מודל מורין סינגני של אנדומטריוזיס באמצעות עכברי רכיבה טבעיים

Summary

מודלים מכרסמים רבים של אנדומטריוזיס מוגבלים על ידי מורכבות טכנית, רבייה, ו / או צורך בעלי חיים immunocompromised או עכברי כתב מיוחד. אנו מציגים מערכת פשוטה של אינדוקציה נגע באמצעות כל עכבר ניסיוני עם מערכת ניקוד אובייקטיבית הניתנת לאימות עצמאי וללא דרישה לכריתת שחלות או ניתוח הישרדות.

Abstract

אנדומטריוזיס היא הגורם המוביל לכאב באגן ולאי פוריות. זה מוגדר על ידי נוכחות של רקמת רירית הרחם במקומות חוץ רחמיים. הפיתוח של עיבודים חדשניים וכלי אבחון עבור אנדומטריוזיס הוגבל בין היתר בשל אתגרים בחקר המחלה. מחוץ לפרימטים, יונקים מעטים וסת, ואף אחד מהם לא מפתח אנדומטריוזיס ספונטני. דגמי מכרסמים פופולריים אך דורשים אינדוקציה מלאכותית של אנדומטריוזיס, כאשר רבים משתמשים בעכברים אימונו-קוםיים או במחלה הנגרמת בניתוח. לאחרונה, תשומת לב רבה יותר ניתנה מודלים מעורבים הזרקה תוך אינטריתוניאלית. אנו מציגים מודל מורין של אנדומטריוזיס המשלב מספר תכונות של מודלים אנדומטריוזיס קיימים לתוך מערכת חדשנית, פשוטה המסתמכת על כימות מיקרוסקופי במקום דירוג סובייקטיבי. במודל זה, אנו מבצעים גירוי הורמונלי של עכברים תורמים, הזרקה תוך-פטרייתונית, סקר בטן שיטתי וקציר רקמות, וכימות היסטולוגי שניתן לבצע ולאמת בכל עת לאחר נמק. מודל זה דורש משאבים והכשרה מינימליים; אינו דורש מומחיות על ידי טכנאי מעבדה בניתוח הישרדות מורין או בזיהוי נגעים אנדומטריוטיים ברוטו; ניתן להשתמש בעכברים אימונו-קומונימציה, חיסונית ו/או מוטנטיים; ויוצר באופן אמין נגעים אנדומטריוטית התואמים היסתולוגית למחלה אנדומטריוטית אנושית.

Introduction

אנדומטריוזיס היא מחלה מסתורית של מערכת הרבייה הנשית עם נטל כלכלי ובריאותי משמעותי על נשים^1,2. האטיולוגיה של אנדומטריוזיס אינה מובנת לחלוטין, והוצעו הסברים מרובים כולל מטאפלזיה קולומית, מנוחה מולרית עוברית, גיוס תאי אב נגזרים מח עצם, וסת מדרדרת³. בעוד היבטים מרובים של מנגנונים מוצעים אלה עשויים להיות מעורבים, ואין הסבר אחד יכול להסביר את כל צורות המחלה, המודל המוביל של אנדומטריוזיס פתוגנזה הוא וסת מדרדרת. הווסת המדרדרת היא מעבר של שפכים וסת דרך החצוצרות לתוך חלל הצפק; ההערכה היא כי 90% מהנשים במחזור עוברות באופן קבוע וסת מדרדרת^4,5. בהתחשב בתופעה הנפוצה הזו של הווסת המדרדרת, מדוע אנדומטריוזיס מתפתחת רק בתת קבוצה של נשים לא ברור⁵. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה של מחלה זו, מחקרים אנושיים ישירים אינם אפשריים ומחקרים בבעלי חיים מוצדקים.

אנדומטריוזיס הוא אתגר הן לטפל והן ללמוד. שכיחות המחלה אינה ידועה אך מוערכת ב -10%¹. בעוד כמה סוגים מתקדמים של אנדומטריוזיס עשויים להיות מזוהים במדויק באמצעות הדמיה לא פולשנית, אבחנה סופית מושגת רק באמצעות ניתוח היסטופתולוגי של דגימות ביופסיה שהושגו בניתוח; נגעים שנראים חזותית להיות חולה, עשוי למעשה להיות פיברוזיס או הצטלקות מסיבות אחרות⁶. חומרת והיקף המחלה אינו תואם עם סימפטומטולוגיה⁷.

נגעים אנדומטריוזיס מורכבים מסוגי תאים הטרוגניים ואוכלוסיות אשר אינטראקציה בדרכים מורכבות בתוך microenvironment, ולכן, הגבלת התועלת של מודלים הסלולר^8,9. במודלים של Vivo קיימים, אבל אלה יש אתגרים ומגבלות מובנים^10,11,12. דגמי פרימטים הם אידיאליים אך לעתים קרובות אינם אפשריים^13,14,15. מעט יונקים שאינם פרימטים וסת ומפתחים אנדומטריוזיס באופן ספונטני¹⁶. מודלים מכרסמים של אנדומטריוזיס קיימים אבל כל אחד יש מגבלות¹⁷. רבים מהמודלים הללו דורשים ניתוח הישרדות לתפר או להשתיל רקמת רירית הרחם בקיר או במעי של הנמען התורם, הוספת מורכבות טכנית, צורך בהרדמה וגורמים חיסוניים מבלבלים מהניתוח עצמו^18,19,20. בנוסף, מודלים רבים דורשים כריתת השחלות ותוספת אסטרוגן; תוך הגדלת תפוקת הנגעים, הדבר מוסיף זמן, הוצאות וניתוח הישרדות נוסף. מודלים הזרקה intraperitoneal (IP) אינם דורשים הרדמה או ניתוח הישרדות, ומודלים אלה באופן הגיוני לדמות וסת מדרדרת טוב יותר מאשר מודלים תפירה^21,22,23. רוב מודלי ה- IP, לעומת זאת, כפופים לשונות רבה יותר במיקום הנגע עקב פיזור אקראי של שברי רירית הרחם לאחר ההזרקה ולכן להטיה רבה יותר בזיהוי ומדידת נגעים.

כאן אנו מציגים מודל מורין של אנדומטריוזיס המשלב מספר תכונות של מודלים אנדומטריוזיס קיימים לתוך מערכת חדשנית, פשוטה ויעילה המסתמכת על כימות מיקרוסקופי במקום דירוג סובייקטיבי.

Protocol

הערה: השימוש בבעלי חיים במחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכון המחקר קליבלנד קליניק לרנר. כל תקני הטיפול והשימוש בבעלי חיים הזמינים לציבור בוצעו בהתאם להנחיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הליך זה משתמש בטכניקות אספטיות. צלחת הפטרי סטרילית. PBS / מלוחים בשימוש הוא סטרילי. המכשירים הכירורגיים לנמק וניתוח רקמות מעוקרים באמצעות autoclave. אנו משתמשים 70% EtOH על המכשירים בין מקרי בעלי חיים (אם יותר מאחד לכל מפגש) כדי להפחית את הזיהום.

1. הכנת עכברים תורמים ומקבלים (ראו איור 1)

1. ודא כי אישור מתאים הוא במקום לעבוד עם חיות מעבדה.
2. קבע את זן העכבר. בניסויים אלה נוצלו שימוש בעכברים מסוג בר ועכברים מוטנטיים בעלי רקע C57BL/6J, אך חוקרים המשתמשים במודלים דומים מדווחים על הצלחה עם זני עכבר אחרים כגון עכברי BALB/c¹⁰. בנוסף, עכברים תורמים ו/או נמענים יכולים להשתמש במערכות עיתונאיות, כגון עכברי GFP או RFP (ראו איור 2 ואיור 3).
3. לתזמון של השתלת רקמת רירית הרחם, ודא כי העכברים התורמים הם בין 22-24 ימים בזמן הזרקת גונדוטרופין. זה מבטיח כי הם נאיביים פוריות, למשל, עדיין לא התחיל estrous רכיבה על אופניים.
4. ודא כי העכברים הנמענים הם שלמים פוריות (ללא כריתת השחלות הקודמת) בין 2 ל 4 חודשים של גיל. אמנם לא נדרש, מומלץ למקם מצעים ספוגים בשתן מכלוב עכברים זכר מעת לעת בכלוב של המטופל כדי להקל על רכיבה מתמשכת על אופניים estrous ושוב בשעה 72 שעות לפני השתלת רקמת רירית הרחם.
   הערה: זה לא יבטיח סנכרון של מחזור אסטרוס של הנמענים, כמו מצעים ספוגים בשתן מיקום תלוי מאוד בכמות המצעים הגבריים המשמשים ויש תוצאות משתנות. אם סנכרון של מחזור אסטרוס הוא הרצוי, שלוש זריקות תת עוריות רצופות של 100 ng/100 μL אסטרדיול יביא את כל בעלי החיים לשלב אסטרוס. אמנם לא מצאנו הבדל באינדוקציה נגע בהתבסס על שלב מחזור estrous, קבוצות אחרות מצאו את שלב המחזור להיות חשוב¹⁰.
5. להזריק באופן תת עורי סרום סוסה בהריון גונדוטרופין (PMSG, 2 IU מדולל לתוך 200 μL) לתוך עכברים תורם תת עורית באמצעות מחט עדינה (25-27 G מומלץ). אל תיתן PMSG לעכברים המטופלים, כפי שהוא יפעיל ביוץ וסביבת פרוגסטרון גבוהה לאחר מכן, אשר פחות פתוח להיווצרות אנדומטריוזיס.
   הערה: דגמי עכבר קודמים השתמשו PMSG או אסטרוגן כדי לעורר את התפשטות רירית הרחם בעכברים התורמים לפני קציר רירית הרחם²³. PMSG מומלץ מהסיבות הבאות: מחצית החיים של PMSG היא 40 שעות ואילו מחצית החיים של 17-בטא אסטרדיול הוא רק 2 שעות. ניצול הזרקה תת עורית אחת של PMSG בתורמים 40 שעות לפני רכישת רקמת רירית הרחם מספק משך מתמשך של חשיפה לגיורוי גונדוטרופין, הפועל להמרצת אסטרוגן אנדוגני. תכשירים רבים של אסטרוגן אקסוגני דורשים זריקות מרובות כדי הממשלה כראוי את רירית הרחם.
6. לאחר הזרקת PMSG, לתזמן נמק, רכש, והשתלה לתוך המטופל בין 38-42 שעות. זמן קציר רקמת רירית הרחם בעקבות הזרקת גונדוטרופין כדי להבטיח איסוף של רקמות לפני הביוץ, אשר מתרחשת ב 42 שעות לאחר הזרקה. הביוץ מייצר סביבת פרוגסטרון גבוהה (P4), אשר יפחית את הקמת הנגע.

2. רכש של רקמת רירית הרחם של העכבר התורם

1. לאחר המתת חסד של עכבר תורם (באמצעות CO₂ תא ואחריו נקע צוואר הרחם), לרסס את הבטן עם פתרון אתנול 70%; זה משמש כדי להפחית את הזיהום של הרקמה שנרכשה מן הצומח העור מן השערות מפורק. עם מספריים ניתוח, לעשות חיתוך רוחבי רדוד בקו האמצע דרך העור ורקמות תת עוריות. לאחר מכן תופס כל צד של חתכת העור, להשתמש במתיחה קהה כדי לפתוח את הבטן.
2. זהה את הרחם. לפני הסרת הרחם, לקצץ את רקמת החיבור הסמוכה. ניתחו כל קרן הרחם ממש מתחת לצינור החצוצרות שלהם ואז העבירו את צוואר הרחם כדי להסיר את כל הרחם en הגוש.
3. לאחר הסרה מחלל הבטן, יש לבדוק את הרחם בקפידה ולהסיר כל שומן היקפי נוסף או רקמת חיבור. מניחים את הרחם בטיפת PBS קרה על צלחת פטרי. קבעו ותיעדו את המסה המשולבת של הרחם כולו.
4. ניתחו כל קרן מהרחם, מה שהופך את הטרנסקציה קרוב ככל האפשר לקרן כדי למקסם את אורך כל קרן. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, הנח להב אחד של המספריים הניתוח בתוך הלומן של הקרן הראשונה, ולאחר מכן חתוך לאורך הציר העיקרי של הצינור. פתחו בזהירות את הצינור, תוך התחשבות באיזה צד הוא הסרוזה ובאיזה צד האפיתל.
5. שים 500 סמ"ק של תמיסת מלח או PBS על צלחת פטרי חדשה; הנוזל יישאר יחד עקב מתח פני השטח.
6. לאחר מכן, לבצע פיצול של הרחם בצורה אחידה. עדיף שיהיו פחות נגעים גדולים יותר מאשר נגעים קטנים רבים. התחל על ידי הפרדת האפיתל מן myometrium על ידי אחיזת שכבת רירית הרחם וקילוף אותו משם.
   1. לחלופין, פשוט לפצל את הרקמה מבלי להפריד את myometrium (כל עוד הצד האפיתל חשוף לחלוטין), אבל שמירה על myometrium מפחית את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל זה למחלה אנושית. ודא כי שברים גדולים ככל האפשר אבל קטן מספיק כדי לעבור דרך מחט 18 G; (מומלץ 1 מ"מ x 1 מ"מ).
   2. לאסוף 10-12 אלה 1 מ"מ x 1 מ"מ שברים מן הקרן הראשונה (אשר בערך מתאים 40 רקמה מ"ג בעכברים C57BL / 6J). מניחים שברים שנאספו לתוך האוסף הנוזלי.
7. בצע את אותם שלבים עבור קרן הרחם האחרת עבור סך של כ 24 קטעים לכל עכבר. תעד את המספר הכולל של קטעים.

3. הזרקה צפקית של שברי רקמות לעכבר המטופל

1. שאפו את שברי 1 מ"מ x 1 מ"מ תלויים באמצעות הקצה הקהה של מזרק 1 סמ"ק; אמצעי האחסון הכולל צריך להיות 1 מ"ל.
2. חבר מחט 18 G למזרק המלא ולהעמיס את הנוזל לתוך המחט. שקול זריקה מדומה בחזרה לתוך צלחת פטרי כדי להבטיח כי כל הרקמה תעבור דרך המחט.
3. קח את העכבר של הנמען. לפני או אחרי הזרקת IP, להשיג מריחה בנרתיק של העכבר הנמען עבור תיעוד מחזור אסטרוס (10 μL של מלוחים באמצעות מזרק הנורה ב פתח הנרתיק מצופה על שקופית הזכוכית עם כיסוי).
4. בצע הזרקה תוך-תאית של השברים עם המזרק בזווית של 45 מעלות, תוך הקפדה לא להזריק תת עורית.
5. אם שברים נשארים לאחר הזרקה, לצייר 200 μL נוסף של הנוזל לתוך המזרק להזרקה כדי להבטיח כי כל השברים מוזרקים בהצלחה תוך איפריטונית.
6. לאחר שהובטחו ללא דימום או סיבוכים, החזירו את העכברים הנמענים לכלובים שלהם והזינו תזונה רגילה.

4. קציר נגעים אנדומטריוטיים

1. המת חסד עכברים נמענים בכ 21 ימים לאחר הזרקת שבר לאחר ההשתלה.
   הערה: מניסיון ומדיון עם משתפי פעולה באמצעות מודלים דומים, גודל הנגע המרבי ומספר מתרחשים בערך 3 שבועות לאחר ההשתלה; לאחר 3 שבועות, נגעים מתחילים לסגת בגודל. השיטה המאושרת של IACUC של המתת חסד משמשת.
2. לאחר המתת חסד ונקע צוואר הרחם, לרסס את הבטן של החיה עם 70% אתנול אוהל העור לחתוך באופן שטחי עם מספריים לנתח. תעוררו את העור ואת החלל התת עורי עם מספריים כדי לפתוח את הבטן בבוטות.
3. לפני כל ניתוח נוסף מתבצע, סקר מלא עבור נגעים ברוטו מבוצע, עם גודל נמדד על ידי calipers ומתועד לגבי האזור האנטומי שלהם (ראה להלן).
4. בצע אוסף מלא של שלושה אזורים אנטומיים נפרדים en גוש (ללא קשר אם נגעים ניתן להעריך ברוטו). אם נגעים נראים באזורים אחרים (למשל, מעיים), יש להתעלם מהם ולא לאסוף אותם אלא אם הנגע חוצה את אחד משלושת האזורים שמתחת.
   1. A = דופן הבטן / צפק (ניתן לשטח לתוך קלטת או מגולגל, כל עוד עקבי בין דגימות).
   2. B = לבלב ושומן מזנטי.
   3. C = רקמת חיבור parauterine ושומן (רקמה נוצצת לבנה המקיפה את הרחם אך אינה מערבת איברים מלבד שלפוחית השתן; יש להקפיד לא לטעות בשלפוחית השתן לגע).
5. מקם כל אזור נותח בקלטת, המסומנת כראוי, והכנס אותו לפורמלין ולעבד לפי פרוטוקול מעבדה לחתך היסטולוגי.
6. מקטע פורמלין בלוקים בשתי שקופיות (D1 ו- D2) לכל אזור רקמה בשני עומקים אחידים.

5. ניקוד של נגעים אנדומטריאוטיים

1. סרוק (בהגדלה של פי 40) ואחסן בארכיון שקופיות.
2. השתמש בתוכנת קריאת שקופיות דיגיטלית, הגדר את המרחק הארוך ביותר (X) בין קצוות של נגע אנדומטריוטי - בין אם הקצה מורכב מבלוטות או סטרומה- וסמן אותו. נגע מתמשך מוגדר על ידי בלוטות מוקפות סטרומה; הקו אינו חוצה בהכרח רק רקמה אנדומטריוטית (כמו במקרה של קביעת נקודות קצה על מוקד צורה לא סדיר או גלי של אנדומטריוזיס) אך שתי נקודות הקצה צריכות להיות מחוברות על ידי סטרומה ו/או בלוטות רציפה (ראו איור 4).
3. הפוך שורה שנייה (Y) 90 מעלות על פני השורה הראשונה, עם אורך השורה השנייה נקבע בהתאם לכללים לעיל.
4. אם נתקלים במגוון נגעים לא רציפים, תן לכל אחד מדידות X ו- Y משלו.
5. חשב את הניקוד הסופי עבור כל שקופית כסיכום אזורים (X*Y) של כל נגע.
6. קח את התוצאות הגדולות יותר משתי השקופיות (D1 לעומת D2) כציון הסופי עבור אזור זה (A, B, C).
7. סה"כ את הציונים מכל אזור כדי לתת את הציון המיקרוסקופי הסופי עבור החיה הזו.

תוצאות

לניסוי ראשוני להוכחת הרעיון, רירית הרחם התורמת מעכברי RFP הוזרקה לעכברים נמענים מסוג בר. כתמי H&E חשפו אישור היסטופתולוגי של ארכיטקטורה קלאסית של נגע אנדומטריוזיס(איור 3A). מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה כי הנגע הנצפה המדובר מקורו בתורם (איור 3B).

Discussion

המחקר שלנו מדגים כי אנדומטריוזיס יכול להיות מושרה באופן אמין בעכברים ללא צורך בשימוש ב כריתת השחלות ו/או ניתוח הישרדות, וכי נגעים רירית הרחם חוץ רחמית ניתן לזהות ולכמת באמצעות סקר סטנדרטי של הבטן וניתוח היסטולוגי.

מחקרים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies for injecting PMSG into donor mouse
1 mL Tuberculin syringe with 27G needle	Fisher Scientific	14-826-87
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma-Aldrich	9002-70-4
Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing
6” serrated forceps, curved tip	Electron Microscopy Sciences	72993-6C
70% ethanol solution	Pharmco	33000HPLCCS4L	70% solution dilute ethyl acetate 200 proof
Analytical balance	Mettler Toledo	ME54TE
Carbon dioxide	TriGas Supplier
Dissecting tray	Fisher Scientific	S14000
No. 10 disposable scalpel	Fisher Scientific	NC9999403
Scissors, curved	Electron Microscopy Sciences	72941
Scissors, straight	Electron Microscopy Sciences	72940
Stereo microscope	Leica Microsystems	Leica SE 4	For tissue dissection
Sterile phosphate buffered saline (PBS)	Institutional core facility supplies
Surgical instrument sterilization tray	Electron Microscopy Sciences	66112-02
Tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772E
Weighing dishes	Fisher Scientific	02-202-103
Supplies for injecting into recipient mouse
1 cc syringe	BD Biosciences	301025
18 G needle	Fisher Scientific	148265d
200 uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-422
Double distilled water	Institutional core facility supplies
Latex bulb	Fisher Scientific	03-448-21
Micro cover glass slip	VWR	48366-067
Microscope slide	Fisher Scientific	12-544-7
Standard light microscope	Leica Microsystems	DM IL	For evaluating vaginal cytology smears
Supplies for harvesting tissue from recipient mouse
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Biopsy foam pads	Fisher Scientific	22-038-222
Precision Digital Calipers	Electron Microscopy Sciences	62065-40
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	22-272416