דגימה ועיבוד צחצוח אף באמצעות מיקרוסקופ וידאו ריסני דיגיטלי במהירות גבוהה – התאמה למגפת הקורונה

Summary

כדי להבטיח ניתוח פונקציונלי ריסוני מוצלח ואיכותי לאבחון PCD, שיטה מדויקת וזהירה לדגימת אפיתל נשימתי ועיבודו היא חיונית. כדי להמשיך לספק שירות אבחון PCD במהלך מגיפת COVID-19, פרוטוקול מיקרוסקופ הווידאו הריסי עודכן כדי לכלול אמצעי בקרת זיהום מתאימים.

Abstract

דיסקינזיה ריסנית ראשונית (PCD) היא סיליופתיה גנטית, המובילה למחלה אוטוסינופולמונרית משמעותית. אבחון PCD לעתים קרובות מתפספס או מתעכב בגלל אתגרים עם שיטות אבחון שונות. מיקרוסקופ וידאו ריסני, באמצעות מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי במהירות גבוהה (DHSV), אחד מכלי האבחון עבור PCD, נחשב לשיטה האופטימלית לביצוע ניתוח פונקציונלי ריסני (CFA), הכולל ניתוח תדירות פעימות ריסניות (CBF) ודפוס פעימות (CBP). עם זאת, ל-DHSV אין נוהל הפעלה סטנדרטי שפורסם לעיבוד וניתוח דגימות. הוא משתמש גם באפיתל נשימתי חי, נושא משמעותי בבקרת זיהומים במהלך מגיפת COVID-19. כדי להמשיך לספק שירות אבחון במהלך משבר בריאותי זה, פרוטוקול מיקרוסקופ הווידיאו הריסי הותאם כך שיכלול אמצעי בקרת זיהום נאותים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מתוקן לדגימה ועיבוד מעבדה של דגימות נשימה ריסניות, תוך הדגשת התאמות שנעשו כדי לעמוד באמצעי בקרת הזיהום של COVID-19. מתוארות תוצאות מייצגות של CFA מדגימות צחצוח אף שהתקבלו מ -16 נבדקים בריאים, שעובדו ונותחו על פי פרוטוקול זה. אנו גם ממחישים את החשיבות של השגה ועיבוד של רצועות אפיתל באיכות אופטימלית, שכן דגימות שאינן עומדות בקריטריונים לבחירת איכות מאפשרות כעת CFA, מה שעלול להפחית את אמינות האבחון ואת היעילות של טכניקה זו.

Introduction

דיסקינזיה ריסנית ראשונית (PCD) היא סיליופתיה תנועתית הטרוגנית תורשתית, שבה ריסונים נשימתיים הם נייחים, איטיים או דיסקינטיים, מה שמוביל לפגיעה בסילוק הליחה ולמחלה אוטו-סינו-פולמונרית כרונית 1,2,3,4. הביטויים הקליניים של PCD הם שיעול רטוב כרוני וגודש כרוני באף החל מינקות מוקדמת, זיהומים חוזרים או כרוניים בדרכי הנשימה העליונות והתחתונות המובילים לברונכיאקטזיס, ודלקת אוזניים חוזרת או כרונית וסינוסיטיס ^5,6,7. כמחצית מחולי PCD מציגים פגמים צדדיים באיברים כגון situs inversus או situs ambiguus. חלק מהחולים מציגים גם בעיות פוריות עקב זרע לא תנועתי אצל גברים וריסים תנועתיים בחצוצרות אצל נשים ^1,2,8. PCD הוא נדיר, אך השכיחות קשה להגדרה, ונעה בין 1:10,000 ל-1:20,000 ^9,10. עם זאת, השכיחות האמיתית של PCD נחשבת גבוהה יותר בשל קשיים באבחון והיעדר חשד קליני. הסימפטומים של PCD מחקים ביטויים נשימתיים נפוצים של מצבים נשימתיים חריפים או כרוניים אחרים, והאתגרים האבחנתיים של אישור האבחנה ידועים היטב, מה שמוביל לטיפול ומעקב לקויים 2,5,9,11.

מיקרוסקופ וידאו ריסני, באמצעות מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי במהירות גבוהה (DHSV), הוא אחד מכלי האבחון עבור PCD 4,8,12,13. DHSV נחשבת לשיטה האופטימלית לביצוע ניתוח פונקציונלי ריסני (CFA), הכולל ניתוח תדירות פעימות ריסניות (CBF) ותבנית פעימות (CBP) 2,14,15,16. DHSV משתמש באפיתל נשימתי חי, המתקבל בדרך כלל מצחצוח אף¹³.

לאור התפרצות COVID-19 הנוכחית, אישור של אבחנה PCD חשוב כעת עוד יותר מכיוון שהראיות מצביעות על כך שמחלות נשימה בסיסיות עלולות להוביל לתוצאות גרועות יותר לאחר הידבקות ב- COVID-19^17,18. שירות אבחון PCD בטוח ויעיל במהלך המגפה הנוכחית יאפשר גם לחולי PCD מאומתים ליהנות מאמצעי הגנה נוספים, בהשוואה לאוכלוסייה הכללית¹⁹.

העברת COVID-19 מתרחשת בעיקר באמצעות התפשטות טיפתית²⁰. פוטנציאל גבוה של העברה מחולים אסימפטומטיים (או סימפטומטיים מינימליים) מוצע על ידי עומס נגיפי גבוה בדגימת אף²⁰. בנוסף, אם חלקיקים נגיפיים הופכים לאירוסוליים, הם נשארים באוויר לפחות 3 שעות²¹. לכן, עובדי רפואה נשימתית נחשפים למאגר גבוה של עומס נגיפי בעת ביצוע טיפול קליני ואיסוף דגימות לטכניקות אבחון²². יתר על כן, מניפולציה של דגימות נשימה חיות חושפת את הטכנאי לזיהום COVID-19. בעוד שהמלצות מומלצות לרופאים נשימתיים ומנתחי אף אוזן גרון המטפלים בחולי COVID-19 מיושמות²³, חסרות המלצות לביצוע DHSV במהלך מגיפת COVID-19.

על מנת להמשיך ולספק שירות אבחון PCD, תוך הבטחת בטיחותם של עובד הבריאות (ביצוע איסוף דגימות) והטכנאי (ביצוע עיבוד דגימות), היה צורך להתאים את פרוטוקול מיקרוסקופ הווידאו הריסי במהלך מגפת הקורונה. הטכניקה של videomicroscopy ciliary מוגבל כיום לשירות מחקר ומרכזי אבחון מיוחדים, כמו CFA דורש הכשרה רבה וניסיון. יתר על כן, כיום, קיים מחסור בסטנדרטיזציה ובנוהל הפעלה מדויק לעיבוד וניתוח דגימות באמצעות DHSV ^4,13.

מטרת מאמר זה היא לתאר נהלי פעולה סטנדרטיים עבור DHSV, תוך התייחסות מיוחדת לאמצעי בקרת זיהום ובטיחות בעת דגימה ועיבוד אפיתל אף חי. זה יאפשר אבחון וטיפול PCD באיכות גבוהה להמשיך, למרות התפרצות COVID-19 הנוכחית.

Protocol

האישור התקבל מוועדת האתיקה של בית החולים בליאז' ומהמחלקה האוניברסיטאית להיגיינה והגנה על הבריאות בעבודה.

1. דגימת אפיתל ריסני נשימתי

1. יש לוודא שהנבדקים נקיים מזיהום במשך 4-6 שבועות לפחות, וללא תרופות באף ובשאיפה, לפני הדגימה.
2. הכינו תוספת להכנת M199: תוספת תרבית תאים בינונית 199 (M199) (500 מ"ל) עם תמיסה אנטיביוטית (5 מ"ל סטרפטומיצין/פניצילין (50 מק"ג/מ"ל)) ותמיסה אנטי-פטרייתית (5 מ"ל אמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל)).
3. הכינו 2 (אחד לכל נחיר) 15 מ"ל צינורות חרוטיים עם מכסים, ומלאו כל אחד מהם עם 3 מ"ל של M199 מוסף.
4. הכינו מברשת ציטולוגיה של הסימפונות (עובי: 2 מ"מ ואורך: 11 מ"מ). חתכו את קצה החוט כדי לוודא שהמברשת תהיה באורך של כ-15 ס"מ (איור 1A,B). כדי להחזיק את המברשת בעת ביצוע צחצוח האף, השתמשו במלקחיים לאף של וייל-בלייקסלי (איור 1B).
5. הסתגלות לקורונה: הימנע מעיבוד דגימת אפיתל אף חי במצב לא ידוע ל- COVID-19, בדוק את המטופל ל- COVID-19 48 עד 72 שעות לפני צחצוח האף למיקרוסקופ וידאו ריסני. בדיקת COVID-19 זו מורכבת מתגובת שרשרת פולימראז מדגימת מטוש אף^{ולוע 24,25}. מכיוון שסטטוס המטופל ל-COVID-19 אינו ידוע בשלב זה, רופאים ואנשי צוות חייבים להיות מוגנים כראוי^23,26, כולל מסכת FFP2, כפפות, מגן פנים או משקפי מגן^, וחלוק עמיד במים עם שרוולים ארוכים. במקרה של בדיקת PCR לא זמינה, בלתי אפשרית או מוטלת בספק, ביצע את כל עיבוד צחצוח האף במעבדה לבטיחות ביולוגית L2. במקרה של סטטוס חיובי ל-COVID-19, דחו את בדיקת אבחון ה-PCD ושקלו גישות חלופיות לניהול המטופל.
   זהירות: דגימת מטוש אף ולוע זו לבדיקת COVID-19 עלולה לגרום לדיסקינזיה ריסנית משנית על ידי פגיעה באפיתל ריסני הנשימה באף^27,28. כדי למנוע זאת, להציג צמר גפן דק לתוך חלל האף עד nasopharynx תחת שליטה אנדוסקופית נוקשה, הימנעות פגיעה טורבינטים או מחיצה. לאחר מכן הדגימה נלקחת מן nasopharynx ולהסיר את צמר גפן תחת שליטה של אנדוסקופ נוקשה. עם ציוד מתאים, אנדוסקופיה נוקשה 0° מבוצעת בקלות במבוגרים וילדים ללא טראומה.

2. השגת דגימות אפיתל ריסני נשימתי

הסתגלות ל-COVID-19: גם אם סטטוס COVID-19 של המטופל שלילי, בשל שיעור שלילי כוזב, המטופל מתבקש לשמור מסכה כירורגית על פיו במהלך ההליך, וכפפות, מסכת FFP2 ומגן פנים נלבשים על ידי הרופא.

1. הכנת צחצוח אף
   1. בקשו מהמטופל לקנח את האף.
   2. יש לבצע צחצוח אף תחת אנדוסקופיה של האף או עיוור. אם משתמשים באנדוסקופיה של האף, יש לבדוק את 2 הנחיריים לפני צחצוח האף (אין לחזור על הפעולה אם נעשה 48-72 קודם לכן עבור ספוגית אף COVID-19). הבדיקה מאפשרת לאמת את מצב הרירית (רמה גבוהה של דלקת עלולה לגרום לדימום בעת ביצוע צחצוח האף, ...), את מצב הטורבינאט התחתון (כדי לשלול נוכחות של טלנגיאקטזיה למשל), ואם המחיצה ישרה (איור 1C).
   3. בקשו מהמטופל לשכב, או לשבת בנוחות, כשהראש מונח לאחור על הכיסא (מכיוון שצחצוח האף גורם לרפלקס להזיז את הראש לאחור). מטפל שני מחזיק את הראש במהלך צחצוח האף, במיוחד אצל ילדים.
   4. נערו את המברשת בתוסף M199 לפני צחצוח האף (הרטבת המברשת מפחיתה את הגירוי מההברשה).
      הערה: ניתן להרטיב את המברשת בתוך תוספת M199; אם החולה אלרגי לאנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין נמצאים בתווך תרבית התא המשלימה), להרטיב את המברשת במי מלח.
2. צחצוח אף
   1. יש להכניס בעדינות את צחצוח האף ללא הרדמה מקומית או כללית¹³. אם באמצעות אנדוסקופיה האף, מניחים את האנדוסקופ בכניסה לאף כדי לדמיין את טורבינאט האף הנחות, ולאחר מכן להכניס את מברשת הציטולוגיה באף. אם אתם מבצעים צחצוח אף "מסונוור", הכניסו את המברשת לאף, בעקבות רצפת האף (איור 1D).
      הערה: חלק ממרכזי האבחון משתמשים בהרדמה מקומית עם טמפון של נפזולין לביצוע צחצוח אף.
   2. העבר את המברשת אחורית וקדמית מספר פעמים על החלק האחורי של טורבינאט האף התחתון ולאחר מכן נסוג. המפעיל צריך להרגיש שהמברשת משפשפת את האפיתל, והמטופל עלול להרגיש עין דומעית חד צדדית בצד הצחצוח.
      הערה: אם צחצוח האף מבוצע קדמי מדי, לא יתקבלו תאים ריסונים, מכיוון שחלל האף הקדמי מרופד באפיתל מעבר לא ריסני.
   3. לאחר הדגימה, הניחו מיד דגימות צחצוח אף בתוך מדיום התרבית. רצועות אפיתל נשימתי המתקבלות נעקרות ממקומן על-ידי התסיסה של המברשת בצינור המכיל את תוספת M199, ואז סוגרות את הצינור (איור 1E).
   4. הסתגלות לקורונה: אין לעקור רצועות אפיתל על ידי התסיסה של המברשת בתוסף M199 מיד לאחר הדגימה. הניחו את המברשת בצינור, חתכו את החוט כך שיוכל להיכנס לחלוטין לתוך הצינור, וסגרו את הצינור מיד. הכניסו את הדגימה לשקית כפולה אטומה.

איור 1: טכניקת צחצוח האף. (A) מברשת ציטולוגיה שלמה של הסימפונות (B) מוכנה למברשת: קצה ההברשה של החוט נחתך (באורך של כ-15 ס"מ) ומוחזק על ידי מלקחיים לאף של וייל-בלייקסלי(C) מבט אנדוסקופי על חלל האף: מחיצה (1) טורבינאט נחות (2) וטורבינאט אמצעי (3) (D) צחצוח האף מתבצע בחלק האחורי של הטורבינאט התחתון (2). מחיצת אף (1) טורבינאט אמצעי (3). (E) רצועות האפיתל הנשימתי נעקרות על ידי ניעור המברשת בתווך תרבית התאים M199 המוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. עיבוד אפיתל נשימתי

1. נתח דגימות צחצוח אף תחת מיקרוסקופ תוך 9 שעות לאחר הדגימה, מכיוון שגם CBF וגם CBP יציבים במסגרת זמן זו (נתונים שלא פורסמו).
2. השתמש במיקרוסקופ אור זקוף או הפוך, עם ניגודיות פאזה טבילת שמן x100 או עדשת ניגודיות התאבכות. באופן אידיאלי, הניחו את המיקרוסקופ על שולחן נגד רטט מכיוון שהכאה ריסונית עשויה להיות כפופה לממצאים עקב תנודות חיצוניות (למשל מספסל המעבדה)¹³.

הסתגלות לקורונה: המפעיל משתמש בציוד מגן אישי לביצוע עיבוד האף, כולל מסכת FFP2, כפפות וחלוק עמיד במים עם שרוולים ארוכים.

3. הכן את תא ההדמיה.
   1. השהו את רצועות האפיתל המרוסנות בתא הדמיה פתוח שנבנה במעבדה, ואפשרו לריסונים לפעום בחופשיות תוך כדי ניתוח תחת המיקרוסקופ. תא זה נוצר על ידי הפרדה של חלקת כיסוי (22 מ"מ x 40 מ"מ) ומגלשת זכוכית על ידי שתי החלקות כיסוי מרובעות סמוכות (20 מ"מ x 20 מ"מ), המופרדות במרחק של 15 מ"מ, ומודבקות על שקופית זכוכית¹² (איור 2, איור 4A).

הסתגלות לקורונה: התא שנבנה במעבדה המתואר לעיל פתוח, ומאפשר חילופי גזים ולחות בין הדגימה לסביבה¹³. בהקשר של מגפת COVID-19, ניתן להשתמש בתא הדמיה סגור באמצעות ספייסר תקוע דו-צדדי, בעומק 0.25 מ"מ (איור 3, איור 4B). הספייסר תקוע על מגלשת הזכוכית, ואז מחליק כיסוי (22 מ"מ x 40 מ"מ) תקוע על גבי הספייסר.

איור 2: הרכבה של החדר הפתוח שנבנה במעבדה. (A) 2 הכיסויים המרובעים (20 מ"מ x 20 מ"מ) מונחים על מגלשת הזכוכית. (B) פתקי הכיסוי המרובעים מופרדים במרחק של כ-15 מ"מ, ומודבקים על מגלשת הזכוכית. (C) התא ממולא בין שני פתקי הכיסוי המרובעים הסמוכים בדגימה קטנה (כ-60 מיקרוליטר) של אפיתל ריסוני בתוספת M199. (D) תלוש כיסוי מלבני ארוך (22 מ"מ x 40 מ"מ) מונח על שני פתקי הכיסוי המרובעים הסמוכים, ומכסה את החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הרכבה של התא הסגור באמצעות ספייסר תקוע דו-צדדי. (A) מגלשת הזכוכית והספייסר התקוע הדו-צדדי. (B) ההגנה מוסרת בצד אחד של הספייסר, ואז הספייסר תקוע על מגלשת הזכוכית. (C) ההגנה מוסרת מהצד השני של הספייסר התקוע הדו-צדדי, ואז הספייסר מתמלא בדגימה קטנה (כ-60 מיקרוליטר) של אפיתל ריסני בתוספת M199. (D) מכסה מלבני ארוך (22 מ"מ x 40 מ"מ) תקוע על הספייסר וסוגר את החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דיאגרמה סכמטית המציגה את תאי התצוגה החזותית העיקריים המשמשים לביצוע מיקרוסקופ וידאו ריסני באמצעות מיקרוסקופ וידאו דיגיטלי במהירות גבוהה (DHSV). (A) טכניקת הטיפה התלויה הפתוחה: הדגימה המרוסקת תלויה בטיפת מדיום תרבית תאים בתא פתוח שנוצר על ידי הפרדה של תלוש כיסוי ושקופית זכוכית על ידי שני כיסויים סמוכים. (B) טכניקת הטיפה התלויה הסגורה: הדגימה המרוסקת תלויה בטיפת תווך תרבית תאים בתא סגור שנוצר על ידי ספייסר הדחוק בין צד זכוכית לחלקת כיסוי. הספייסר נדבק בחוזקה הן למגלשת הזכוכית והן למחליק הכיסוי. הועתק ושונה מ Kempeneers et ^al.13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. שליטה בטמפרטורה
   1. הקיפו את המיקרוסקופ בניילון בועות (איור 5A,B).
   2. חברו את מחמם העדשה סביב המטרה באמצעות רצועת סקוטש (איור 5C)
   3. הפעל את בקר מחמם העדשות שעה אחת לפני ביצוע בדיקת טמפרטורת הבקרה.
   4. הפעל את המיקרוסקופ ובדוק שהגדרת המיקרוסקופ נעשתה, שכן כמות האור דרך הדגימה יכולה לשנות את הטמפרטורה בשקופית.
   5. הפעילו את בקר הקופסה המחוממת (איור 5D).
   6. ודא שבדיקת הייחוס פועלת כראוי לפני שתתחיל. להחזיק את קצה הבדיקה התייחסות בין האצבעות; זה צריך למדוד את טמפרטורת הגוף.
   7. שים מדיה חופשית במרכז השקופית, בין שני פתקי הכיסוי המרובעים הסמוכים (20 מ"מ x 20 מ"מ) המודבקים עליה.
   8. מקם את קצה בדיקת הייחוס ב- M199 המשלים. יש לכסות בכיסוי מלבני (22 מ"מ x 40 מ"מ). ודא כי הבדיקה מוקפת לחלוטין על ידי מדיה (אחרת הטמפרטורה עלולה לרדת).
   9. הסתגלות לקורונה: כדי לבצע את בקרת הטמפרטורה בתא הסגור באמצעות ספייסר, חתכו צד אחד של הספייסר (חור זה חייב להיות באותו גודל כמו גשושית הייחוס). הדביקו את הספייסר על שקופית הזכוכית, הניחו מדיה חופשית במרכז הספייסר. הניחו את קצה גשושית הייחוס לתוך התמיסה, דרך החור של הספייסר, ואז הדביקו כיסוי מלבני (22 מ"מ x 40 מ"מ) על הספייסר.
   10. מניחים את המגלשה בצלחת של הקופסה המחוממת. סגור את הקופסה המחוממת עם המכסה.
   11. הוסיפו שמן על המטרה של טבילת שמן.
   12. מניחים את הקופסה המחוממת על במת המיקרוסקופ.
   13. התאם את טמפרטורת הצלחת והמכסה (טמפרטורת המכסה צריכה להיות גבוהה ב -2 ° C מטמפרטורת הצלחת כדי למנוע עיבוי) כדי למדוד 37 ° C עם בדיקת הייחוס בתווך.
   14. המתן 5 דקות (הזמן הדרוש כדי להעלות את הטמפרטורה של הדגימה ל 37 ° C).
   15. כוונן את המטרה, קרב אותה לשקופית עד שתיגע בקצה העדשה בכיסוי.
   16. הזיזו את המטרה כדי לראות את מרכז הגשושית במיקרוסקופ.
       הערה: ודא שהבדיקה נראית על מסך המחשב (כדי לבדוק שמערכת המצלמה פועלת לפני שאתה מסתכל על הדגימה המרוססת). בעת צפייה במרכז הגשוש, המסך שחור לחלוטין.
   17. כוונן את הטמפרטורה של מחמם העדשות (כדי לפצות על אובדן הטמפרטורה כאשר עדשת טבילת השמן באה במגע עם הכיסוי). הקפד למדוד 37 ° C עם בדיקת הייחוס בתוך התווך כאשר המטרה נוגעת בהחלקת הכיסוי.
       הערה: באופן אידיאלי, עבוד בחדר עם טמפרטורה מבוקרת, כך שהטמפרטורות שהוגדרו לא ישתנו. אם טמפרטורת החדר אינה נשלטת, עליך לבצע בדיקת בקרת טמפרטורה זו מדי יום לפני ביצוע וידאומיקרוסקופיה ריסנית.
   18. לאחר בדיקת הטמפרטורה, הסר את המגלשה מהקופסה המחוממת.
   19. נקו את המגלשה ואת קצה בדיקת הייחוס עם אלכוהול והניחו בצד.
   20. נקה את העדשה עם איזופרופנול ורקמות ניקוי עדשה בתנועות סיבוביות.

איור 5: ציוד המשמש במעבדת DHSV. (A) המיקרוסקופ המצויד בעדשת ניגודיות פאזה טבילת שמן 100x, מונח על שולחן נגד רטט כדי למנוע שתנודות חיצוניות יגרמו לממצאים לניתוח פונקציונלי ריסני (B) המיקרוסקופ מוקף בניילון בועות כדי למנוע איבוד חום מאוויר הסביבה. (C) מטרת טבילת השמן יוצרת איבוד חום. ניתן למנוע זאת באמצעות מחמם עדשות (חצים). (D) הדגימה מחוממת באמצעות קופסת חימום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. הכנת דגימות אפיתל ריסניות נשימתיות

1. נערו את הצינורית בעדינות כדי לאפשר לריסונים להתפשט ברחבי הצינור (כדי למנוע מריסונים להיתקע על רצועות ריסונים אחרות, ריר או פסולת, המונעים מהם לפעום בחופשיות).
   הערה: שלב זה חיוני להשגת "קצוות אופטימליים" של אפיתל ריסוני (איור 12).
2. למשוך כ 50 μL של אפיתל ciliated בתוספת M199 באמצע הצינור עם פיפטה.
3. הניחו את הדגימה על התא שנבנה במעבדה (בין שני פתקי הכיסוי המרובעים הסמוכים (20 מ"מ x 20 מ"מ)) וכסו בכיסוי מלבני (22 מ"מ x 40 מ"מ). היזהרו לא להוסיף בועות.
4. הסתגלות לקורונה: בצע שלבים 4.1-4.3 בארון בטיחות מיקרוביולוגי. נוהל בארון הבטיחות המיקרוביולוגי.
   1. הפעילו את ארון הבטיחות המיקרוביולוגי 10 דקות לפני הכנת הדגימה (כדי לוודא שהסביבה סטרילית).
   2. לפני כל טיפול, יש לחטא את כל ארון הבטיחות המיקרוביולוגי באתנול 70%.
   3. יש לחטא את כל החומר הדרוש באתנול 70% לפני הכנסתו לארון הבטיחות המיקרוביולוגי.
   4. פתח את צינורות החרוט של 15 מ"ל המכילים את הדגימות רק פעם אחת מתחת לארון הבטיחות המיקרוביולוגי, ולאחר מכן עקר רצועות אפיתל על ידי תסיסה של המברשת (באמצעות מלקחיים לאף של וייל-בלייקסלי) בתוספת M199.
   5. הדביקו את הספייסר על מגלשת הזכוכית והסר את ההגנה מהספייסר התקוע הדו-צדדי.
   6. נערו את הצינורית בעדינות כדי לאפשר לריסונים להתפשט ברחבי הצינור.
   7. משכו דגימה קטנה של אפיתל ריסני בתוסף M199 מאמצע הצינור עם פיפטה (כ-60 מיקרוליטר) ומלאו את הספייסר.
   8. הדביקו את הכיסוי המלבני (22 מ"מ x 40 מ"מ) על המרווח כדי לסגור את התא.
   9. יש לחטא את המגלשה לפני היציאה מארון הבטיחות המיקרוביולוגי.
   10. הסר את המגלשה מארון הבטיחות המיקרוביולוגי.
   11. החליפו כפפות ביציאה מארון הבטיחות המיקרוביולוגי.
   12. יש להמתין 10 דקות לפני כיבוי ארון הבטיחות המיקרוביולוגי לאחר השימוש (כדי לוודא שסביבת ארון הבטיחות המיקרוביולוגי סטרילית לפני סגירת הדלת).
5. מניחים את המגלשה בצלחת של הקופסה המחוממת. סגור את הקופסה המחוממת עם המכסה.
6. הוסיפו שמן על המטרה של טבילת שמן.
7. מניחים את הקופסה המחוממת על במת המיקרוסקופ.
8. הפעל את הקופסה המחוממת ואת מחמם העדשות.
   הערה: יש להפעיל את מחמם העדשות שעה אחת לפני השימוש.
9. התאם את הגדרות הטמפרטורה של הקופסה המחוממת ובקרי מחמם העדשות בהתאם לערכים שהתקבלו בשלב 3.4.
10. המתן 5 דקות (הזמן הדרוש לעליית הטמפרטורה של הדגימה עד 37 מעלות צלזיוס בעת שימוש בהגדרות שנקבעו מראש הן עבור הקופסה המחוממת והן עבור תנור החימום האובייקטיבי).
11. התקרבו למטרה עד לשקופית עד שנגעו בקצה העדשה בכיסוי.

5. הדמיה של קצוות ריסניים נשימתיים

1. קבע את מצלמת הווידאו המהירה למיקרוסקופ, חבר את המצלמה למחשב והפעל את המצלמה.
2. הפעל את המחשב.
3. חבר את מצלמת הווידיאו מיקרוסקופיה הדיגיטלית במהירות גבוהה למחשב (כך שהתמונה הנצפית דרך עדשות העין תוקרן על הצג) באמצעות התוכנה.
   1. פתח את התוכנה ולאחר מכן התפריט הראשי נפתח באופן אוטומטי (איור 6A).
      הערה: התוכנה היא התוכנה המשמשת במעבדה לרכישת תמונה ועיבוד. המערכת מאפשרת להקליט ולהשמיע רצפי וידאו בקצב פריימים מופחת או פריים אחר פריים. ניתן להוריד אותו בחינם.
   2. מצלמה פתוחה (איור 6A).
   3. כאשר מסנן ספירת המצלמה מופיע, בחר אישור (איור 6B).
   4. בחר רענן רשימה; בחר את שם המצלמה; בחר את הממשק: מומחה ולאחר מכן בחר פתח (איור 6C).
   5. בקו הבקרה של המצלמה בחלק העליון של תפריט הדו-שיח המעוגנת, בחר Live (Figure 6D).
   6. בחרו 'הפעל' כדי להציג את התמונה ו'עצור' כדי לסיים את הצפייה (איור 6D).

איור 6: תיאור השימוש בתוכנה: הדמיה של קצוות ריסניים נשימתיים על הצג. (A) התפריט הראשי מופיע ישירות בעת פתיחת התוכנה. (ב) סגור את מסנן ספירת המצלמה. (C) בחר את המצלמה ובחר ממשק: מומחה. (D) מצב החי מאפשר לדמיין על הצג את התמונה הנראית דרך המיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. כוונן את הגדרת רכישת המצלמה (בפינה השמאלית העליונה) (איור 7).
   1. ב ״הגדרות רכישה ״, בחר /י ״מצלמה״ ולאחר מכן התאם את קצב הפריימים: קצב (Hz): 500 (ראה להלן) (איור 7A).
   2. בהגדרות רכישה, בחר מצלמה ולאחר מכן התאם את אזור העניין (ROI) (איור 7A).
      הערה: החזר ההשקעה מחושב באמצעות סולם מדורג שנצפה עם המטרה x100 טבילת שמן ומוקרן על הצג, כדי להגדיר את מספר הפיקסלים המתאימים ל- 50 מיקרומטר (מכיוון שברצונך להקליט קצוות ריסונים בגודל של כ- 50 מיקרומטר (ראה להלן)).
   3. בהגדרות רכישה, בחר הקלט, ולאחר מכן התאם את משך הווידאו ואת המספר הכולל של פריימים שהוקלטו (משך של 2 שניות, מתאים ל- 1000 פריימים אם קצב הפריימים שנבחר הוא 5OO Hz) (איור 7B).
      הערה: מניסיוננו, יש צורך באורך וידאו מינימלי של 2 שניות כדי לאפשר ניתוח מלא של CBF ו- CBP.
   4. בחר File ולאחר מכן Save Camera Cfg כדי לשמור את הגדרת הרכישה החדשה (הזן שם ובמידת הצורך הערה עבור תצורה חדשה זו) (איור 7C,D).
   5. כדי לפתוח תצורת מצלמה חדשה זו, פתח קובץ וטען Cfg מצלמה (איור 7C).

איור 7: תיאור השימוש בתוכנה: התאמת הגדרות רכישת המצלמה להקלטת וידאו של הקצוות המכים בקצוות. (A) בהגדרת הרכישה מצלמה, התאם את אזור העניין (ROI) ואת קצב הפריימים להקלטת וידאו (Rate). (ב) בהגדרת הרכישה רשומה, התאם את משך הקלטת הווידאו (מספר הפריימים הדרושים למשך ההקלטה שנבחר, בהתאם לקצב הפריימים שנבחר קודם לכן). (C) ניתן לשמור הגדרות תצורה חדשות אלה של המצלמה באמצעות הפונקציה Save camera Cfg . טען מצלמה Cfg מאפשר לפתוח מחדש את הגדרות התצורה שנשמרו לשימוש נוסף. (D) ניתן לתת שם להגדרות תצורת המצלמה החדשות, ולהוסיף הערה במידת הצורך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. צפו דרך עדשות עיניים וחפשו תאים או פסולת בתוך הדגימה, ואז התמקצעו.
6. ודא שהתמונה גלויה על הצג, ושפר את איכות התמונה על-ידי התאמת המעבה (ואת מנסרת DIC אם משתמשים בעדשת ניגודיות הפרעה), וכוונן את המיקוד במידת הצורך.
7. חפש רצועות של אפיתל ciliated.

6. בחירת קצוות ריסונים נשימתיים

הערה: המערכת הניסויית מאפשרת לצפות בריסונים פועמים בשלושה מישורים נפרדים: פרופיל צדדי, פועם ישירות לכיוון הצופה, ומלמעלה ישירות (איור 8).

איור 8: טכניקת DHSV מאפשרת לראות ריסונים פועמים בשלושה מישורים נפרדים. (A) בפרופיל הצידי. (ב) מכות ישירות כלפי המתבונן ו-(ג) ישירות מלמעלה. הועתק מתוך Kempeneers et ^al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. רשום רק קצוות אפיתל שלמים ללא הפרעה שאורכם לפחות 50 מיקרומטר.
2. עבור רשומות שנעשו בפרופיל הצידי, קבעו את איכות הקצה על פי שיטת הניקוד Thomas et ^al.29 (איור 9). השתמשו רק בקצוות רגילים (איור 9A) או בקצוות עם הקרנות מינוריות (איור 9B) לניתוח פונקציונלי ריסני. אל תכלול תאים מבודדים (איור 9E).

איור 9: תמונה מייצגת של שיטת הניקוד על ידי Thomas et al²⁹ עבור האיכות השונה של קצוות אפיתל ciliated. (A) קצה רגיל: מוגדר כרצועת אפיתליה ריסנית אחידה שלמה באורך > 50 מיקרומטר (B) קצה ריסוני עם בליטות מינוריות: מוגדר כקצה באורך >50 מיקרומטר, עם תאים המקרינים מקו קצה האפיתל, אך ללא נקודה של קרום התא האפי המוקרנת מעל קצות הריסים על התאים הסמוכים (Cקצה ריסוני עם בליטות עיקריות: מוגדר כקצה באורך >50 מיקרומטר, כאשר תאים מקרינים מקו קצה האפיתל, כאשר לפחות נקודה אחת של קרום התא האפי מקרינה מעל קצות הריסים על התאים הסמוכים (D) תא ריסוני מבודד: מוגדר כתא הריסי היחיד בקצה אפיתל באורך >50 מיקרומטר (Eתאים בודדים: מוגדרים כתאים ריסונים שאין ביניהם מגע בינם לבין עצמם או כל סוג תא אחר. סרגל קנה מידה: 5.5 מיקרומטר. הועתק מתוך Thomas et ^al.29אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בצע CFA באמצעות ריסונים בלבד ללא ריר ולכלוך, והכה בפרופיל שנבחר עבור הקצה המוקלט. בחר רק קצוות מרוסקים המאפשרים לפחות 2 הערכת CBF ו- CBP (ראה להלן) לאורך הקצה.
4. השתמש עבור CFA רק דוגמאות המניבות מינימום של 6 קצוות פועמים בפרופיל הצידי ועומדים בקריטריונים לעיל; נתח עד 20 קצוות בפרופיל הצידי.
5. השתמש לפחות 1 קצה נוסף של ריסונים פועם מעל פרופיל הצופה כדי לאפיין את CBP.

7. הקלטת קצה מרוסס

1. הקלט את קצה הריסונים הפועם באמצעות קצב פריימים של 500 פריימים לשנייה במצלמה, והקרן על צג ברזולוציה גבוהה. נדרש קצב מסגרות מינימלי של 400 הרץ כדי לאפשר ניתוח של CBF ו- CBP¹³. הקלט קצה אחד בקצב מסגרות של 30 מסגרות לשנייה כדי להעריך את יעילות פינוי החלקיקים.
2. בחר Live, בקו הבקרה של המצלמה בחלק העליון של תפריט הדו-שיח המעוגן (איור 6D)
3. בחרו 'הפעל' כדי להציג את התמונה ו'עצור' כדי לסיים את הצפייה (איור 6D)
4. כדי להקליט קצה, הקש Record (איור 6D). כדי להציג את ההקלטה לפני השמירה, עבור אל קו הבקרה של המצלמה בחלק העליון של תפריט הדו-שיח המעוגן ובחר הפעלה. בחר הפעל כדי להציג את הווידאו שהוקלט ועצור כדי לסיים את הצפייה (איור 10A).
   הערה: הפסק להציג את הקצה המוקלט לפני השמירה.

איור 10: תיאור השימוש בתוכנה. (A) מצב הפעלה. כדי לסקור רצף וידאו מוקלט של מכות קצה מרוסס, בחר במצב הפעלה. בחר הפעל כדי להציג את התמונה ועצור כדי לסיים את הצפייה. ניתן להתאים את שיעור התהילה כדי לשפר את ניתוח הפונקציה הרירית (B, C) שמירת הקלטות הווידאו של קצוות מכים (B) כדי לשמור את הסרטון, בחר קובץ ואז שמור רכישות. (ג) הזן את שם הסרטון המוקלט ובחר את המיקום שבו מוקלט הסרטון. ודא שההקלטה נשמרת כ- . קובץ RAW (D) בחירה של הקלטה של קצוות מכים לניתוח: כדי לפתוח הקלטת וידאו, בחר קובץ, לאחר מכן פתח ולאחר מכן תמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. שמור את הווידאו במסד הנתונים (איור 10B,C).
   1. פתחו את 'קובץ' בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן שמרו רכישות (איור 10B).
   2. בתיבה שמור רכישות, הזן את שם הווידאו המוקלט וודא שההקלטה נשמרת כתבנית סוג קובץ RAW (איור 10C).
6. לאחר שמירת הווידאו, חזור למצב שידור חי (חזור לקו הבקרה של המצלמה בחלק העליון של תפריט הדו-שיח המעוגן ובחר בשידור חי) (איור 6D).
7. חזור על ההליך כדי לרשום את מספר הקצוות העומדים בקריטריוני הבחירה הדרושים עבור CFA.
   הערה: ניתן להקליט מספר קצוות מכים העומדים בקריטריוני הבחירה משקופית אחת, תוך 20 דקות לכל היותר לאחר הכנת השקף (כדי למנוע התייבשות). לאחר 20 דקות, אם לא ניתן להשיג מספיק קצוות העומדים בקריטריוני הבחירה, הכן שקופית חדשה.
8. הסר את השקופית מהקופסה המחוממת.
9. הסירו את הכיסוי המלבני והשליכו אותו למיכל הפסולת הרפואית המסוכנת הספציפית.
10. נקו את השקופית (כששני פתקי הכיסוי הריבועיים מודבקים עליה) עם 70% אתנול ונייר סופג. לאחר שהשקופית נקייה, ניתן להשתמש בה שוב.
11. הסתגלות לקורונה: הניחו את המגלשה עם הכיסוי והספייסר בשקית אטומה, הסירו את הכפפות והמסכה והניחו אותן בשקית האטומה. הניחו את השקית האטומה במיכל הפסולת הרפואית המסוכנת הספציפית.

8. ניתוח פונקציונלי ריסני

1. הכנה ראשונית לביצוע הערכת CBF ו- CBP ידנית
   1. פתח את התוכנה.
   2. פתחו את 'קובץ ' בפינה השמאלית העליונה, לאחר מכן ' פתח ' ולאחר מכן 'תמונות ' (איור 10D).
   3. בחר את הסרטון לניתוח.
   4. עבור אל קו הבקרה של המצלמה בחלק העליון של תפריט הדו-שיח המעוגן ובחר הפעלה (איור 10A). בחר הפעל כדי להציג את הווידאו שהוקלט ועצור כדי לסיים את הצפייה.
2. ניתוח ידני של תדירות פעימות ריסניות (CBF)
   1. בצע את הערכת CBF באמצעות הקצוות הצידיים בלבד.
   2. חלקו את הקצוות המרוססים ל-5 אזורים סמוכים בקירוב, שכל אחד מהם בגודל של כ-10 מיקרומטר (איור 11).
   3. זהו והדמיינו ריסונים או קבוצות ריסונים בקצב פריימים מופחת, ומקסימום 2 מדידות CBF מתבצעות בכל אזור, והתוצאה היא מקסימום 10 מדידות CBF לאורך כל קצה (איור 11).
   4. רשום את מספר המסגרות הדרוש לקבוצת ריסונים כדי להשלים 5 מחזורי פעימה.
   5. המר ל- CBF בחישוב פשוט: (CBF = קצב מסגרות הקלטה (Hz) / (מספר מסגרות עבור 5 פעימות) x 5)^13,16,30. ריסונים תנועתיים מדווחים כבעלי CBF של 0 הרץ¹³.
      הערה: התאם את קצב הפריימים בעת הפעלת הסרטונים שהוקלטו (איור 10A). זה שימושי במיוחד כאשר ריסונים ניתח להכות לאט מאוד. הגדלת קצב המסגרות מסייעת להגדיר אם הריסים פועמים לאט מאוד או שהם חסרי תנועה.
   6. עבור כל דגימה, חשב את ממוצע CBF כממוצע (SD) או (95% CI) של כל CBF שנרשם בפרופיל הצידי, כולל ריסונים סטטיים.

איור 11: תמונה מייצגת של יתרון איכות אופטימלי, והחלוקה ל-5 תחומים כדי לאפשר ניתוח CFA. קצה אפיתל ריסני באיכות אופטימלית מחולק ל-5 אזורים סמוכים בגודל 10 מיקרומטר כל אחד. מקסימום של 2 מדידות CBF (ו -2 הערכת CBP) נעשות בכל אזור, וכתוצאה מכך מקסימום של 10 מדידות CBF (והערכות CBP) לאורך כל קצה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. ניתוח ידני של תבנית פעימות ריסניות (CBP)
   1. כדי להעריך את הסמנים של דיסקינזיה, השתמש בפרופיל הצידי בלבד; השתמש במישורים לכיוון הצופה ומלמעלה כדי לאפיין את סוג CBP¹³. קיימות שיטות וציונים שונים להערכת CBP. להלן מתוארת השיטה המשמשת במעבדה עם ההגדרה של סמנים של dyskinesia.
   2. האחוז של כל CBP מובהק בתוך המדגם
      1. עבור כל ריסונים או קבוצת ריסונים שזוהו ושימשו למדידת CBF (איור 11), בצעו ניתוח CBP בקצב פריימים מופחת: השוו את הנתיב המדויק שנלקח על ידי הריסונים במהלך מחזור פעימות מלא עם CBP נורמלי שנצפה בניתוח DHSV^12,30.
      2. ייחוס CBP מובהק (נורמלי, בלתי תנועתי, נוקשה, מעגלי, אסינכרוני (מכות ריסניות לא מתואמות) או דיסקינטי¹³) לכל ריסונים או קבוצת ריסונים שנותחו.
      3. עבור כל מדגם, חשב את האחוז של כל CBP נפרד בתוך המדגם; ה- CBP המיוחס למדגם הוא ה- CBP הדומיננטי שנצפה.
   3. חשב את 3 הסמנים של dyskinesia.
      1. חישוב מדד חוסר התנועה (תעש): אחוז ריסוני התנועה בתוך המדגם (מספר CBF=0/המספר הכולל של קריאות CBF במדגם X 100). בטא את תעש כממוצע (SD) או (95% CI)^1,16,31.
      2. חישוב ציון דיסקינזיה (DKS). מחלקים כל קצה מרוסס לרבעים, ונקבע מספר הרבעים עם ריסונים דיסקינטיים (או פועמים באופן חריג). זה מאפשר לחשב DKS בין 0 ל -4 (0: CBP נורמלי בכל הקצה; 1: CBP חריג ב ≤ 25% של ריסונים; 2: CBP חריג ב ≤ 50% של ריסונים; 3: דפוס פעימות חריג ב ≤ 75% של ריסונים; ו 4: CBP חריג בכל ריסונים). חציון DKS (טווח בין-רבעוני) מחושב עבור המדגם^16,29.
      3. חישוב אחוז הפעימות הנורמליות: מוגדר כאחוז ריסונים עם CBP נורמלי בתוך המדגם (מספר קריאות CBP נורמליות / המספר הכולל של קריאות CBP עבור המדגם x100).

תוצאות

כדי להמחיש את יעילות הטכניקה, אנו מציגים את תוצאות CFA בסדרה של 16 מתנדבים בוגרים בריאים (5 גברים, טווח הגילאים 22-54 שנים).

דגימות צחצוח אף מ -14 (4 גברים, טווח הגילאים 24-54 שנים) מתוך סך של 16 מתנדבים סיפקו מספיק קצוות אפיתל מתאימים שעמדו בקריטריוני הבחירה הדרושים לביצוע CFA. מתוך 14 דגימ?...

Discussion

מאמר זה נועד לספק נוהל הפעלה סטנדרטי עבור CFA באמצעות דגימות צחצוח האף, עם התאמות שבוצעו לשיקולי בקרת זיהום מתאימים במהלך מגיפת COVID-19. אבחון PCD הוא מאתגר, וכיום דורש פאנל של בדיקות אבחון שונות, על פי המלצה בינלאומית, כולל מדידת תחמוצת החנקן באף, CFA באמצעות DHSV, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי ריסני באמצ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	FisherScientific	352096	15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B	LONZA	17-836E	Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps	NOVO SURGICAL	E7739-12	Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush	CONMED	129	Used for nasal brushing
Cotton swab	NUOVA APTACA	2150/SG	Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera	IDTeu Innovation in motion	CrashCam Mini 1510
Glass slide	ThermoScientific	12372098	Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box	IBIDI cells in focus	10918	Used to heat the sample
Inverted Light microscope	Zeiss	AXIO Vert.A1
Lens Heater	TOKAI HIT	TPiE-LH	Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES	TermoFisher Scientific	12340030	Cell Culture Medium
Motion Studio X64	IDT Motion	version 2.14.01	Software
Oil	FischerScientific, Carl Zeiss	11825153
Rectangular cover slip	VWR	631-0145	Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm	Sunjinlab	IS203	Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip	VWR	631-0122	Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin	FisherScientific, Gibco	11548876	Antiobiotics solution