מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ הניתנת לשחזור בחולדות

Summary

כאן אנו מציגים מודל אנדוטוקסין מוכוון יחידת טיפול נמרץ בחולדות.

Abstract

אלח דם והלם ספטי נותרו סיבת המוות המובילה ביחידות לטיפול נמרץ. למרות שיפורים משמעותיים בניהול אלח דם, התמותה עדיין נעה בין 20% ל-30%. יש צורך דחוף בגישות טיפול חדשניות על מנת להפחית כישלון רב-אורגני ומוות הקשורים לאלח דם. מודלים חזקים של בעלי חיים מאפשרים גישה טיפולית אחת או יותר, כמו גם לבחון את השפעתם על פרמטרים פיזיולוגיים ומולקולריים. במאמר זה מוצג מודל חייתי פשוט.

ראשית, הרדמה כללית מושרית בבעלי חיים עם שימוש נדיף או על ידי הרדמה תוך צפקית. לאחר הצבת קטטר תוך ורידי (וריד זנב), טרכאוסטומיה והחדרת צנתר תוך-עורקי (עורק זנב), מתחילה אוורור מכני. נרשמים ערכים בסיסיים של לחץ דם עורקי ממוצע, ריווי חמצן בדם העורקי וקצב הלב.

הזרקת ליפופוליסכרידים (1 מיליגרם/קילוגרם משקל גוף) המומסים במי מלח עם מאגר פוספטים גורמת לתגובה דלקתית חזקה וניתנת לשחזור באמצעות קולטן דמוי אגרה 4. תיקוני נוזלים כמו גם יישום של נוראדרנלין מבוצעים על סמך פרוטוקולים מבוססים היטב.

המודל החייתי המוצג במאמר זה קל ללמידה ומכוון מאוד לטיפול באלח דם קליני ביחידה לטיפול נמרץ עם טשטוש, הנשמה מכנית, ניטור לחץ דם רציף ודגימת דם חוזרת ונשנית. כמו כן, המודל אמין, ומאפשר נתונים הניתנים לשחזור עם מספר מוגבל של בעלי חיים בהתאם לעקרונות 3R (להפחית, להחליף, לחדד) של מחקר בבעלי חיים. בעוד שניסויים בבעלי חיים בחקר אלח דם אינם יכולים להחליף בקלות, מדידות חוזרות ונשנות מאפשרות הפחתה של בעלי חיים והשארת בעלי חיים מרדימים מפחיתה את הסבל.

Introduction

אלח דם וצורתו החמורה יותר, הלם ספטי, הם תסמונות על קרקע של זיהום, וכתוצאה מכך תגובה דלקתית מוגזמת עם שחרור ציטוקינים, מה שמוביל לשינויים פיזיולוגיים וביוכימיים עם הגנה חיסונית מדוכאת ותוצאות קטלניות ^1,2. תגובה דלקתית לא מאוזנת זו גורמת לתפקוד לקוי של איברים ולכשל איברים באיברים חיוניים שונים כגון ריאות, כליות וכבד. עם 37%³, אלח דם הוא אחת הסיבות הנפוצות ביותר עבור מטופל להתאשפז ביחידה לטיפול נמרץ (טיפול נמרץ). התמותה מאלח דם נעה כיום סביב 20-30%⁴. טיפול אנטיביוטי מוקדם ויעיל הוא בעל חשיבות עליונה⁵. יש להתקין את החייאת הנוזלים והוואסופרסורים מוקדם, מלבד זאת, הטיפול תומך אך ורק⁶.

אלח דם מוגדר כזיהום מוכח או חשוד בחיידקים, פטריות, וירוסים או טפילים, המלווה בתפקוד לקוי של איברים. קריטריונים של הלם ספטי מתקיימים כאשר קריסה קרדיווסקולרית נוספת אינה מגיבה לטיפול בנוזלים בלבד, ורמת לקטט של יותר מ-2 מילימול לליטר נמצאת². אי ספיקת איברים הקשורה לאלח דם עלולה להתרחש בכל איבר, אך היא שכיחה מאוד במערכת הלב וכלי הדם, במוח, בכליה, בכבד ובריאה. רוב החולים הסובלים מאלח דם זקוקים לאינטובציה אנדוטרכאלית כדי לאבטח את דרכי הנשימה של המטופל, להגן מפני שאיפה, וליישם הנשמה חיובית עם שבריר גבוה של חמצן בהשראה כדי למנוע או להתגבר על היפוקסיה. על מנת לסבול צינור קנה הנשימה והנשמה מכנית, חולים בדרך כלל דורשים הרגעה.

אנדוטוקסינים, כגון ליפופוליסכרידים (LPS) כמרכיב בקרום של חיידקים גראם שליליים מעוררים תגובה דלקתית חזקה באמצעות קולטן דמוי אגרה (TLR) 4⁷. הפעלת מסלול מוגדר מבטיחה תגובה דלקתית יציבה. ציטוקינים כמו ציטוקינים המושרים על ידי ציטוקין חלבון כימואטרקטנטי 1 (CINC-1), חלבון כימואטרקטנט מונוציטים 1 (MCP-1) ואינטרלוקין 6 (IL-6) ידועים כגורמים פרוגנוסטיים לחומרה ולתוצאה במודל זה⁸. יישום LPS תוך ורידי שימש בהצלחה לחקר היבטים שונים של אלח דם בחולדות ^8,9.

הטיפול באלח דם הוא עדיין אתגר, במיוחד בשל היעדר מודלים של בעלי חיים מנבאים. אם אנדוטוקסמיה עם הפעלה של דלקת מערכתית היא מודל הולם לפיתוח טיפולים פרמקולוגיים שנוי במחלוקת. עם זאת, עם מסלול TLR 4 הידוע המושרה על ידי LPS ניתן להשיג ידע חשוב.

Protocol

כל הניסויים שהוצגו בפרוטוקול זה אושרו על ידי הרשויות הווטרינריות של קנטון ציריך, שוויץ (מספרי אישור 134/2014 ו- ZH088/19). יתר על כן, כל השלבים שבוצעו בניסוי זה היו בהתאם להנחיות על ניסויים בבעלי חיים על ידי האקדמיה השוויצרית למדעים מדיאליים (SAMS) ולהנחיות של הפדרציה של האגודות האירופיות למדעי חיות המעבדה (FELASA).

1. אינדוקציה של הרדמה וניטור בעלי חיים

1. שמור על חולדות Wistar זכרים במשקל של 250-300 גרם (g) בכלובים מאווררים בתנאים נטולי פתוגנים. ספק מחזור אור/חושך של 12-12 שעות בטמפרטורת סביבה של 22 ± 1 °C (64 °F) וגישה חופשית למזון ולמים.
2. לגרום להרדמה כללית על ידי אינדוקציה נדיפה עם איזופלורן (ריכוז של 3-5%) בתיבת אינדוקציה להרדמה למשך 30 שניות (איור 1A) או לחילופין, לגרום להרדמה עם זריקה אחת של קטמין/קסילאזין (10/1 מיליגרם (מ"ג) לכל 100 גרם משקל גוף).
3. העבירו את החיה למקום עבודה והניחו את החיה על מחצלת חימום לאורך כל הניסוי. שמור על טמפרטורת הגוף בין 36.5 ל -37 °C (74 °F).
4. השתמש באף-חרטום כדי לספק חמצן (600 מ"ל לדקה). הוסף איזופלורן 2-3% אם הרדמה נדיפה נבחרה לתחזוקת הרדמה. ודא כי החיה נושמת באופן ספונטני.
5. לאשר את רמת ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה הבוהן לפני ההתקנה של tracheostomy וצנתרים עורקיים וורידיים.
6. אמת חמצון מספיק על ידי ניטור ריווי חמצן היקפי (ריווי חמצן רגיל 98 - 100%).
7. השתמשו במשחה (משחת ויטמין A) כדי להגן על העיניים.
8. הכינו כלי ניתוח וצנתרים סטריליים על שולחן צדדי כפי שמוצג באיור 1B.
9. בנוסף, הכינו ניטור לחץ וריווי חמצן כפי שמוצג באיור 1C.

2. גישה תוך ורידית

1. מרחו חוסם עורקים על הזנב הפרוקסימלי של החולדה כדי להקל על הגישה הוורידית (איור 2A).
2. יש לחטא את הזנב 3 פעמים באלכוהול.
3. לגרום לצנתר תוך ורידי G26 לתוך אחד משני ורידי הזנב הצדדיים.
   הערה: מניסיוננו קל יותר למקם את הגישה התוך ורידית בחלק הדיסטלי של זנב החולדה, מכיוון שהווריד כאן ממוקם קרוב יותר לעור. בנוסף, במקרה של תותח כושל, יש מספיק מקום לנוע באופן פרוקסימלי.
4. הימנעו לחלוטין מהזרקת אוויר.
5. להתיר את חוסם העורקים לאחר הנחת הצנתר התוך ורידי.
6. תקן את הצנתר התוך ורידי במקומו באמצעות סרט דבק (איור 2B).
7. חברו משאבות מזרק לגישה התוך-ורידית לצורך שימוש רציף בנוזל ובתרופות.
8. השתמש בסטופקוקים תלת-כיווניים לנוזל בולוס, למריחת תרופות ולדגימת דם ורידי.

3. טרכאוסטומיה

1. לגלח את אזור הצוואר הקדמי של החיה.
2. יש לחטא את העור המגולח 3 פעמים בתמיסת יוד.
3. בצע חתך אורכי באורך של כ-2 ס"מ באמצעות אזמל (עם להב מספר 10).
4. לסגת את העור עם 2-0 תפרים משי.
5. הכינו בבוטות את הגרון ואת קנה הנשימה במספריים כירורגיים (איור 3A).
6. הקפידו לפתוח את קנה הנשימה עם מיקרו מספריים כירורגיים באבזם קנה^הנשימה 3-5.
7. מכניסים צינורית קנה הנשימה הסטרילית לקנה הנשימה. היזהר, לא להכניס את הצינורית עמוק מדי כדי למנוע אוורור חד צדדי.
8. תקן את הצינורית במקום באמצעות תפר משי 2-0.
9. חברו את הצינורית למכונת הנשמה לצורך אוורור מבוקר לחץ או נפח (איור 3B).

4. גישה עורקית

1. יש לחטא את זנב החולדה 3 פעמים בתמיסת פובידון-יוד.
2. חותכים את העור באמצעות אזמל (עם להב מספר 10) באורך של כ-1 ס"מ בצד הגחון.
3. שמור על עצמך, אל תחתוך עמוק מדי כדי למנוע פגיעה בעורק הזנב.
4. השתמש במיקרוסקופ כירורגי כדי לחשוף את העורק בזהירות. חותכים את החיתולית המקיפה את העורק עם מיקרו מספריים כירורגיים.
5. ליגט את החלק הדיסטלי של העורק באמצעות תפר משי 6-0.
6. הכינו תפר משי פרוקסימלי 6-0 אך אל תהדקו את המשי (איור 4A).
7. הכניסו צנתר G-26 לעורק שבין תפר המשי הדיסטלי לפרוקסימלי.
8. ברגע שהצנתר נמצא בעורק, הדקו את תפר המשי הפרוקסימלי וקבעו את הצנתר במקומו (איור 4B).
9. חברו את הצנתר למתמר לחץ כדי לספק מדידת לחץ עורקית רציפה (לחץ עורקי ממוצע רגיל: 60 - 100 מ"מ כספית) (איור 4C).
10. בנוסף, יש למקם עצירה תלת-כיוונית בין הצנתר המחובר למתמר הלחץ לבין צנתר G-26 לדגימת דם עורקי.

5. מדידת בסיס, אינדוקציה של אלח דם ומדידות מעקב

1. לאחר שהחיה הגיעה למצב יציב, הזריקו את ה- LPS.
2. לאסוף דגימות דם כאשר מגיעים למצב יציב (בדרך כלל לאחר 15-30 דקות).
3. החלף אובדן נוזלים מדגימות דם על ידי תמיסת רינגר ביחס של 1:4.
4. כדי לגרום לאלח דם, הזריקו את ה-LPS כבולוס או כיישום LPS רציף.
5. למריחת הבולוס, יש להזריק 1 מ"ג של LPS/קילוגרם משקל גוף (ק"ג) המומס במי מלח מועשרים בפוספט (PBS) בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
6. ליישום רציף, הזריקו 300 מיקרוגרם של LPS/ק"ג/שעה לאורך כל הניסוי באמצעות משאבת מזרק (תמיסת מלאי של LPS: 1 מ"ג/מ"ל ב-PBS).
7. יש להימנע מהזרקת אוויר בכל עת על מנת למנוע תסחיף אוויר.
8. הגדר פרוטוקולים להחלפת נוזלים, פרוטוקולים ליישום vasoconstrictor וקריטריונים להפלה (לדוגמה לחץ דם לחץ דם עורקי ממוצע מתחת ל-50 מ"מ כספית למשך יותר מ-30 דקות למרות החלפת נוזלים) לפני ביצוע הניסוי.
   הערה: אנו מציעים עירוי רציף של תמיסת רינגר בקצב של 10 מ"ל/ק"ג/שעה.
9. הפחת כל מתן רציף של נוזלים (למשל, עבור יישום LPS רציף) מהכמות המוחדרת כך שהתוצאות יהיו דומות לאלה של קבוצות הביקורת.
   הערה: בסוף הניסוי, ולפני קצירת איברים כלשהם כגון כבד, כליות או טחול לצורך ניתוחים נוספים כגון בדיקה היסטולוגית או ביוכימית בעלי חיים יכולים להיות מורדמים על ידי חתך של וריד הקאווה הנחות. השיטה המומלצת להמתת חסד היא להביא את בעלי החיים למישור כירורגי של הרדמה לפני חתך של הווריד הנבוב התחתון קאווה והזרקת מלח קר כקרח ללב השמאלי, במיוחד אם יש להעריך סמנים דלקתיים באיברים. הקפידו לציית לדרישות החוק ולהנחיות המקומיות. כדי לאמת אי ספיקת איברים הקשורה לאלח דם, ניתן לנתח סמן פרו-אפופטוזיס כמו caspase-3 וכן α1-microglobuline כדי לאמת נזק צינורי בכליות. הניתוח הספציפי לאיברים של סמנים כמו CINC-1, MCP-1 ו- IL-6 עשוי גם לספק מידע על התגובה הדלקתית הספציפית לאיבר.

תוצאות

המערכת המוצגת מאפשרת אנדוטוקסמיה עם בעלי חיים יציבים מבחינה המודינמית כפי שדווח בעבר⁹. בעוד שהלחץ העורקי הממוצע נשאר יציב אצל בעלי חיים עם, וללא גירוי LPS בעלי חיים המטופלים ב- LPS מפתחים מאפיינים של אלח דם כגון עודף בסיס שלילי ותגובה דלקתית חזקה הנמדדת על ידי ציטוקינים בפלזמה (6 ?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר מודל אלח דם קל לשחזור, אך פשוט ללמידה, שניתן להתאים אותו על פי שאלת המחקר. נתונים חיוניים של in vivo המתייחסים לתפקוד איברים כגון קצב לב, לחץ דם וריווי חמצן עורקי היקפי עשויים להיאסף באופן רציף, ודגימת דם עשויה להתבצע באופן חוזר ונשנה לאורך הניסוי. בנוסף, ניתן להתקין ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland