ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

Summary

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

Abstract

בדיקה חדשנית זו המבוססת על מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת מאפשרת מדידה סימולטנית של אורך המחזור הקטליטי עבור מאות מולקולות אנדונוקלאז הגבלה אינדיבידואליות (REase) בניסוי אחד. בדיקה זו אינה דורשת תיוג חלבונים וניתן לבצע אותה בערוץ הדמיה יחיד. בנוסף, ניתן לאגד את התוצאות של ניסויים בודדים מרובים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב. ניתוח ההתפלגויות המתקבלות בזמן השהייה יכול לעזור להבהיר את מנגנון פיצול הדנ"א על ידי חשיפת נוכחותם של צעדים קינטיים שלא ניתן לצפות בהם ישירות. נתונים לדוגמה שנאספו באמצעות בדיקה זו עם REase שנחקר היטב, EcoRV - אנדונוקלאז הגבלה דימרי מסוג IIP המבקע את הרצף הפלינדרומי GAT↓ATC (כאשר ↓ הוא האתר החתוך) - תואמים מחקרים קודמים. תוצאות אלה מצביעות על כך שישנם לפחות שלושה שלבים במסלול לפיצול DNA שמתחיל על ידי החדרת מגנזיום לאחר ש- EcoRV קושר DNA בהיעדרו, עם קצב ממוצע של 0.17 ^s-1 לכל שלב.

Introduction

אנדונוקלאז הגבלה (REases) הם אנזימים המשפיעים על הפסקות דו-גדיליות ספציפיות לרצף בדנ"א. גילוי REases בשנות השבעים הוביל לפיתוח טכנולוגיית DNA רקומביננטי, ואנזימים אלה הם כיום כלי מעבדה חיוניים לשינוי גנטי ומניפולציה¹. REases מסוג II הם האנזימים הנפוצים ביותר בקבוצה זו מכיוון שהם מבקעים דנ"א במיקום קבוע בתוך או בסמוך לרצף הזיהוי שלהם. עם זאת, קיימת שונות רבה בין REases מסוג II, והם מחולקים למספר תת-סוגים המבוססים על תכונות אנזימטיות מסוימות ולא מסווגים על פי היחסים האבולוציוניים שלהם. בין כל תת-סוג, ישנם חריגים תכופים לסכמת הסיווג, ואנזימים רבים שייכים למספר תת-סוגים². אלפי REases מסוג II זוהו, ומאות מהם זמינים מסחרית.

עם זאת, למרות הגיוון בין REases סוג II, מעט מאוד REases נחקרו בפירוט. על פי REBASE, מסד הנתונים של אנזימי הגבלה שהוקם על ידי סר ריצ'רד רוברטס בשנת 1975³, נתוני קינטיקה שפורסמו זמינים עבור פחות מ -20 אנזימים אלה. יתר על כן, בעוד שחלק מה-REases נצפו ישירות ברמת המולקולה הבודדת תוך כדי פיזור לאורך הדנ"א לפני המפגש והקישור לרצף הזיהוי שלהם 4,5,6,7, ישנם מעט מאוד מחקרים על מולקולות בודדות של קינטיקה של תגובת המחשוף שלהם. המחקרים הקיימים אינם מדווחים על נתונים סטטיסטיים מספיקים כדי לבצע ניתוח מפורט של השונות בזמנים שבהם אירועי מחשוף יחיד מתרחשים ^8,9,10 או שאינם מסוגלים ללכוד את ההתפלגות המלאה של פי^{המחשוף 11}. סוג זה של ניתוח יכול לחשוף את נוכחותם של מתווכים קינטיים בעלי תוחלת חיים ארוכה יחסית ויכול להוביל להבנה טובה יותר של מנגנוני פיצול ה- DNA בתיווך REase.

ברמת המולקולה הבודדת, תהליכים ביוכימיים הם סטוכסטיים - זמן ההמתנה למופע יחיד של התהליך להתרחש, τ, משתנה. עם זאת, מדידות רבות של τ צפויות לציית להתפלגות הסתברות, p(τ), המעידה על סוג התהליך המתרחש. לדוגמה, תהליך חד-שלבי, כגון שחרור מולקולת מוצר מאנזים, יציית לסטטיסטיקה של פואסון, ו-p(τ) ילבש צורה של התפלגות מעריכית שלילית:

כאשר β הוא זמן ההמתנה הממוצע. שימו לב שקצב התהליך, k, יהיה שווה ל-1/β, ההופכי של זמן ההמתנה הממוצע. עבור תהליכים הדורשים יותר משלב אחד, p(τ) יהיה הפיתול של ההתפלגויות המעריכיות הבודדות עבור כל אחד מהצעדים הבודדים. פתרון כללי לפיתול של N פונקציות דעיכה חד-מעריכיות בעלות זמני המתנה ממוצעים זהים, β, הוא התפלגות הסתברות הגמא:

כאשר Γ(N) היא פונקציית הגמא, המתארת את האינטרפולציה של העצרת של N-1 לערכים שאינם שלמים של N. למרות שניתן להשתמש בפתרון כללי זה כקירוב כאשר זמני ההמתנה הממוצעים של צעדים בודדים דומים, יש להבין כי הימצאותם של צעדים מהירים יחסית תווסווה על ידי צעדים בעלי זמני המתנה ארוכים משמעותית. במילים אחרות, הערך של N מייצג גבול נמוך יותר למספר השלבים¹². עם מספר מספיק של מדידות זמן המתנה, ניתן להעריך את הפרמטרים β ו- N על ידי כריכת האירועים והתאמת התפלגות הגמא להיסטוגרמה המתקבלת או על ידי שימוש בגישת הערכת סבירות מרבית. סוג זה של ניתוח יכול אפוא לחשוף את נוכחותם של צעדים קינטיים שלא ניתן לפתור בקלות במבחני אנסמבל ודורש מספר רב של תצפיות כדי להעריך פרמטרים במדויק^12,13.

מאמר זה מתאר שיטה לשימוש בדנ"א המסומן בנקודות קוונטיות ובמיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) כדי לצפות במאות אירועי מחשוף דנ"א בודדים בתיווך REase במקביל. תכנון הבדיקה מאפשר לאגד תוצאות של מספר ניסויים ויכול ליצור התפלגות זמן שהייה המכילה אלפי אירועים. יציבות האור הגבוהה והבהירות של נקודות קוונטיות מאפשרות רזולוציית זמן של 10 הרץ מבלי להקריב את היכולת לצפות באירועי מחשוף המתרחשים אפילו דקות רבות לאחר תחילת הניסוי. רזולוציית זמן טובה וטווח דינמי רחב, בשילוב עם היכולת לאסוף מערך נתונים גדול, מאפשרים אפיון מדויק של התפלגויות זמן השהייה כדי לחשוף את נוכחותם של שלבים קינטיים מרובים במסלולי המחשוף של REases, שיש להם שיעורי תחלופה בטווח של 1 דקות ¹ . במקרה של EcoRV, ניתן לפתור שלושה שלבים קינטיים, שכולם זוהו באמצעים אחרים, המאשרים כי הבדיקה רגישה לנוכחותם של צעדים כאלה.

מצעי דנ"א דו-צדדיים המכילים את רצף הזיהוי המעניין מיוצרים על ידי חישול אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה לגדיל משלים המסומן בנקודה קוונטית ננו-גבישית מוליכים למחצה יחידים. מצעים אלה מוחדרים לתעלת זרימה הבנויה על גבי כיסוי זכוכית עם מדשאה של מולקולות פוליאתילן גליקול (PEG) בעלות משקל מולקולרי גבוה המחוברות באופן קוולנטי לפני השטח שלה. מצעי הדנ"א נלכדים באמצעות קישור ביוטין-סטרפטווידין-ביוטין על ידי חלק קטן ממולקולות ה-PEG שיש להן ביוטין בקצה החופשי שלהן. במיקרוסקופ TIRF, גל אוונסנטי הדועך באופן אקספוננציאלי עם המרחק מממשק זכוכית-נוזל מספק תאורה; עומק החדירה הוא בסדר גודל אורך הגל של האור בו נעשה שימוש. בתנאים אלה, רק נקודות קוונטיות הקשורות לפני השטח על ידי מולקולת דנ"א שנלכדה על משטח הזכוכית המתפקד יעוררו. נקודות קוונטיות חופשיות בתמיסה לא יוגבלו בתוך האזור המואר ולכן לא יאירו אותן. אם הדנ"א הקושר נקודה קוונטית לפני השטח ייבקע, אותה נקודה קוונטית תהיה חופשית להתפזר הרחק מפני השטח, והיא תיעלם מהתמונה הפלואורסצנטית.

אף על פי שידוע כי REases רבים מסוג II קושרים דנ"א בהיעדר מגנזיום¹⁴, כולם דורשים מגנזיום כדי לתווך את מחשוף הדנ"א¹⁵. REases אלה יכולים לקשור את הדנ"א המשותק בפני השטח בהיעדר מגנזיום. כאשר חיץ המכיל מגנזיום מוזרם דרך תעלה עם REase מראש לדנ"א, המחשוף מתחיל מיד, כפי שמצוין על ידי היעלמות של נקודות קוונטיות. הסנכרון המושג על ידי קשירה מוקדמת של מולקולות REase, ולאחר מכן התחלת פיצול DNA על ידי החדרת מגנזיום, מאפשר מדידה של זמן הפיגור עד להשלמת פיצול DNA באופן עצמאי עבור כל מולקולה באוכלוסיית האנזימים שנצפתה בניסוי. פלואורסצאין נכלל כצבע נותב במאגר המכיל מגנזיום כדי לציין את הגעתו של מגנזיום לשדה הראייה. מכיוון שאף אנזים אינו כלול במאגר המכיל מגנזיום, זמן הפיגור מהגעתו של חיץ המכיל מגנזיום להיעלמותו של כל נקודה קוונטית מציין את הזמן שלוקח ל-REase שכבר קשור לדנ"א לבקע את הדנ"א ולשחרר את הנקודה הקוונטית מפני הזכוכית. היעלמות נקודה קוונטית מתרחשת במהירות וגורמת לירידה חדה במסלול העוצמה, מה שמספק אינדיקציה ברורה לזמן שבו מולקולת דנ"א נתונה נבקעת. קביעת זמני האירועים מושגת על ידי ניתוח מתמטי של מסלולי עוצמה, וניסוי טיפוסי מביא למאות אירועי מחשוף הניתנים לזיהוי. ניתן לאגד את התוצאות של ניסויים מרובים כדי לספק סטטיסטיקה נאותה שתאפשר הערכה של הפרמטרים, N ו- β, על ידי ריבועים לא ליניאריים או ניתוח סבירות מרבית.

Protocol

1. מידע כללי

1. עיצוב אוליגונוקלאוטיד
   הערה: מצע DNA באורך 60 זוגות בסיסים (bp) נוצר מזוג אוליגונוקלאוטידים משלימים עם טמפרטורת התכה דו-צדדית של 75 ° C ב- 100 mM NaCl.
   1. הזמינו אוליגונוקלאוטיד אחד מסונתז עם שינוי ביוטין יחיד של 5' והשני עם שינוי תיול של 5' (עם ספייסר של שישה פחמנים). מקם את אתר הזיהוי במרכז אזור הדופלקס.
      הערה: רצפי האוליגונוקלאוטידים לשימוש עם EcoRV מוצגים להלן (אתר הזיהוי מודגש).
      5' ביוטין - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' תיול - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. יש להשתמש במים טהורים במיוחד עם התנגדות של 18 MOhm לכל השלבים.
3. הגן על כל הפתרונות המכילים נקודות קוונטיות מפני אור כדי למנוע הלבנה.
4. השתמש במקור אוויר דחוס כדי להשלים פרוטוקול זה.

2. הכנת חומרי מצע DNA בעלי תווית נקודה קוונטית

הערה: מלבד האוליגונוקלאוטידים שתוארו לעיל, ראה טבלת חומרים עבור חומרים אחרים וטבלה 1 עבור חוצצים הדרושים להכנת מצעי DNA המסומנים בנקודות קוונטיות.

1. הפחיתו קבוצות תיול 5' על האוליגונוקלאוטיד כדי להיות מצומדות לנקודות קוונטיות.
   1. יש להשהות מחדש כל אוליגונוקלאוטיד שעבר תיאולציה במים בריכוז של 100 מיקרומטר.
   2. פיפט 650 μL של מים לתוך עמודת ספין אי הכללת גודל עבור כל דגימת אוליגונוקלאוטידים, ומערבולת עבור ~ 15 שניות. השאירו את העמודה לארוז למשך 30 דקות.
   3. הכינו תמיסת dithiothreitol (DTT) טרייה של 100 mM מיד לפני כל שימוש, שכן DTT מתפרק בתמיסה במהירות. בזהירות לפתוח בקבוקון אחד המכיל 7.7 מ"ג של DTT, ו pipet 500 μL של נתרן פוספט חיץ לתוך הבקבוקון; מערבולת לערבב היטב.
   4. עבור כל אוליגונוקלאוטיד מרחף, הכינו צינור חדש, והוסיפו 50 μL של האוליגונוקלאוטיד ו-50 μL של תמיסת DTT לצינור. מקציפים למעלה ולמטה כדי לערבב. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית את הקשרים הדיסולפידים בין קבוצות התיול המחומצנות בקצה 5' של האוליגונוקלאוטידים.
   5. הסר את מכסי עמודות הסחיטה והנח כל עמודה בצינור האיסוף. צנטריפוגו את עמודי הסחרור ב 750 × גרם למשך 2 דקות, והשליכו את הפולט.
   6. מעבירים את עמודי הסחרור לצינורות צנטריפוגות טריים. טפחו בעדינות את כל הנפח (100 μL) של דגימה אחת של תערובת DNA/DTT על כל עמודה מוכנה. צנטריפוגה ב 750 × גרם במשך 2 דקות, ולמדוד את ספיגת הפולט ב 260 ננומטר כדי לאשר כי הריכוז הוא כ 40 מיקרומטר.
   7. אחסן דגימות שלא ישמשו באופן מיידי בטמפרטורה של -20°C כדי למנוע חמצון של קבוצות תיול והיווצרות קשרים דיסולפידים.
2. צימוד דנ"א לנקודות קוונטיות
   1. פיפט אליציטוט אחד של 50 מיקרוליטר של מלאי הנקודות הקוונטיות לתוך מכשיר דיאליזה עבור כל מבנה שייעשה, תוך הקפדה לא לגעת בקרום עם קצה הפיפטה. Dialyze כנגד נפח של N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES) חיץ שהוא לפחות 1000x נפח הדגימה עם ערבוב ב~ 100 סל"ד במשך 15 דקות.
   2. הכינו תמיסה טרייה של 6 mM של sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) במאגר CHES מיד לפני כל שימוש. פתחו בזהירות בקבוקון אחד המכיל 2 מ"ג סולפו-SMCC, ופיפט 800 מיקרוליטר של חיץ CHES לתוך הבקבוקון. מערבולת לערבב היטב.
   3. באמצעות פיפטור, שלפו בזהירות את הנקודות הקוונטיות המרחפות ממכשיר הדיאליזה, והעבירו לצינור טרי המכיל נפח שווה של תמיסת סולפו-SMCC; מציפים למעלה ולמטה כדי לערבב. יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם רעידות ב-1000 סל"ד כדי לאפשר לסולפו-SMCC להגיב עם האמינים הראשוניים על הנקודות הקוונטיות.
   4. באמצעות פיפטור מעבירים בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי. כדי להסיר עודפי סולפו-SMCC, יש לנטרל כנגד נפח של חיץ CHES שהוא לפחות פי 1000 מהנפח הכלול במכשירי הדיאליזה, תוך ערבוב, למשך 15 דקות. החליפו את החיץ 2x, ובצעו דיאליזה עם חיץ CHES טרי 3x בסך הכל, מה שמאפשר לדיאליזה להמשיך 15 דקות לאחר כל החלפת חיץ.
   5. כדי להחליף את המאגר כהכנה לתגובה השנייה, העבר את מכשירי הדיאליזה לכוס המכילה נפח של מלח חוצץ פוספט (PBS) שהוא לפחות פי 1000 מהנפח הכלול במכשיר(ים). יש לערבב עם ערבוב במשך 15 דקות, להחליף את החיץ 2x, ולבצע דיאליזה עם PBS טרי 3x בסך הכל, המאפשר דיאליזה להמשיך במשך 15 דקות לאחר כל החלפת חיץ.
   6. באמצעות פיפטור יש לשחזר בזהירות את התמיסה המכילה את הנקודות הקוונטיות ממכשירי הדיאליזה, ולהעביר כל דגימה לצינורית טרייה המכילה כמות שווה ערך של אוליגונוקלאוטיד מדולל ב-PBS. שלב נפח שווה של PBS^{ועשירית} מהנפח של דגימת אוליגונוקלאוטיד מופחתת ומטוהרת (ריכוז של כ -40 מיקרומטר) מכיוון שריכוז הנקודה הקוונטית בנקודה זו הוא ~ 4 מיקרומטר. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, עם רעד ב 1000 סל"ד.
   7. הוסף אלבומין בסרום בקר (BSA, 10 מ"ג / מ"ל) לכל דגימה כדי לקבל ריכוז BSA סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל. באמצעות פיפטור, העבירו בזהירות כל דגימה למכשיר דיאליזה טרי, ובצעו דיאליזה כנגד נפח של מאגר אחסון שהוא לפחות פי 1000 מהנפח הכלול במכשירי הדיאליזה. החליפו את המאגר פי 2 ובצעו דיאליזה עם מאגר אחסון טרי פי 3 בסך הכל, מה שמאפשר לדיאליזה להימשך 15 דקות לאחר כל החלפת מאגר.
   8. באמצעות pipettor, בזהירות לשחזר כל דגימה, לשים אותו, לתוך צינור חדש, ולאחסן ב 4 ° C.
      הערה: אין לאחסן בטמפרטורה של -20°C מכיוון שנקודות קוונטיות ניזוקות מהקפאה.
3. חישול של אוליגונוקלאוטיד המסומן בנקודות קוונטיות לאוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה
   1. יש להשהות מחדש כל אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה במאגר אחסון בריכוז של 100 מיקרומטר. אחסנו דגימות שאינן בשימוש בטמפרטורה של -20°C.
   2. שלבו דגימה של אוליגונוקלאוטיד עם תווית נקודה קוונטית עם עודף מולארי פי 10 של אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה. מכיוון שהריכוז המשוער של דנ"א בדגימה המסומנת בנקודה קוונטית הוא 2 מיקרומטר, הוסף 0.2 μL של אוליגונוקלאוטיד ביוטינילציה עבור כל 10 μL של דגימה זו.
   3. מחממים את התערובת בבלוק חום ל-75°C (טמפרטורת ההתכה של האזור המשלים). החזיקו בטמפרטורה זו למשך 5 דקות. כבו את בלוק החום ואפשרו לו להתקרר לאט. לאחסן את המבנה שהושלם ב 4 °C; אין להקפיא.

3. פונקציונליות פני השטח של כיסויים

הערה: תהליך זה תואר בעבר בפרוטוקולי וידאו אחרים של JoVE^16,17. פרוטוקול זה מתאר גרסה מותאמת של ההליך עם שינויים קלים כדי להתאים לשקופית זכוכית קטנה יותר. ראה טבלת החומרים עבור חומרים אחרים הדרושים לתפקוד פני השטח של כיסויים.

1. הכניסו 5 כיסויים לכל מחזיק כיסויים. הקפידו לדלג על רווח אחד בין כל זוג כיסויים כדי שלא יידבקו זה לזה. הניחו את פתקי הכיסוי במחזיק שלהם לתוך צנצנת עם כיסוי, הוסיפו אתנול לצנצנת עד שהכיסויים כוסו, והבריגו את החלק העליון היטב. הכניסו את כל הצנצנת למים בסוניק האמבטיה, מבלי לטבול אותה לחלוטין, ובצעו סוניקציה למשך 30 דקות.
2. מלאו נקייה או צנצנת נקייה במים טהורים במיוחד. השתמשו בפינצטה ממתכת כדי להסיר את הכיסויים שבמחזיק שלהם מהאתנול, וטבלו אותם במים לשטיפה. לאחר מכן, העבירו את הכיסויים והמחזיק לצנצנת המכילה תמיסת אשלגן הידרוקסיד (KOH) בנפח 1 M. הבריגו היטב את החלק העליון, הניחו את הצנצנת באמבט הסוניקטור והפעילו סוניקציה למשך 30 דקות.
   הערה: יש לנקוט בזהירות בעת הטיפול בתמיסת KOH מכיוון שהיא קורוזיבי ומגרה.
3. חזור על הסוניקציה בתמיסת אתנול ו- KOH, שטיפת הכיסויים במים כמתואר לעיל בין כל שלב.
4. מעבירים את הכיסויים שבמחזיק שלהם לצנצנת נקייה מלאה באצטון טהור. סיימו את הניקוי על ידי ניקוי הצנצנת כמתואר לעיל למשך 30 דקות. אין לשטוף במים לאחר שלב זה.
5. בעזרת פינצטה ממתכת, מעבירים את הכיסויים שבמחזיק שלהם לכוס נקייה של 100 מ"ל המכילה 80 מ"ל אצטון טרי ומוט ערבוב בקנה מידה זעיר. הניחו את הכד על צלחת ערבוב מגנטית המוגדרת ל-1,000 סל"ד לפחות. בזמן ערבוב נמרץ של האצטון, הזרימו 1.6 מ"ל של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) לתוך הכד כדי ליצור תמיסת v/v של 2%.
   הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעת שימוש ב-APTES מכיוון שהוא קורוזיבי.
6. הניחו לכיסויים לדגור בתמיסה למשך 2 דקות, ולאחר מכן השתמשו בפינצטה מתכתית כדי להעביר את הכיסויים שבמחזיק שלהם לתוך מים כדי להרוות את התגובה. שוטפים את הכיסויים פעמיים נוספות, ומחליפים את המים בכד.
7. מרפאים את הכוס הסילנית בתנור ב 120 מעלות צלזיוס למשך 75 דקות. אם לא ממשיכים לשלב הבא באופן מיידי, אחסנו את הכיסויים תחת ואקום למשך מספר ימים לכל היותר.
8. להמיס N-hydroxysuccinimide (NHS) פוליאתילן גליקול אסטר (PEGs) ב 100 mM סודיום ביקרבונט (pH 8.2). השתמש ביחס של 10:1 בין PEG שהסתיים במתוקסי ל-PEG שהסתיים בביוטין, עם ~100 מ"ג/מ"ל של PEG שהסתיים על-ידי מתוקסי.
9. יש לשפוך 100 μL של תמיסת ה-PEG על מחצית מהכיסויים הסילניים היבשים, ולכסות כל אחד מהם בכיסוי שני. השתמשו בחתיכות קטנות של פרפילם המונחות בכל פינה כספייסרים כדי למנוע מהכיסויים להידבק זה לזה.
10. יש לדגור על הכיסויים בסביבה לחה למשך 3.5 שעות. הפרידו את כריכי הכיסוי. השתמשו בבקבוק השפריץ כדי לשטוף כל מכסה במים רבים ולייבש באוויר דחוס.
11. יש לאחסן כיסויים פונקציונליים תחת ואקום. הקפד לשמור על הצד שטופל ב- PEG מכיוון שהצד השני לא ילכוד את מצע ה- DNA.

4. בניית התקנים מיקרופלואידים

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור חומרים אחרים הדרושים לבניית ההתקן המיקרופלואידי.

1. באמצעות מולטיטול סיבובי ידני המצויד בסיבית גלגל נקודת יהלום מחודדת, קדח שני חורים בפינות מנוגדות של מגלשת הקוורץ כדי לשמש ככניסה ויציאה. הקפידו לאבטח את המגלשה במקומה, לשמן את החלק ולהחליק כל הזמן במים בזמן הקידוח. לאחר כל ניסוי, לשחזר את שקופית קוורץ מוכן לשימוש חוזר על ידי השריית מכשיר משומש אצטון כדי להמיס את דבק אפוקסי; השליכו את שאר המרכיבים.
   הערה: הקידוח יכול להתבצע ביד, אך השימוש במחזיק בסגנון מכבש עבור multitool מקל על התהליך.
2. שלב 25 μL של תמיסת סטרפטאווידין עם 80 μL של PBS ו 20 μL של חיץ חוסם. צפו כיסוי שעבר טיפול ב-PEG בתערובת זו, ודגרו בסביבה לחה במשך 30 דקות.
3. במהלך הדגירה של הכיסוי, הכינו את ספייסר ההדמיה ליצירת ערוץ זרימה. חתכו פיסה מרובעת בגודל 1 אינץ' של חומר ספייסר הדמיה, ואז סמנו תעלה ברוחב 2 מ"מ המיושרת לקצות החורים שנקדחו בשקופית הקוורץ (איור 2). חותכים את התעלה מחומר הספייסר בעזרת אזמל.
4. מקלפים צד אחד של הגב מהספייסר של התמונה ומניחים אותו בזהירות על שקופית הקוורץ, תוך הקפדה שלא לכסות את חורי הכניסה והיציאה. הקפד לנקות את שקופית הקוורץ ביסודיות עם אצטון כדי להסיר שאריות של דבק מניסויים קודמים.
5. שטפו את הכיסוי במים, וייבשו באוויר דחוס. הסירו את הצד השני של הגב מהספייסר של ההדמיה, ודחפו אותו בין מגלשת הקוורץ לבין הכיסוי המתפקד המצופה סטרפטווידין, תוך שימוש בפינצטה מפלסטיק כדי להצמיד את המכלול יחד ולהסיר בועות אוויר מהדבק.
6. הכנס צינור פוליאתילן אחד באורך 30 ס"מ לכל חור בשקופית הקוורץ. הקפד לחתוך את קצוות הצינור בזווית כדי להבטיח זרימה חופשית של תמיסה. השתמש במתלה צינורות או תמיכה אחרת כדי להחזיק את הצינורות במקומם, ואטם את הצינורות במקומם ואת שולי המכשיר המורכב עם אפוקסי.
   הערה: זה עובד טוב כדי לבנות את המכשיר על חתיכת parafilm, אשר ניתן בקלות לקלף מן התחתית כאשר אפוקסי שקע.
7. לאחר שהאפוקסי שקע, הכנס את המחט הקהה על המזרק הריק לתוך צינור היציאה של המכשיר, ושקע את קצה צינור הכניסה במיכל מלא בחיץ חוסם. משוך לאחור את בוכנת המזרק כדי למלא את המכשיר במאגר חוסם. יש להשאיר את המכשיר לדגור לפחות 30 דקות לפני השימוש.

5. קשירה על פני השטח של מצע DNA מסומן בנקודות קוונטיות

הערה: מלבד ההתקן המיקרופלואידי, מצע הדנ"א והמאגר החוסם שתוארו לעיל, ראה טבלת החומרים עבור חומרים אחרים וטבלה 1 עבור חוצצים הדרושים לקשירת פני השטח של מצעי דנ"א המסומנים בנקודות קוונטיות.

1. חברו את המכשיר המיקרופלואידי ללוח שלב המיקרוסקופ בעזרת נייר דבק, הביאו את המטרה למגע עם תחתית המכשיר, ומקמו את המטרה כך ששדה הראייה יהיה בתוך התעלה המיקרופלואידית.
2. שטפו את התעלה המיקרופלואידית בחיץ חוסם טרי על ידי משיכת בוכנת המזרק לאחור לאחר חיבור צינור היציאה למשאבת המזרק. בדקו שאין בועות כלואות בצינורות או בתעלה.
   הערה: מנקודה זו ואילך, ודא שצינור הכניסה נמצא בנוזל כך שלא יוכנסו בועות אוויר למכשיר.
3. לדלל 1 μL של מצע DNA מוכן לתוך 1 מ"ל של חיץ חוסם. הכניסו את צינור הכניסה לתוך מצע הדנ"א המדולל, והזרימו 800 מיקרוליטר של תמיסת המצע דרך התעלה בקצב של 200 מיקרוליטר/דקה. אפשרו לתמיסת הדנ"א לדגור בתעלה ללא הפרעה במשך 15 דקות לאחר הפסקת הזרימה.
4. זרימה של לפחות 800 μL של חיץ חוסם דרך התעלה בקצב של 200 μL / min כדי לשטוף את ה- DNA הלא קשור מתוך התעלה.
5. כוונן את עוצמת הלייזר, מיקוד המיקרוסקופ וזווית TIRF כך שהנקודות הקוונטיות הקשורות לפני השטח ייראו בבירור.
   הערה: למרות שנקודות קוונטיות אינן מלבינות במהירות, עדיף לשמור על עוצמה נמוכה ככל האפשר כדי למזער מצמוץ.

6. מחשוף DNA בתיווך REase

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור חומרים ובטבלה 1 עבור חוצצים הדרושים עבור מחשוף DNA בתיווך REase.

1. ודא שהמצלמה מקוררת לטמפרטורת הפעלה אופטימלית ומוגדרת להזרמה במהירות גבוהה עם זמן חשיפה של 0.10 שניות. היו מוכנים לאסוף נתונים במשך ~4 דקות.
2. שטפו את המכשיר המיקרופלואידי ב-800 מיקרוליטר של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום בקצב זרימה של 200 מיקרוליטר/דקה.
3. מוסיפים את ה-REase לאליקוט (1 מ"ל) של חיץ ניסיוני ללא מגנזיום, ומערבבים בעדינות על ידי פיפט. השתמש 4 μL של 100,000 יחידות / mL המלאי, אשר מתאים 400 יחידות / מ"ל של EcoRV. זרימה של 800 μL של האנזים המדולל דרך התעלה בקצב זרימה של 200 μL/min.
4. התחל את הניסוי על ידי חיץ ניסיוני זורם המכיל מגנזיום ופלואורסצאין בקצב זרימה של 200 μL/min. התחל ללכוד נתונים מיד לאחר הפעלת משאבת המזרק. לאחר זרימה של 800 μL של חיץ, עצור את איסוף הנתונים.

7. ניתוח נתונים

הערה: עיין בטבלת החומרים עבור תוכנת ניתוח הנתונים המשמשת לפרוטוקול זה, ובצע התאמות אם אתה משתמש בפלטפורמת ניתוח אחרת.

1. קביעת נקודת זמן אפסית
   1. הפחת פלואורסצנטיות רקע מכל פריים של הסרט הניסיוני באמצעות פונקציית imtophat , פונקציית סינון מורפולוגית מובנית בארגז הכלים לעיבוד תמונה. בחר דיסק ברדיוס של שלושה פיקסלים כרכיב המבנה. השיגו את עוצמת הרקע באמצעות הפחתת התמונה המסוננת מהתמונה המקורית.
      הערה: המסנן שומר רק על תכונות תמונה בהירות יותר מהרקע וקטנות יותר מהרכיב המבנה.
   2. ממוצע הרקע שהוחסר בכל מסגרת סרט. השתמשו במסלול של הערך הזה כדי לקבוע את נקודת זמן האפס של הניסוי (איור 3A). קבע את זמן ההתחלה על ידי מציאת המסגרת הראשונה שבה קצב הגידול עולה על פי 3 מסטיית התקן של קצב השינוי במהלך זרימת הנפח המת.
      הערה: עלייה חדה בקצב השינוי של הערך הממוצע של הרקע שהוחסר עבור כל מסגרת סרט מציינת את הזמן שבו המאגר הניסיוני הסופי המכיל את צבע הנותב נכנס לתא הזרימה (איור 3B).
2. חישוב וניתוח מסלול עוצמת נקודה קוונטית
   1. חשב הקרנה בעוצמה מרבית לערכת מסגרות סרט מתוקנות רקע שהוקלטו לפני הגעת צבע הנותב. קבע את מיקומן של נקודות קוונטיות לדיוק של פיקסל אחד בתמונת הקרנה זו באמצעות פונקציית מציאת שיא, כגון pkfnd.
   2. צור מסלולי עוצמה עבור נקודות קוונטיות בודדות על-ידי חישוב העוצמה הממוצעת בכל מסגרת סרט של אזור ריבועי, שלושה פיקסלים לכל צד המקיף את המיקום המוחזר על-ידי פונקציית מציאת השיא.
      הערה: תיקון הרקע המתואר לעיל מסיר את החפצים שהוכנסו על-ידי צבע הנותב. מסלולי העוצמה המתקבלים צריכים להיות שטוחים יחסית, אך עדיין לכלול תנודות עוצמה טבעיות (איור 4).
   3. זיהוי אירועי היעלמות נקודה קוונטית על ידי ניתוח סטטיסטי של מסלולי העוצמה. עבור כל מסלול של עוצמת נקודה קוונטית, יש לחשב עוצמת סף שהיא מעל הערך המינימלי בשבר מתאים מההפרש בין ערכי המקסימום והמינימום עבור מסלול זה, בהתאם לרעש שנצפה במסלולים.
      הערה: תנודות העוצמה של הנקודה הקוונטית הן בדרך כלל הרבה יותר גדולות מתנודות הרקע. ניתן לקבוע ערך מתאים על ידי השוואת ערכים אלה: הסף שנבחר חייב להיות גבוה מערך הרקע הגבוה ביותר, אך באופן אידיאלי להיות נמוך מהערך הנמוך ביותר עבור פלואורסצנטיות נקודה קוונטית. עבור הנתונים שהוצגו, הסף שבו נעשה שימוש חושב להיות מעל הערך המינימלי עבור כל מסלול בתוספת שליש מההפרש בין ערכי המקסימום והמינימום עבור מסלול זה. נקודה קוונטית יכולה להיחשב כנעלמת בנקודת הזמן האחרונה שבה העוצמה הנצפית במיקומה הייתה מעל סף זה.
   4. לאשר אירועי היעלמות משוערים. לכלול אירועים בניתוח הסופי רק אם העוצמה הנצפית היא מעל נקודת האמצע בין ערכי העוצמה המינימלית והמקסימלית עבור המסלול עבור יותר ממחצית מסגרות הסרט לפני זמן ההיעלמות וסטיית התקן של מסלול העוצמה פחתה לאחר האירוע.
      הערה: ניתן להשתמש בבדיקות סטטיסטיות אחרות כדי להבטיח שרק אירועי היעלמות חוקיים נרשמים.

תוצאות

תא הזרימה מחובר ישירות למטרת הגדלה של 60x צמצם מספרי גבוה במיקרוסקופ הפוך המצויד בתאורת לייזר להדמיית TIRF אובייקטיבית (איור 5A). לאחר החדרת מצע הדנ"א ושטיפת עודפי דנ"א ונקודות קוונטיות, יש בדרך כלל אלפי נקודות קוונטיות בודדות בשדה ראייה (איור 5B). נקודות קוונטיות...

Discussion

מצע הדנ"א של בדיקה זו מסומן בנקודה קוונטית באמצעות סכמת תגובה דו-שלבית באמצעות sulfo-SMCC. קרוסלינקר דו-תפקודי זה מורכב ממויטי אסטר NHS שיכול להגיב עם אמין ראשוני, ומויטי מלימיד שיכול להגיב עם קבוצת סולפידריל²⁰. האוליגונוקלאוטידים התיאולטיים המשמשים להכנת המצע נשלחים בצורתם המחומצ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-aminopropyltriethoxysilane (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Store in dessicator box
5 Minute Epoxy	Devcon	20845	use for sealing the microfluidic device
acetone	Pharmco	329000ACS	use for cleaning coverslips
bath sonicator	Fisher Scientific	CPXH Model 2800	catalog number 15-337-410
Beaker, glass, 100 mL
Benchtop centrifuge
Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Succinimidyl valerate has a longer half-life than succinimidyl carbonate
biotinylated oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	custom - see protocol for design considerations	Request 5' Biotin modification and HPLC purification
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	0903-5G	prepare a 10 mg/mL solution (aq) and heat to 95 °C before using
Centri-Spin-10 Size Exclusion Spin Columns	Princeton Separations	CS-100 or CS-101	used to purify thiolated oligonucleotides after reducing the disulfide bond
Centrifuge tubes 1.5. mL
Coverslips, 1-inch square glass
coverslip holders
diamond point wheel	Dremel	7134	use for drilling holes in quartz flow cell topper
dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7.7 mg/vial
drill press rotary tool workstation stand	Dremel	220-01	facilitates quartz drilling
EcoRV (REase used to generate example data)	New England Biolabs	R0195T or R0195M	Use 100,000 units/mL stock to avoid adding excess glycerol Check REBASE for suppliers of other REases
ethanol	various	CAS 64-17-5	denatured or 95% are acceptable, use for cleaning coverslips
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, anhydrous, store in dessicator box
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	3 mm x 10 mm size to fit beneath coverslip rack
fluorescein	Acros Organics	17324	use to make experimental buffers
gravity convection oven	Binder	9010-0131
handheld rotary multitool	Dremel	8220	use for drilling holes in quartz flow cell topper
ImagEM X2 EM-CCD Camera	Hamamatsu	C9100-23B	air cooling is adequate for this experiment, use HCImage software or similar to control
Imaging spacer, double-sided, adhesive
Jar, glass with screw cap, (approximately 50 mm diameter by 50 mm high)
magnesium chloride hexahydrate	Fisher Bioreagents	BP214-500	use to make experimental buffer with magnesium
MATLAB software			Data analysis
metal tweezers	Fisher Brand	16-100-110
methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	Both PEGs should have the same NHS ester so that the rate of reaction is consistent
microcentrifuge	Eppendorf	5424
multiposition magnetic stirrer	VWR	12621-022
N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, use to make CHES buffer
orbital shaker and heater for microcentrifuge tubes	Q Instruments	1808-0506	with 1808-1061 adaptor for 24 x 2.0 mL or 15 x 0.5 mL tubes
Parafilm
PE60 Polyethylene tubing (inner diameter 0.76 mm, outer diameter 1.22 mm)	Intramedic	6258917	22 G blunt needles are a good fit for this tubing size
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Use at 1x strength
potassium hydroxide	VWR Chemicals BDH	BDH9262	use a 1 M solution to clean coverslips
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Quartz Slide, 1 inch square, 1 mm thick	Electron Microscopy Sciences	72250-10	holes must be drilled in the corners for inlet and outlet tubing insertion
reinforced plastic tweezers	Rubis	K35a	use for handling coverslips and building microfluidic device
SecureSeal Adhesive Sheets	Grace Biolabs	SA-S-1L	cut to form spacer for microfluidic device
Single channel syringe pump for microfluidics	New Era Pump Systems	NE-1002X-US	fitted with a 50 mL syringe and a 22 G blunt needle
Slide-a-Lyzer MINI Dialysis Devices, 10 kDa MWCO, 0.1 mL	Thermo Scientific	69570 or 69572	used for buffer exchange during quantum dot coupling to DNA
sodium bicarbonate	EMD Millipore	SX0320	use to make buffer for surface functionalization; 100 mM, pH 8
sodium chloride	Macron	7581-12	use to make experimental buffers
Sodium phosphate dibasic solution (BioUltra, 0.5 M in water)	Sigma Aldrich	94046	use to make 100 mM sodium phosphate buffer
Sodium phosphate monobasic solution (BioUltra, 5M in water)	Sigma Aldrich	74092	use to adjust pH of 100 mM sodium phosphate buffer
Streptavidin from Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	dissolve at 1 mg/mL and store 25 mL aliqouts at -20 ?
Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	No-Weigh Format, 2 mg/vial
Syringe fitted with blunt 21 G needle
Syringe pump
thiolated oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	custom - see protocol for design considerations	Request 5' Thiol Modifier C6 S-S and HPLC purificaiton
TIRF imaging system with 488 nm laser illumination	various		custom built
Tris -HCl	Research Products International	T60050	use to make experimental buffers
Tris base	JT Baker	4101	use to make experimental buffers
Tween-20	Sigma	P7949	use to make blocking buffer
Ultrapure water
vortex mixer	VWR	10153-842
Wash-N-Dry Coverslip Rack	Electron Microscopy Sciences	70366-16	used for surface functionalization of coverslips