הקמת מודל עכברוש של חסימת קשת-סינוס מעולה באמצעות שיטת תסחיף חוט

Summary

כאן, אנו מקימים מודל עכברוש ספראג-דולי (SD) חדשני של פקקת סינוס קשת מעולה (SSS) באמצעות שיטת תסחיף חוט, ואת היציבות והאמינות של המודל אומתו.

Abstract

המנגנונים התורמים להתפרצות הטבעית של פקקת סינוס ורידי מוחי (CVST) אינם ידועים ברובם, ומגוון גורמים בלתי נשלטים מעורבים במהלך המחלה, וכתוצאה מכך מגבלות גדולות במחקר קליני. לכן, הקמת מודלים יציבים של בעלי חיים CVST שיכולים לתקנן מגוון של גורמים מבלבלים בלתי נשלטים סייעו לעקוף חסרונות במחקר קליני. בעשורים האחרונים נבנו מגוון מודלים של בעלי חיים CVST, אך התוצאות המבוססות על מודלים אלה היו לא עקביות ולא שלמות. לפיכך, על מנת להמשיך לחקור את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של CVST, יש צורך להקים מודל בעלי חיים חדשני ותואם מאוד, אשר יש ערך מעשי חשוב ומשמעות מדעית לאבחון וטיפול של CVST. במחקר הנוכחי, מודל עכברוש ספראג-דולי (SD) חדשני של פקקת סינוס קשת מעולה (SSS) הוקם באמצעות שיטת תסחיף חוט, ואת היציבות והאמינות של המודל אומתו. בנוסף, הערכנו שינויים בזרימת הדם הוורידי במוח בחולדות לאחר היווצרות CVST. באופן קולקטיבי, מודל SSS-פקקת SSS-thrombosis מייצג מודל חדש של בעלי חיים CVST כי הוא הוקמה בקלות, ממזער טראומה, מניב יציבות טובה, ומאפשר שליטה מדויקת תזמון איסכמי ומיקום.

Introduction

פקקת סינוס ורידי מוחי (CVST) היא מחלה נדירה של המערכת הורידית המוחית המהווה רק 0.5-1.0% מכל הגורמים לשבץ אבל יש שיעור התרחשות גבוה יחסית אצל ילדים ומבוגרים צעירים¹. במהלך הנתיחה שלאחר המוות, CVST נמצאה הגורם 10% של מקרי מוות ממחלות כלי דם במוח². פקקת יכולה להתרחש בכל חלק של המערכת הוורידית תוך ורידי. סינוס קשת מעולה (SSS) הוא אחד האזורים המושפעים הנפוצים ביותר ב- CVST והוא יכול לערב כלי דם מרובים. בשל היצרות או חסימה של הסינוסים הוורידיים, החזרה הוורידית תוך ורידי חסומה, אשר מלווה לעתים קרובות בלחץ תוך ורידי מוגבר³. הביטויים הקליניים של CVST הם מורכבים ומשתנים עם הזמן; למרות שיש חוסר ספציפיות של הסימפטומים, הסימפטומים הנפוצים ביותר כוללים כאב ראש (77.2%), התקפים (42.7%), וגירעונות נוירולוגיים (39.9%). במקרים חמורים, תרדמת ואפילו מוות עלולים להתרחש^4,5. בשנים האחרונות, בשל השיפור הכולל של תקנים רפואיים ובריאותיים ומודעות לבריאות הציבור, שיעור גורמי הסיכון הקשורים השתנה, שיעור הטראומה והזיהום ירד, ושיעור CVST הנגרמת על ידי הריון, puerperium, גלולות למניעת הריון, וסיבות אחרות גדל בהדרגה⁵.

כיום, הפתוגנזה של CVST עדיין לא מובנת היטב. כדי לחקור את CVST לעומק, דרוש מחקר פתופיזיולוגי נוסף. עם זאת, רוב שיטות המחקר הללו הן פולשניות ולכן קשה ליישם קלינית. בשל מגבלות רבות של מחקר קליני, למודלים של בעלי חיים יש יתרונות שאין להם תחליף במונחים של מחקר בסיסי ותרגומי.

הגורם ל- CVST הוא מורכב, שכן הופעתו הראשונית אינה מזוהה לעתים קרובות ומיקום היווצרות פקקת משתנה מאוד. למרבה המזל, מודלים של בעלי חיים יכולים להשיג שליטה טובה יותר בגורמים אלה. בעשורים האחרונים הוקמו מגוון מודלים של בעלי חיים CVST, ולכל דגם יש חסרונות משלו. על פי שיטות ייצור שונות, הם יכולים להיות מחולקים בערך לקטגוריות הבאות: פשוט SSS-ligation מודל^6,7; SSS פנימי הזרקה מאיץ דגם⁸; פקקת SSS הנגרמת על ידי ברזל-כלוריד^{מודל 9}; פקקת SSS הנגרמת על ידי פוטוכימיה מודל¹⁰; ואת התסחיף העצמי-חסימה SSS מודל¹¹. עם זאת, רוב המודלים הללו אינם מסוגלים לעקוף נזק פולשני לקליפת המוח של החיה ואינם מסוגלים לשלוט במדויק בזמן ובמיקום האיסכמיים. במודלים מסוימים, הטרומבוס יתחדש באופן ספונטני; בדגמים אחרים, ה-SSS מסתגר לצמיתות. בנוסף, ניתוחים מורכבים ו/או פציעות חמורות עלולים להשפיע על הממצאים הפתופיזיולוגיים הבאים במודלים אלה.

במחקר הנוכחי, תקע חוט הוכנס לתוך SSS של Sprague-Dawley (SD) חולדות כדי להקים בהצלחה מודל CVST כי מזער נזק, אפשר יכולת שליטה מדויקת, והניב יציבות טובה. בנוסף, הדמיית תהודה מגנטית של בעלי חיים קטנים (MRI) והדמיה של זרימת דם של כתמי לייזר שולבו כדי לאמת את יעילות המודל. הערכנו שינויים בזרימת הדם המוחי לפני ואחרי הקמת המודל שלנו, כמו גם הערכנו את היציבות של המודל שלנו, הנחת בסיס למחקרים נוספים לחקור את התרחשות, פיתוח, ומנגנונים פתופיזיולוגיים הקשורים של CVST.

Protocol

נהלים העוסקים בנושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הנורמות הרפואיות וועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית וונג'ואו והם בהתאם לחקיקה הסינית על שימוש וטיפול בחיות מעבדה.

1. הכנת תקע החוט, חולדות SD וציוד ניסיוני

1. השתמש חוט ניילון בקוטר של 0.28 מ"מ כגוף העיקרי של תקע החוט.
   הערה: הרכות והקשיות של חוט הניילון צריכות להיות מתונות.
2. מכסים קצה אחד של חוט הניילון בחומר סיליקון. אורך חלק הסיליקון של תקע החוט הוא כ 1.2 ס"מ, ואת הקוטר הוא כ 1.2 מ"מ. קצה הראש מחודד, וחלק הסיליקון גלילי. שמור עוד 5-7 ס"מ. חוט הניילון קל להדק וניתן לחתוך אותו בהתאם לצרכים ספציפיים לאחר הניתוח.
3. השתמש 75% אתנול כדי להשרות את תקע החוט במשך 3 דקות לפני הניתוח ולשטוף כל אתנול שיורית עם מלוחים רגילים לפני חיבור.
4. בחר 12 חולדות SD זכר במשקל בין 280 ל 320 גרם, באופן אקראי לחלק אותם לקבוצה מזויפת וקבוצה ניסיונית (n = 6 לכל קבוצה). לאחר שבוע של הסתגלות סביבתית, מהר החולדות במשך 12 שעות ומחסור במים אותם במשך 4 שעות לפני הניתוח.
5. הכינו את הציוד הניסיוני הבא הדרוש לניסוי: מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנה, מכשיר סטראוטקסי למוח, מיקרוסקופ מנתח, מקדחת גולגולת במהירות גבוהה, מספריים, פינצטה, מלקחיים בכלי הדם, מחזיק מחט, חוט מחט, מזרק 2 מ"ל, מערכת הדמיה של זרימת דם עם כתמי לייזר וסורק MRI של בעלי חיים קטנים.

2. בניית מודל SSS-אמבוליזציה SSS-עכברוש באמצעות אמבוליזציה חוט

1. מניחים את חולדת ה-SD בתיבת הרדמה ומשתמשים במכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים כדי לספק 4% isoflurane כדי לגרום להרדמה. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לאשר כי הגפיים האחוריות של חולדת SD ובהונות אינן מגיבות לצביטה מתונה.
2. תקן במהירות את ה-SD ratwith שיער עליון מגולח בתנוחה נוטה על מכשיר סטראוטקסי במוח. לשמור על הרדמה עם 1.5-2.0% isoflurane (במהירות של 0.5 L / min), ולייצב את קצב הנשימה ב 40-60 נשימות / דקה. לייצב את טמפרטורת הגוף של החולדה באמצעות כרית חימום ב 37±0°C.
   1. החל חומר סיכה סטרילי עיניים עיניים עיניים לאחר החולדה ממוקמת על מסגרת סטראוטקסית כדי להגן על הקרניות מפני ייבוש במהלך הרדמה.
3. לעקר את פני השטח בחלק העליון של ראש החולדה עם 5% יוד povidone לסירוגין שלוש פעמים עם 75% אתנול. בצע חתך בעור (2.0 ס"מ אורך) באמצע הראש, ולאחר מכן בזהירות לקלף את fascia העליון periosteum לחשוף את הגולגולת באופן מלא.
   1. אשרו את מיקומם של הפונטנלים האחוריים, הפונטנל האחורי, תפר הקורונל, תפר הסגיטלי ותפר הרינגבון.
4. השתמש באזור שבין תפר הקורונל לתפר עצם הרינג כאזור התצפית של זרימת הדם. כדי למנוע מהגולגולת להשפיע על התצפית במהלך הדמיית זרימת הדם בלייזר, יש לדלל את הגולגולת באזור התצפית עד שכלי הדם יהיו גלויים בבירור. גודל הגולגולת הדקה צריך להיות כ 1.0 ס"מ × 1.0 ס"מ. שלב זה והבא מבוצעים כולם תחת מיקרוסקופ מנתח.
   1. במהלך שחיקת הגולגולת, השתמש מלוחים בטמפרטורה נורמלית כדי לשטוף את התרגיל שוב ושוב, כדי למנוע כוויות בטמפרטורה גבוהה קליפת המוח.
5. השתמש מקדחה במהירות גבוהה כדי לטחון את הגולגולת בתוך חלון עצם 6.0 מ"מ x 4.0 מ"מ מרוכז bregma לחשוף את SSS של אזור bregma.
   1. השתמש מלוחים רגילים כדי לקרר את הגולגולת במהלך שחיקה. כאשר הגולגולת הופכת דקה, להשתמש בפינצטה כדי להסיר בזהירות את חתיכות העצם הנותרות, כדי למנוע קריעת SSS.
6. בחר תקע חוט מתאים, להשתמש בנקודת ברגמה SSS כנקודת התקע, לנקב אותו בזהירות עם מחט מזרק 2 מ"ל, במהירות להכניס את ראש תקע החוט לנקודת התקע.
   1. בשלב זה, הזווית בין קצה ראש תקע החוט לבין SSS צריך להיות כ 30-45 °; לאחר מכן התאימו את הזווית בין קצה תקע החוט ל-SSS ל-0-10 מעלות, והכניסו לאט את ה-SSS למרכז עד שהראש יגיע לקצה האחורי של מפגש הסינוסים. לאחר מכן, לחתוך את החלק העודף של הזנב.
      הערה: דימום מהיר עלול להתרחש כאשר SSS מנוקב. אם לא ניתן להכניס במהירות את קצה תקע החוט לנקודת התקע בבת אחת, השתמש בכדור גזה או כותנה קטן כדי ללחוץ בעדינות על נקודת התקע תוך החלקה איטית למטה כדי לחשוף את נקודת התקע בזהירות, ולאחר מכן הכנס במהירות את קצה בורג התיל לתוך ה- SSS. לאחר תקע החוט מוכנס, אם יש דימום בנקודת התקע, חומרים עצירת דימום כגון ספוג ג'לטין ניתן להשתמש כדי לעצור את הדימום.

3. גילוי זרימת הדם על פני המוח של חולדות SD

1. השתמש במקור אור לייזר כדי להאיר באופן אחיד את אזור התצפית של זרימת הדם. האור המוחזר נאסף על ידי מצלמה ומועבר למחשב לצורך ניתוח. השתמש בהגדרות הפרמטרים הבאות עבור מערכת הדמיית זרימת הדם של כתמי לייזר: אורך גל: ρ = 785 ננומטר; וזמן חשיפה לתמונה: T = 10 אלפיות השנייה.
2. מרכז את אזור התצפית של זרימת הדם של חולדת SD לשדה הראייה של מערכת ההדמיה של זרימת הדם בלייזר-כתמים ונהל ניטור מתמשך של זרימת הדם על פני השטח של המוח במשך 2 דקות. לאסוף ולעבד את נתוני זרימת הדם לפני ואחרי תסחיף עבור כל חולדת SD, ולקבל את מפת זרימת הדם של כתמי לייזר של האזור שנצפה.
3. לשטוף שוב ושוב את האזור המופעל עם מלוחים רגילים לשטוף פסולת עצם ושאריות. לתפור את העור (0 # חוט) ולחטא עם יודפור.
4. שמור על טמפרטורת הגוף עד שהחולדה מתעוררת לאחר הניתוח ולאחר מכן בית בכלוב אחד עם מזון ומים שסופקו libitum המודעה. אין אפשרות לחבר את קבוצת המזויפים.
5. לאחר השלמת איסוף הנתונים, בצע לאחר העיבוד.
   1. בחירה מלאה של אזור העניין (ROI) באמצעות הכלים המסופקים על ידי תוכנת מערכת ההדמיה של זרימת הדם בלייזר. הערכים המתקבלים הם ערך זרימת הדם הממוצע בהו"ר, וערכי זרימת הדם-המוחיים המקומיים לפני ואחרי התסחיף. השתמש בערך זרימת הדם לפני התסחיף כערך הבסיסי.
   2. בחר ארבעה ROIs ולמדוד את השינוי היחסי בזרימת הדם המוחי בכל החזר על ההשקעה, לידי ביטוי כשינוי באחוזים מהערך הבסיסי.

4. איתור מיקום חוט על בעלי חיים קטנים MRI

1. השתמש בפרמטרים הבאים של דימות T2 משוקלל (T₂WI) עבור מערכת דימות MRI: זמן הד (TE) = 33 אלפיות השנייה, זמן חזרה (TR) = 3000 אלפיות השנייה, מספר עירור (NEX) = 4, פרוסות = 28, עובי פרוסה = 0.8 מ"מ, גודל מטריצה = 256 * 256 מ"מ 2 ,^זוויתהיפוך = 80°, שדה הראייה (FOV) = 30 * 30 מ"מ², זמן סריקה = 6 דקות 24 שניות; פרמטרי אנגיוגרפיה תהודה מגנטית (MRA) הוגדרו כדלקמן: TE = 4.4 אלפיות השנייה, TR = 12 אלפיות השנייה, NEX = 4, פרוסות = 80, עובי פרוסה = 0.4 מ"מ, גודל מטריצה = 256 * 256 מ"מ 2 ,^זוויתהיפוך = 80°, FOV = 30 * 30 מ"מ², זמן סריקה = 16 דקות 23 שניות 40 אלפיות השנייה.
2. תקן את החיה על שולחן הסריקה MRI, כייל את מיקום המוח על ידי מיקום סריקה, ולבצע סריקת רצף T₂WI ו- MRA לאחר אישור המיקום.
3. השתמש בהרדמה רציפה באמצעות מכונת הרדמה לבעלי חיים במהלך הגילוי. לאחר מכן, המתת חסד חולדות SD על ידי הזרקה תוך-אישית של pentobarbital מוגזם.
4. רכישת תמונה ועיבוד לאחר: לאחר איסוף נתוני התמונה, על מנת לבחון את מצב תקע החוט ב- SSS בצורה ברורה יותר, השתמש בשיטת שיפור הצבע המדומה כדי להציג את תמונת T₂WI של מוח החולדה.

תוצאות

כדי להקים את מודל פקקת SSS-thrombosis של חולדת SD באמצעות שיטת התפר, יש להכין את התפר מראש (איור 1A), ויש להכין את הציוד הדרוש לניסוי (איור 1B). בשל האופי העדין של המבצע, הכנת המודל צריכה להסתיים תחת מיקרוסקופ מנתח. המדרגות הראשיות מוצגות באיור 2. כדי להקל...

Discussion

במחקר זה, סוג חדש של מודל CVST הוקמה בהצלחה על ידי החדרת תקע חוט מתוצרת עצמית לתוך SSS של חולדות SD. בנוסף, הדמיית זרימת דם של כתמי לייזר ו- MRI של בעלי חיים קטנים שולבו כדי לפקח על שינויים בזרימת הדם על פני השטח של חולדות SD לפני ואחרי התסחיף על מנת לתקנן את התזמון והמיקום של איסכמי.

ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL syringe	Becton,Dickinson and Company	301940
brain stereotaxic instrument	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	68025
dissecting microscope	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
high-speed skull drill	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	78046
laser-speckle blood-flow imaging system	Wuhan SIM Opto-technology Co.	SIM BFI-HR PRO
needle holder	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F31022-12
needle thread	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F33303-08
scissors	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	S13029-14
silica gel	Heraeus Kulzer	302785
small animal anesthesia machine	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	R540
small-animal MRI	Bruker Medical GmbH	Biospec 94/30 USR
tweezers	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F11029-11
vascular forceps	Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd	F22003-09