלות במניטול. בקרות המטופלות במים מועברות פנימה והחוצה מהמים מדי י...

Discussion

סוכרת היא בעיה כלל ארצית. מחקרים מראים כי עד 2030, כ 400 מיליון אנשים יהיו צורה כלשהי של סוכרת. במודלים מכרסמים, סוג 2 DM נחקר באמצעות מניפולציה גנטית. בחולדות, חולדות שומן סוכרתי צוקר (ZDF), ואת חולדות שומן Otsuka לונג-אוונס Tokushima (OLETF), מספקים מידע נוסף על ההשפעות של סוג 2 DM10. בנוסף, דיאטות ע?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

ברצוננו להכיר VPC, CJR, ו MCP לפיתוח פרוטוקול זה. EMM קיבלה תמיכה כספית מהמכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים לתואר שני בתמיכת סטודנטים לביצוע מחקר זה. עבודה זו נתמכה גם על ידי פרס מלון הפקולטה של האוניברסיטה האמריקאית ומימון באמצעות המכללה האמריקאית לאמנויות ולמדעים (שניהם ל- VPC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Airline Tubingpetsmart5291863This can be used in the tank to circulate air
Airpumppetsmart5094984This can be used in the tank to circulate air
Airstonespetsmart5149683This can be used in the tank to circulate air
D-glucoseSigmaG8270-5KG
D-mannitolAcros OrganicsAC125340050
Freestyle Lite MeterAmazonB01LMOMLTU
Freestyle Lite StripsAmazonB074ZN3H2Z
Netpetsmart5175115
TanksAmazonB0002APZO4

References

  1. Rubinstein, A. L. Zebrafish: from disease modeling to drug discovery. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 6 (2), 218-223 (2003).
  2. Gerlai, R. Associative learning in zebrafish (Danio rerio). Methods in Cell Biology. 101, 249-270 (2011).
  3. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. BioMed Research International. , (2012).
  4. Moss, J. B., et al. Regeneration of the pancreas in adult zebrafish. Diabetes. 58 (8), 1844-1851 (2009).
  5. Connaughton, V. P., Baker, C., Fonde, L., Gerardi, E., Slack, C. Alternate immersion in an external glucose solution differentially affects blood sugar values in older versus younger zebrafish adults. Zebrafish. 13 (2), 87-94 (2016).
  6. Etuk, E. U. Animal models for studying diabetes mellitus. Agriculture and Biology Journal of North America. 1 (2), 130-134 (2010).
  7. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ-induced diabetes. Current Eye Research. 23 (4), 276-284 (2001).
  8. Carmo, A., Cunha-Vaz, J. G., Carvalho, A. P., Lopes, M. C. Nitric oxide synthase activity in retinas from non-insulin-dependent diabetic Goto-Kakizaki rats: correlation with blood-retinal barrier permeability. Nitric Oxide. 4 (6), 590-596 (2000).
  9. Ramsey, D. J., Ripps, H., Qian, H. An electrophysiological study of retinal function in the diabetic female rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (11), 5116-5124 (2006).
  10. Biessels, G. J., Gispen, W. H. The impact of diabetes on cognition: what can be learned from rodent models. Neurobiology of Aging. 26 (1), 36-41 (2005).
  11. Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras, M. P. A zebrafish model of diabetes mellitus and metabolic memory. Journal of Visualized Experiments. (72), e50232 (2013).
  12. Sarras, M. P., Intine, R. V. Use of zebrafish as a disease model provides a unique window for understanding the molecular basis of diabetic metabolic memory. Research on Diabetes. , (2013).
  13. Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetologica. 44 (3), 157-163 (2007).
  14. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia induces memory impairment linked to increased acetylcholinesterase activity in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 274, 319-325 (2014).
  15. Capiotti, K. M., et al. Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 171, 58-65 (2014).
  16. Capiotti, K. M., et al. Hyperglycemia alters E-NTPDases, ecto-5'-nucleotidase, and ectosolic and cytosolic adenosine deaminase activities and expression from encephala of adult zebrafish (Danio rerio). Purinergic Signaling. 12 (2), 211-220 (2016).
  17. Ali, Z., et al. Photoreceptor Degeneration Accompanies Vascular Changes in a Zebrafish Model of Diabetic Retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (2), 43 (2020).
  18. Wiggenhauser, L. M., et al. Activation of Retinal Angiogenesis in Hyperglycemic pdx1-/- Mutants. Diabetes. 69 (5), 1020-1031 (2020).
  19. Chen, X. L., et al. Involvement of HMGB1 mediated signalling pathway in diabetic retinopathy: evidence from type 2 diabetic rats and ARPE-19 cells under diabetic condition. Journal of Ophthalmology. 97, 1598-1603 (2013).
  20. Costa, E., et al. Effects of light exposure, pH, osmolarity, and solvent on the retinal pigment epithelial toxicity of vital dyes. American Journal of Ophthalmology. 155, 705-712 (2013).
  21. Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Disease Models and Mechanisms. 3, 236-245 (2010).
  22. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Wilkinson-Berka, J. L. Dysfunction of retinal neurons and glia during diabetes. Clinical and Experimental Optometry. 88, 132-145 (2005).
  23. Fletcher, E. L., Phipps, J. A., Ward, M. M., Puthussery, T., Wilkinson-Berka, J. L. Neuronal and glial abnormality as predictors of progression of diabetic retinopathy. Current Pharmaceutical Design. 13, 2699-2712 (2007).
  24. Agardh, E., Bruun, A., Agardh, C. D. Retinal glial cell immunoreactivity and neuronal cell changes in rats with STZ- induced diabetes. Current Eye Research. 23, 276-284 (2001).
  25. Barber, A. J., Antonetti, D. A., Gardner, T. W., Group, T. P. S. R. R. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic protein in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3561-3568 (2000).
  26. Lieth, E., et al. Glial reactivity and impaired glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 815-820 (1998).
  27. Rungger-Brandle, E., Dosso, A. A., Leuenberger, P. M. Glial reactivity, an early feature of diabetic retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1971-1980 (2000).
  28. Zeng, X. X., Ng, Y. K., Ling, E. A. Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-induced diabetic rats. Visual Neuroscience. 17, 463-471 (2000).
  29. Mizutani, M., Gerhardinger, C., Lorenzi, M. Muller cell changes in human diabetic retinopathy. Diabetes. 47, 445-449 (1998).
  30. Tanvir, Z., Nelson, R., DeCicco-Skinner, K., Connaughton, V. P. One month of hyperglycemia alters spectral responses of the zebrafish photopic electroretinogram. Disease Models and Mechanisms. 11, (2018).
  31. Hancock, H. A., Kraft, T. W. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 1002-1008 (2004).
  32. Layton, C. J., Safa, R., Osborne, N. N. Oscillatory potentials and the b-wave: partial masking and interdependence in dark adaptation and diabetes in the rat. Graefe's Archives for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245, 1335-1345 (2007).
  33. Li, Q., Zemel, E., Miller, B., Perlman, I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical and morphological observations. Experimental Eye Research. 74, 615-625 (2002).
  34. Kohzaki, K., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Early inner retinal dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, 3595-3604 (2008).
  35. Phipps, J. A., Yee, P., Fletcher, E. L., Vingrys, A. J. Rod photoreceptor dysfunction in diabetes: activation, deactivation, and dark adaptation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, 3187-3194 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

171

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved