צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

Summary

אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלבבות מורין.

Abstract

האות החשמלי שנוצר פיזיולוגית על ידי תאי קוצב לב בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מתבצע דרך מערכת ההולכה, הכוללת את הצומת האטריובנטריקולרי (AVN), כדי לאפשר עירור והתכווצות של הלב כולו. כל תפקוד לקוי של SAN או AVN גורם להפרעות קצב, דבר המצביע על תפקידן הבסיסי באלקטרופיזיולוגיה והפרעות קצב. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הפרעות קצב, אך החקירה הספציפית של SAN ו- AVN נותרה מאתגרת.

ה- SAN ממוקם בצומת של מסוף הקריסטה עם הווריד הנבוב העליון ו- AVN ממוקם בקודקוד המשולש של קוך, שנוצר על ידי פתח הסינוס הכלילי, הטבעת הטריקוספידית והגיד של טודרו. עם זאת, בשל הגודל הקטן, הדמיה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית נותרה מאתגרת והיא אינה מאפשרת את המחקר של SAN ו- AVN בסביבת התלת-ממד שלהם.

כאן אנו מתארים גישה אימונופלואורסצנטית של הר שלם המאפשרת הדמיה מקומית של SAN ו- AVN של עכבר מתויג. צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה מיועדת למקטעים קטנים יותר של רקמה ללא צורך בחתך ידני. לשם כך, לב העכבר מנותח, עם רקמות לא רצויות הוסרו, ואחריו קיבוע, חדירה וחסימה. תאים של מערכת ההולכה בתוך SAN ו-AVN מוכתמים בנוגדן אנטי-HCN4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ועיבוד תמונה מאפשרים התמיינות בין תאי קשרית לבין קרדיומיוציטים עובדים, ולמקם בבירור SAN ו- AVN. יתר על כן, ניתן לשלב נוגדנים נוספים כדי לסמן גם סוגי תאים אחרים, כגון סיבי עצב.

בהשוואה לאימונוהיסטולוגיה קונבנציונלית, צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה שומרת על השלמות האנטומית של מערכת הולכת הלב, ובכך מאפשרת חקירה של AVN; במיוחד כך לתוך האנטומיה שלהם ואת האינטראקציות עם שריר הלב עובד שמסביב תאים שאינם מיוציטים.

Introduction

הפרעות קצב הן מחלות שכיחות הפוגעות במיליוני אנשים, והן גורמות לתחלואה ותמותה משמעותיות ברחבי העולם. למרות התקדמות עצומה בטיפול ובמניעה, כגון פיתוח קוצבי לב, הטיפול בהפרעות קצב נותר מאתגר, בעיקר בשל הידע המוגבל מאוד לגבי מנגנוני המחלה הבסיסיים ^1,2,3. הבנה טובה יותר הן של האלקטרופיזיולוגיה הרגילה והן של הפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשניות, חדשניות וסיבתיות בעתיד. בנוסף, כדי לחקור באופן מקיף הפרעות קצב, חשוב למקם ולדמיין את מערכת הולכת הלב הספציפית במודלים של בעלי חיים כגון עכבר, שכן עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אלקטרופיזיולוגי.

החלקים העיקריים של מערכת ההולכה הלבבית הם הצומת הסינואפרוזדורי (SAN), שבו נוצר הדחף החשמלי בתאי קוצב מיוחדים, והצומת האטריובנטריקולרי (AVN), שהוא החיבור החשמלי היחיד בין האטריה לחדרים⁴. בכל פעם שהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של SAN ו- AVN משתנות, הפרעות קצב כגון תסמונת סינוס חולה או בלוק אטריובנטריקולרי יכולות להתרחש אשר עלולות להוביל להידרדרות המודינמית, סינקופה ואפילו מוות, ובכך להדגיש את התפקיד החיוני של SAN ו- AVN הן באלקטרופיזיולוגיה והן בהפרעות קצב⁵.

מחקרים מקיפים על SAN או AVN דורשים לוקליזציה מדויקת והדמיה של שני המבנים, באופן אידיאלי בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, בשל גודלם הקטן ומיקומם בתוך שריר הלב העובד, מבלי לקבוע מבנה ברור הנראה לעין מבחינה מקרוסקופית, חקר האנטומיה והאלקטרופיזיולוגיה של SAN ו- AVN הוא מאתגר. ניתן להשתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לזהות בערך את האזור המכיל SAN ו- AVN ^6,7,8. בקצרה, SAN ממוקם באזור הבין-קוואלי של האטריום הימני הסמוך למסוף הקריסטה השרירי (CT), AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך שהוקם על ידי המסתם הטריקוספיד, האוסטיום של הסינוס הכלילי והגיד של טודרו. עד כה, ציוני דרך אנטומיים אלה שימשו בעיקר כדי למקם, להסיר ולאחר מכן לחקור SAN ו- AVN כמבנים בודדים (למשל, על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית). עם זאת, כדי להבין טוב יותר את האלקטרופיזיולוגיה המורכבת של SAN ו-AVN (למשל, השפעות רגולטוריות של תאים סמוכים של שריר הלב העובד), יש צורך לחקור את מערכות ההולכה בסביבה הפיזיולוגית התלת-ממדית.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה היא שיטה המשמשת לחקר מבנים אנטומיים באתרם תוך שמירה על שלמות הרקמה שמסביב⁹. באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה לניתוח תמונה, ניתן להמחיש SAN ו-AVN באמצעות נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי המכוונים לתעלות יונים המבוטאות באופן ספציפי באזורים אלה.

פרוטוקול זה להלן מסביר את השלבים הדרושים לביצוע שיטת צביעה מבוססת היטב להרכבה מלאה עבור לוקליזציה והדמיה של מיקרוסקופ SAN ו- AVN. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) למקם SAN ו- AVN לפי ציוני דרך אנטומיים כדי להכין דגימות אלה לצביעה ולניתוח מיקרוסקופיה (2) לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה של סמני הייחוס HCN4 ו- Cx43 (3) להכין דגימות SAN ו- AVN למיקרוסקופ קונפוקלי (4) לביצוע הדמיה קונפוקלית של SAN ו- AVN. אנו גם מתארים כיצד ניתן לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול צביעה נוספת של שריר הלב העובד שמסביב או תאים שאינם מיוציטים כגון סיבי עצב אוטונומיים המאפשרים חקירה יסודית של מערכת הולכת הלב בתוך הלב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת מינכן, וכל ההליכים שבוצעו בעכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). עכברי C57BL6/J נרכשו ממעבדת ג'קסון.

הערה: איור 1 מראה את המכשירים הדרושים לניסוי. איור 2 מראה המחשה של אנטומיה של הלב הגס. איור 3 מראה את המיקום של SAN ו-AVN בלב עכבר בוגר. איור 4 מראה את הדגימה המוכנה שהוטענה במיקרוסקופ קונפוקלי.

1. הכנות

1. הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% (4% PFA) על ידי דילול 10 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 16% ב-30 מ"ל PBS.
2. הכינו תמיסת 15% סוכרוז ותמיסת 30% סוכרוז על ידי המסת 15 גרם ו-30 גרם אבקת סוכרוז ל-PBS של 100 מ"ל, בהתאמה. לאחר המסת אבקת הסוכרוז במלואה, יש לסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים 0.2 מיקרומטר לפני האחסון בטמפרטורה של 4°C.
3. הכינו ג'ל אגרוז 3%-4%, הוסיפו 3 גרם או 4 גרם אבקת אגרוז ו-100 מ"ל של 1x TAE (מדולל מתמיסת מלאי TAE פי 50) לכוסית. מניחים את הכד על מערבל מגנטי ומרתיחים אותו עד שהאגרוז מומס לחלוטין.
4. מכינים את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של 30 מ"ל ג'ל אגרוז (3%-4%) בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. השאירו את צלחת הפטרי על הספסל בטמפרטורת החדר כדי להתקרר ולהתקשות.
5. הכינו תמיסת חסימה ותמיסת כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1. הכינו את כל הפתרונות שהוכנו ביום השימוש. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ.
6. הכינו את תמיסות הנוגדנים על ידי דילול שלהן בקור (4°C) 1x PBS, הגנו על הדילול מפני אור (למשל, על ידי עטיפת רדיד אלומיניום מסביב) ושמרו דילול על קרח עד לשימוש. לדלל את הנוגדנים זמן קצר לפני הדגירה. הימנעו מהשארת הנוגדנים המדוללים בטמפרטורת החדר.
   הערה: יש לבדוק את דילול הנוגדנים המתאים עם דגימות רקמה דומות על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית. כאן בדקנו את הנוגדנים על ידי צביעת חלקים קפואים שנחתכו בעובי של 10 מיקרומטר.

2. קצירת איברים והכנת רקמות

1. מרדימים את העכבר על ידי הכנסתו לתא דגירה המחובר למאדה איזופלורן. הגדר את הוופורייזר לספק 4-5% isoflurane (96-95% חמצן, בהתאמה).
   הערה: הרדמה מלאה מאושרת על ידי אובדן התגובה היציבתית ורפלקס התיקון על ידי גלגול עדין של החדר עד שהעכבר מונח על גבו.
2. שים את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. הכניסו את אף העכבר למסכת הרדמה המחוברת למעגל Bain שונה עם הצינור הפנימי שלו מחובר לוופורייזר איזופלורן. כדי לשמור על הרדמה, יש להשתמש באיזופלורן 1-2% בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה. יש לסלק אדי הרדמה עודפים מהעכבר דרך הצינור החיצוני של המסכה ולשאוב דרך מיכל של פחם פעיל, אשר סופג את גז ההרדמה העודף.
3. כאשר מושגת הרדמה מלאה, יש להזריק פנטניל לשיכוך כאבים (0.1 μגרם / 25 גרם משקל גוף i.p).
4. כאשר רפלקס צביטת הבוהן אינו ניתן לגילוי, בצע חתך ברור מהג'וגולום לסימפיזיס באמצעות מספריים של הקשתית כדי להסיר פרווה ועור. בצע חתך נוסף משמאל לימין מתחת לצלעות באמצעות מספריים הקשתית כדי לפתוח בזהירות את הבטן.
5. לחיות את הקסיפואיד קצת באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לאפשר לחתוך את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים. חתכו את כלוב הצלעות בקו מדיאלי בבית השחי משני הצדדים באמצעות מספריים של הקשתית כדי להפוך אותו באופן גולגולתי ולאפשר גישה ללב.
6. חותכים את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים החזי היורד בגובה הסרעפת באמצעות מספריים קשתית. נקב את הלב עם מחט 27 G באזור הקודקוד ולאחר מכן בזהירות לדחוף את המחט לתוך החדר השמאלי (LV). הזריקו בעדינות 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח לתוך LV כדי לחורר את הלב.
   הערה: צבע הלב צריך להפוך מאדום לאפור המציין זילוח מוצלח עם PBS.
7. בזהירות להרים את הקודקוד של הלב באמצעות פינצטה המאפשר לחתוך את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב.
8. הבלו את הלב על ידי חיתוך העורקים והוורידים הגדולים רחוק ככל האפשר מהלב כדי למנוע נזק לווריד הנבוב העליון (SVC). שמור על SVC מכיוון שהוא ישמש ציון דרך חשוב במהלך עיבוד מאוחר יותר.
9. לאחר הסרת הלב, כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.
10. הכניסו את הלב לצלחת דיסקציה מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ המנתחת. לאחר קביעת שמאל/ימין וחזית/גב הלב, סובבו את הלב כשקדמת הלב בתחתית הצלחת (כדי לחשוף את כלי הדם הגדולים הממוקמים מאחור).
11. לשתק את הלב על-ידי הכנסת סיכה קטנה דרך הקודקוד ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה (איור 2A). בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, הסירו בזהירות רקמות שאינן לבביות סביב ה-SVC והווריד הנבוב התחתון (IVC) (למשל, ריאות, שומן, קרום הלב) כדי לחשוף את האזור הבין-קוואלי (איור 3A).
12. הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך מקביל את החריץ בין החדרים ואת אטריה עם מספריים מיקרו. שמרו חלק קטן מרקמת החדר לצורך העמסה מאוחרת יותר על טבעת הפרספקס.
13. עבור קיבוע והתייבשות, לשים את הדגימה (המכילה את אטריה, SVC ו IVC) ב 4% PFA לילה ב 4 ° C.
14. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 15% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
15. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור הקיבוע וההתייבשות בשלב 2.13, 2.14 ו-2.15, הדגימות נותרות בטמפרטורה של 4°C ללא ערבוב נוסף או נדנוד.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

1. יש לשטוף את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS ולחסום ולחדור בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך הלילה ב-4°C.
2. מניחים את הלב בצינור של 1.5 מ"ל ודגורים עם ארנב נגד עכבר connexin-43 (דילול של 1:200) ונוגדנים נגד עכבר HCN4 (דילול של 1:200) מדוללים בתמיסת חסימה במשך 7 ימים ב 4 ° C.
   הערה: יש לבדוק את הריכוז האופטימלי של נוגדנים ראשוניים לפני השימוש בגיליונות הנתונים כהתמצאות. גם אנטיגנים אחרים בעלי עניין עלולים להיות מוכתמים בשלב זה, כל עוד המין המארח של האנטיגן הראשוני שונה מהאחרים. ריכוז גבוה יותר של Triton X-100 עשוי לסייע בהשגת צביעת נוגדנים יעילה יותר כפי שהודגם לפני¹⁰, אך הריכוז עשוי להיקבע בנפרד.
3. לאחר 7 ימים, להסיר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה ולשטוף את הלב עם 1% Triton X-100 פתרון 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית).
4. לאחר השטיפה, לדגור על הלב = עם Alexa Fluor 488 עז נגד חולדה IgG (דילול של 1:200) ו Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (דילול של 1:200) במשך 7 ימים ב 4 ° C.
5. לאחר 7 ימים, להסיר את כל הפתרון המכיל נוגדנים משניים באמצעות פיפטה. לאחר מכן שטפו את הלב באמצעות תמיסת שטיפה (טבלה 1) 3 פעמים (כל פעם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על השייקר המסלולי).
6. כדי להכתים גרעינים, יש לדגור על הלב בתמיסת DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
7. למחרת, לשטוף את הלב עם פתרון כביסה 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי).
   הערה: עבור חסימה, חלחול, דגירה נוגדנים וצביעת DAPI בשלב 3.1, 3.2, 3.4 ו -3.6, להשאיר את הדגימות במצב יציב ב 4 ° C, אין צורך ערבוב. הרקמה המוכתמת יכולה להישמר מכוסה במלואה בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור למשך מספר ימים עד להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. הכינו טבעות פרספקס ומלאו בפלסטלינה (איור 1). במרכז הפלסטלינה נוצר חריץ קטן במרכז לטעינת הלב. צרו חריץ רדוד, מכיוון שיהיה קל יותר לרכוש מישור הדמיה שטוח, ולהתאים את החלל ולהימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסויים בשלב 4.4.
2. השתמש באותה דגימת לב להדמיה של SAN ו- AVN ברצף. עבור הדמיית SAN, טען ישירות את הלב ואילו עבור הדמיית AVN, בצע מיקרודיסקציה לפני.
   1. הדמיית SAN
      1. זהה את SAN לפי ציוני דרך אנטומיים: הוא ממוקם בצד הגבי של הלב בתוך האזור הבין-קוואלי (האזור שבין הווריד הנבוב העליון והנחות). קריסטה טרמינליס (באנגלית: crista terminalis, CT) הוא פס השרירים שבין ה-SAN ל-RAA.
      2. הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
      3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לחץ בעדינות את RAA, LAA ואת החלקים הנותרים של החדר השמאלי לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב. ודא כי כל האזור inter-caval ואת מסוף crista ניתן לראות בבירור (לא מכוסה על ידי פלסטלינה). האזור שיצולם מוצג באיור 3A.
   2. הדמיית AVN
      1. לאחר סיום ההדמיה של SAN, אסוף מחדש את אותה דגימה ולאחר מכן השתמש בה עבור הדמיית AVN. עבור מיקרודיסקציה AVN, הניחו את הלב = על צלחת דיסקציה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
      2. כיוון הלב כאשר צד ימין פונה כלפי מעלה (כולל החלקים הנותרים של החדר הימני). שימו פינים דרך החלק הנותר של הדופן החופשית של LV (שנמצא עכשיו בתחתית) כדי לשתק את הרקמה (איור 2B).
      3. חתכו את הדופן הפנויה הנותרת של RV כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. לאחר מכן הפוך את RV ו- RA כדי לחשוף מחיצות בין-חדריות ובין פרוזדוריות. (איור 3B)
         הערה: שימו לב לא לפגוע בסינוס הכלילי (CS), שכן זהו ציון דרך אנטומי חשוב למצוא את המשולש של קוך אשר לאחר מכן מאפשר למקם את AVN. ה-CS עובר באופן רוחבי בחריץ האטריובנטריקולרי השמאלי בצד האחורי של הלב, ופתח ה-CS ממוקם בין IVC לבין המסתם הטריקוספיד בחלק התחתון של המחיצה הבין-פרוזדורית (איור 3A ו-B).
      4. זהה את המשולש של קוך שניתן למצוא על פני השטח האנדוקרדליים של האטריום הימני, הגובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של המסתם הטריקוספיד (TV), ואחורית על ידי גיד טודרו. הבסיס נוצר על-ידי פתח הסינוס הכלילי (איור 3B). מכיוון שזהו אזור היעד להדמיית AVN, הוא צריך להיות גלוי בבירור.
      5. מעבירים את הלב לחריץ הפלסטלינה בתוך טבעת הפרספקס כאשר משולש קוך חשוף בבירור (כלומר לא מכוסה בפלסטלינה). לחץ בעדינות על הרקמה סביב משולש קוך לתוך הפלסטלינה כדי לקבע את הדגימה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
3. יש למרוח סיליקון על שולי טבעות הפרספקס כדי לאפשר כיסוי הלבבות הטעונים בתוך טבעות הפרספקס מלאות הפלסטלינה באמצעות החלקות כיסוי.
4. לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלקים של PBS ולחבר את הלב לכיסוי תוך הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה.
   הערה: ודא שאזורי העניין אינם מקופלים ומכוסים במהלך לחיצה על הצד האחורי של הפלסטלינה. מישור הדמיה שטוח ללא דחיסת יתר של הדגימה נחוץ לשימור האנטומיה ולהדמיה קונפוקלית נכונה של הדגימות. עבור SAN, חשוב לוודא שהאזור הבין-קוואלי חשוף בבירור. עבור AVN, המשולש של קוך צריך להיות חשוף במלואו.
5. הניחו את דגימות הצביעה בהרכבה שלמה הפוכה על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי. ה-SAN/AVN החשוף המחובר לחלקת הכיסוי נמצא כעת בתחתית פלטפורמת המיקרוסקופ (איור 4).
   הערה: כדי לצלם תמונות, אנו משתמשים ב- Carl Zeiss LSM800 עם Airyscan Unit ובתוכנה ZEN 2.3 SP1 שחור.
6. בחר צלחת "BP420-480 + LP605" עבור עירור של Alexa Fluor 647 מצומד אנטי HCN4. לשנות את רווח המאסטר מ 650-750.
7. צלם תמונת סקירה כללית של אזור SAN ו- AVN כולו באמצעות הפונקציה סריקת אריחים . לאחר מכן בחר את האזור החיובי HCN4 על ידי לחיצה והוספת ריבוע על תמונת הסקירה סביב אזור העניין שייסרק.
8. בדוק את הפרמטרים, כולל לוחות ורווח מאסטר עבור שאר הערוצים (Alexa Fluor 488 ו- DAPI) של המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר כמתואר בשלב 4.6.
9. כוונן באיטיות את המוקד מלמעלה למטה של הדגימה כדי להציג תצוגה מקדימה של הדגימה כולה ולהגדיר את הראשון והאחרון עבור טווח מחסנית Z. הגדר מרווח זמן אופטימלי עבור מחסנית Z בהתבסס על עובי הדגימה האופטית. אנו משתמשים במטרה של 20x, ו- 0.8-1 מיקרומטר כמרווח עבור Z-stack.
10. לאחר שכל הפרמטרים מוגדרים כראוי, סרוק את כל האזור של SAN ו- AVN.
11. בצע שחזור תלת ממדי של התמונות באמצעות תוכנה (למשל, Imaris גרסה 8.4.2).
    1. בחר עיבוד תמונות | חיסור קווי בסיס להסרת צביעת רקע.
    2. בחרו 'יצירת משטח ב'קביעה' לערוץ ולאזור העניין שנבחרו לעיבוד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ניתן לבצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של SAN והן של AVN. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-HCN4 וצביעה של שריר הלב העובד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-Cx43 מאפשרת זיהוי ברור של SAN (איור

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנטומיה של הלב נחקרה באופן מסורתי באמצעות חתכים היסטולוגיים דקים¹¹. עם זאת, שיטות אלה אינן משמרות את המבנה התלת מימדי של מערכת ההולכה ולכן מספקות מידע דו-ממדי בלבד. פרוטוקול צביעת האימונופלואורסנציה המתואר כאן מאפשר להתגבר על מגבלות אלה וניתן להשתמש בו באופן שגרתי להדמיית SAN ו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory