בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית חסכונית בזמן להערכת מצב פולמור Actin במכרסמים ורקמות מוח אנושיות

Summary

אנו מדווחים על בדיקה פשוטה, יעילה בזמן וספקטרוסקופיה מבוססת תפוקה גבוהה לכימות סיבי אקטין בדגימות ביולוגיות אקס ויוו מרקמות המוח של מכרסמים ונבדקים אנושיים.

Abstract

Actin, המרכיב העיקרי של cytoskeleton, ממלא תפקיד קריטי בשמירה על המבנה והתפקוד העצבי. תחת מצבים פיזיולוגיים, actin מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורותיה: כדורית מונומרית (G-actin) וסיבים פולימריים (F- actin). במסופים הסינפטיים, actin cytoskeleton מהווה את הבסיס לפונקציות קריטיות לפני ואחרי סינפטית. יתר על כן, שינויים דינמיים במצב פילמור actin (אינטרקוונהפיכה בין צורות כדוריות חוטית של actin) קשורים קשר הדוק לשינויים הקשורים פלסטיות במבנה ובתפקוד סינפטי. אנו מדווחים כאן על מתודולוגיה מבוססת פלואורסצנטיות שונה כדי להעריך את מצב הפולמליזציה של actin בתנאי ex vivo. ה-assay משתמש בפאלואידין בעל תווית פלואורסצנטית, פלוטוקסין שנקשר במיוחד לסיבי אקטין (F-actin), ומספק מידה ישירה של אקטין סיבי פולימרי. כהוכחה לעיקרון, אנו מספקים ראיות להתאמת ההסתעפות של ההסתעפות הן ברקמת המוח האנושית מכרסמים והן בהומוגנטים שלאחר המוות. באמצעות latrunculin A (תרופה depolymerizes סיבי actin), אנו מאשרים את התועלת של ההסתערות בניטור שינויים ברמות F-actin. כמו כן, אנו מרחיבים את ההסמכה לשברים ביוכימיים של מסופי סינפטית מבודדים שבהם אנו מאשרים פולמריזציה actin מוגברת על ידי גירוי על ידי דפולריזציה עם K חוץ תאי גבוה⁺.

Introduction

אקטין חלבון Cytoskeletal מעורב בפונקציות תאיות מרובות, כולל תמיכה מבנית, תחבורה סלולרית, תנועתיות תאים וחלוקה. אקטין מתרחשת בשיווי משקל בשתי צורות: אקטין כדורי מונומרי (G-actin) ואקטין סיבי פולימרי (F-actin). שינויים מהירים במצב הפילמור של actin (בין צורות G ו- F) לגרום הרכבה חוט מהיר ופירוק ביסוד תפקידיה הרגולטוריים בפיזיולוגיה התאית. Actin מהווה את המרכיב העיקרי של המבנה cytoskeletal העצבי ומשפיע על מגוון רחב של פונקציות עצביות^1,2. יש לציין כי האקטין ציטוסקלטון מהווה חלק בלתי נפרד מהפלטפורמה המבנית של המסופים הסינפטיים. ככזה, הוא דטרמיננטה מרכזית של מורפוגנזה סינפטית ופיזיולוגיה וממלא תפקיד בסיסי בשליטה על הגודל, המספר והמורפולוגיה של הסינפסות^3,4,5. בפרט, דינאמי actin polymerization-depolymerization הוא דטרמיננטה מפתח של שיפוץ סינפטי הקשורים פלסטיות סינפטית שבבסיס תהליכי הזיכרון והלמידה. ואכן, הן presynaptic (כגון שחרור נוירוטרנסמיטר^6,7,8,9,10) ו פונקציות postsynaptic (פלסטיות הקשורות שיפוץ דינמי^11,12,13,14) להסתמך באופן ביקורתי על שינויים דינמיים במצב פולמור של cytoskeleton actin.

בתנאים פיזיולוגיים, רמות F-actin מוסדר באופן דינמי והדוק באמצעות מסלול רב-מודאלי מעורבים שינוי posttranslational^4,15,16, כמו גם חלבונים מחייבים actin (ABPs)^4,17. ABPs יכול להשפיע על דינמיקה actin ברמות מרובות (כגון ייזום או עיכוב פילמור, גרימת הסתעפות חוטים, ניתוק חוטים לחתיכות קטנות יותר, קידום depolymerization, והגנה מפני דפולימריזציה), והם בתורו תחת שליטה מודולטורית מחמירה רגיש לאותות חוץ תאיים שונים^18,19,20. בדיקות רגולטוריות כאלה ברמות מרובות מכתיבות רגולציה קפדנית של דינמיקה actin ב cytoskeleton סינפטית, כוונון עדין מראש ופוסט-סינפטי היבטים של פיזיולוגיה עצבית הן במצב הבסיסי והן במצבים הנגרמים על ידי פעילות.

בהתחשב בתפקידים החשובים של actin בפיזיולוגיה העצבית, אין זה מפתיע כי מספר מחקרים סיפקו ראיות לשינויים בדינמיקה actin כמו אירועים פתוגניים קריטיים הקשורים למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות כולל ניוון עצבי, מחלות פסיכולוגיות, כמו גם מחלות נוירו-התפתחותיות^{3,21,22,23,24,25,26,27}. למרות שפע של נתוני מחקר המצביעים על תפקידי מפתח של actin בפיזיולוגיה עצבית ופתופיזיולוגיה, עם זאת, פערים משמעותיים עדיין נשארים בהבנת הדינמיקה actin, במיוחד על cytoskeleton סינפטית. דרושים מחקרים נוספים כדי להבין טוב יותר את האקטין העצבי ואת השינויים שלו בתנאים פתולוגיים. תחום מרכזי אחד של מיקוד בהקשר זה הוא הערכת מצב פולמור actin. יש ערכות מסחריות מערביות מבוססות סופג (G-Actin / F-Actin בערכה ביוכימית vivo assay; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) ו מבחנים תוצרת בית להערכת רמות F-actin⁶. עם זאת, מכיוון שאלה דורשים בידוד ביוכימי של F-actin ו- G-actin ומכיוון שהכימות הבא שלהם מבוסס על פרוטוקולים immunoblotting, הם יכולים להיות זמן רב. אנו מדווחים בזאת על בדיקה מבוססת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שהותאמה ממחקר קודם³⁰ עם שינויים שניתן להשתמש בהם כדי להעריך הן את רמות הבסיס של F-actin, כמו גם שינויים דינמיים בפירוק ההרכבה שלה. יש לציין כי שינינו ביעילות את הפרוטוקול המקורי הדורש דגימות המתאימות ל- 1 מ"ל cuvette לפורמט הלוח הנוכחי של 96 באר. הפרוטוקול שהשתנה ולכן הפחית באופן משמעותי את כמות הרקמה / מדגם הנדרש עבור ההסתעפות. כמו כן, אנו מספקים ראיות כי הפרוטוקול מתאים לא רק רקמת המוח הומוגנטים, אלא גם שברים תת תאיים כגון מסופים סינפטיים מבודדים (סינפטוזומים סינפטונוזומים). לבסוף, ניתן להשתמש במד"א עבור רקמות מוח של מכרסמים שזה עתה נותחו ודגימות מוח אנושיות מאוחסנות לטווח ארוך לאחר המוות. יש לציין, בעוד ההסתעפות מוצגת בהקשר עצבי, זה יכול להיות מורחב כראוי לסוגי תאים אחרים ותהליכים פיזיולוגיים הקשורים אליהם.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם לתקנות ועדת האתיקה של אוניברסיטת אוטגו בטיפול ובשימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול אתיקה מס'. AUP95/18 ו- AUP80/17) ובית המחוקקים של ניו זילנד. רקמות המוח האנושי התקבלו מהבנק לרקמות נוירולוגיות של בית החולים Clínic-IDIBAPS BioBank בברצלונה, ספרד. כל פרוטוקולי איסוף הרקמות אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים קלניק, ברצלונה, והסכמה מדעת התקבלה מהמשפחות.

1. הכנת מאגרים ריאגנטים

1. הכן את המאגרים הבאים להומוגניזציה של רקמת המוח והכנת שבר מועשר של מסופים סינפטיים:
   מאגר הומוגניזציה: 5 מ"מ HEPES, pH 7.4 בתוספת 0.32 M סוכרוז
   מאגר ההשעיה: 5 מטר טריס, pH 7.4 בתוספת סוכרוז 0.32 M
   חיץ כביסה: 5 מ"מ טריס, pH 8.1
   1.2 מ' סוכרוז
   1.0 מ' סוכרוז
   0.85 מ' סוכרוז
2. הוסיפו תערובת ביתית או מסחרית של מעכבי פרוטאז ופוספטאז.
   הערה: השתמשנו בגרסה נטולת EDTA של תערובת מעכבי פרוטאז מלאה (טבליה אחת לכל חיץ 10 מ"ל) וקוקטייל מעכבי פוספטאז הרביעי (1:100; נפח: נפח).
3. הכן את המאגרים והריאגנטים הבאים עבור הקיבעון, ההחלחלה והאיגוד של הפאלוקדין:
   מאגר קרבס: 118.5 מ"מ NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0.1 מ"מ KH₂PO₄, 5 מ"מ NaHCO₃, 10 מ"מ גלוקוז, 20 מ"מ HEPES, pH 7.4
   1 M KCl
   25% גלוטרדהיד (פתרון מניות)
   מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaBH₄
   400x אלקסה פלואור 647 פאלודין ב DMSO
   מאגר קרבס המכיל סוכרוז 0.32 M
   50 מיקרומטר לטרונגולין A ב- DMSO (פתרון מלאי)
   1 M KCl (פתרון מניות)
   התראה: Phalloidin הוא רעיל (LD₅₀ = 2 מ"ג / קילוגרם) ויש לטפל בו בזהירות. שאיפה של גלוטרלדהיד היא רעילה ויש לטפל בה במכסה המנוע של אדים.
4. אחסן את המאגרים ב 4 °C (60 °F) ו phalloidin ו latrunculin A ב -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך.
   הערה: אחסון מאגרים לטווח ארוך אינו מומלץ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הומוגניזציה של רקמת המוח

1. הומוגניזציה של רקמת מוח החולדה ההקפאה או שזה עתה נותחה בעשרה כרכים של חיץ הומוגניזציה בצינור זכוכית פוטר-Elvehjem ועלי על הקרח.
   הערה: הומוגניזציה אופטימלית מושגת על ידי 15-20 משיכות של העלי ביד עבור רקמות המוח. הומוגניזציה מוצלחת יכולה להיות מאושרת על ידי זרימה חלקה של ההשעיה דרך צינור הזכוכית. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. לקבוע את ריכוז החלבון הומוגנט באמצעות מבחני ברדפורד³¹.
   הערה: ניתן להשתמש גם במטענים חלופיים תוצרת בית או מסחרית להערכת חלבונים.
3. לדלל דגימות הומוגניות מאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL.
   הערה: בחלק מהניסויים שלנו, אנו דגירה הומוגנטים עם 2 μM latrunculin A או DMSO (פקדים) ב 37 °C (69 °F) עבור 1 שעות. בשביל זה, homogenates הם resuspended ב 48 μL של מאגר קרבס, ו 2 μL של 50 μM latrunculin A או 2 μL של DMSO מתווסף. עוד יותר עבור immunoblotting, כמות קטנה של מדגם (10 מיקרוגרם) נאסף לאחר הדגירה.
4. תקן את הדגימות ההומוגניות (סעיף 5).

3. הכנת מסופי עצבים מבודדים

1. הכנת סינפטוזומים
   הערה: ניתן להשתמש גם בפרוטוקולים חלופיים^32,33 עבור סינפטוזומים.
   1. המוח צנטריפוגה הומוגנית ב 1,200 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   2. השלך את גלולה, שהוא השבר הגרעיני הגולמי.
   3. צנטריפוגה נוספת supernatant (S1) הושג בשלב 3.1.1 ב 12,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 °C (69 °F).
   4. הסר את supernatant (S2), שהוא שבר ציטוזולי מסיס.
   5. Resuspend גלולה (P2) שהושג בשלב 3.1.3, המהווה את השבר הסינפטוזולמי הגולמי במאגר resuspension.
      הערה: נפח מאגר ההשעיה תלוי בכמות הרקמה ההתחלתית ובכמות גלולה המתקבלת. לדוגמה, כאשר מתחילים עם 150-300 מ ג של רקמות המוח, גלולה המתקבל ניתן להשהות ב 200 μL של מאגר ההשעיה.
   6. טען את הסינפטוזומים הגולמיים שהושקעו מחדש על שיפוע סוכרוז לא רציף העשוי מנפחים שווים של 0.85-1.0-1.2 M סוכרוז.
      הערה: בדרך כלל אנו משתמשים 1 מ"ל כל פתרון סוכרוז (עבור 150-300 רקמת מ"ג). זה יכול להיות שונה על פי כמויות רקמה גדולות יותר. מעברי צבע רציפים יכולים להתבצע באמצעות מזרק 25G לחוץ על הקיר הפנימי של צינור ultracentrifuge ושכבות עדינות של שכבות סוכרוז.
   7. צנטריפוגה ב 85,000 x גרם עבור 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: בגלל המהירות הגבוהה של צנטריפוגה, ultracentrifuge מסוגל ליצור ואקום כדי להפחית את החימום נדרש.
   8. לאסוף את השבר הסינפטוזומלי בממשק בין 1.0 ו 1.2 M סוכרוז באמצעות קצה צינור μL 200.
   9. לשטוף את השבר הסינפטומלי עם חיץ כביסה קר כקרח על ידי צנטריפוגה ב 18,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: לשטיפה, שבר סינפטוזומלי המתקבל בממשק של 1.0 ו 1.2 M סוכרוז נאסף בצינור טרי 1.5 מ"ל, ונפח שווה של חיץ כביסה מתווסף, הבטחת הסרת סוכרוז גבוה מהבינוני.
   10. לשטוף את גלולה סינפטוזומלית שוב עם חיץ הומוגניזציה קר כקרח ב 12,000 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   11. התחדשו בסינפטוזומים במאגר הומוגניזציה על קרח.
       הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.
   12. לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.
   13. Resuspend הסינפטוזומים במאגר קרבס בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4).
       הערה: עבור ההשעיה מחדש, השבר הסינפטוזולי מסתובב לראשונה ב- 12,000 x g למשך 5 דקות ב- 4 °C (60 °F) וה- supernatant (חיץ) מוסר. גלולה סינפטוזומלית הוא לאחר מכן resuspended במאגר קרבס על ידי צינור עדין באמצעות קצה צינור 200 μL.
   14. המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).
2. הכנת סינפטונורוסומים
   הערה: פרוטוקולים חלופיים^34,35 עבור synaptoneurosomes ניתן להשתמש גם.
   1. מעבירים את המוח הומוגנית דרך מסנן רשת רטוב מראש של גודל נקבובית 100 מיקרומטר במחזיק מסנן באמצעות מזרק 1 מ"ל.
      הערה: הרטבה מראש של כל המסננים חשובה כדי למנוע אובדן מדגם ויש לעשות זאת באמצעות מאגר הומוגניזציה. לצורך כך, מאגר הומוגניזציה מועבר דרך המסננים במחזיק המסנן באמצעות מזרק של 1 מ"ל עד שהמאגר זורם החוצה.
   2. לאסוף את הסינון (F1) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.
   3. חזור על התהליך (שלבים 3.2.1 ו- 3.2.2) עבור שבר F1 כדי להשיג את הסינון השני (F2).
   4. להעביר F2 filtrate דרך מסנן נטו של גודל נקבובית 5 מיקרומטר.
   5. לאסוף את הסינון (F3) בצינור מראש מצונן 1.5 מ"ל על קרח.
   6. צנטריפוגה סינון F3 ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
   7. Resuspend גלולה (synaptoneurosomes) במאגר קרבס על קרח בריכוז של 2-3 חלבון מ"ג / מ"ל בנפח של 50 μL (47.5 μL אם סינפטוזומים הם להיות depolarized על ידי KCl; ראה סעיף 4).
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.
   8. להעריך את ריכוז החלבון באמצעות מבחני ברדפורד.
   9. המשך עם דה-פולריזציה (סעיף 4).

4. דה-פולריזציה בתיווך KCl של מסופים סינפטיים מבודדים

1. סינפטוזומים/סינפטונוסומים שווים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
2. לעורר סינפטוזומים / synaptoneurosomes על ידי הוספת KCl כדי להגדיל K חוץ תאי⁺ ל 50 מ"מ עבור 30 s ב 37 °C (69 °F) ולהוסיף נפח שווה של מאגר קרבס ערכת הבקרה unstimulated בהתאמה.
   הערה: לדוגמה, להוסיף 2.5 μL של 1 M KCl כדי סינפטוזומים resuspended ב 47.5 μL של מאגר קרבס; ולהוסיף 2.5 μL של מאגר קרבס לסינפטוזום בקרת unstimulated בהתאמה. לניסויים שבהם מספר רב של דגימות מעורבות, להמשיך עם לא יותר מ 2 דגימות בכל פעם, כך זמן depolarization לא יעלה על 30 s.
3. לסיים את הגירוי על ידי הוספת גלוטרלדהיד (סעיף 5).

5. קיבוע וכתמי פאלודין של דגימות

1. הוסף גלוטרלדהיד לדגימות הומוגניות/סינפטוסומליות/סינפטונוסומליות לריכוז סופי של 2.5% למשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: הוספנו 6 μL של 25% פתרון glutaraldehyde כך הריכוז הסופי של glutaraldehyde ב 50 דגימות μL (הומוגנטים / סינפטוזומים / synaptoneurosomes) היה ca. 2.5%. קיבוע הוא קריטי צריך להיות מהיר ולכן מיד לאחר הוספת glutaraldehyde, המדגם צריך להיות מערבולת נמרצת.
2. משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
3. הסר את העל-טבעי.
   הערה: להשליך את supernatant במכסה המנוע אדים כמו glutaraldehyde רעיל.
4. לחלחל גלולה על ידי ההשעיה ב 100 μL של מאגר קרבס המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 1 מ"ג / מ"ל NaHB₄ עבור 2-3 דקות בטמפרטורת החדר.
5. משקעים את הדגימות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
6. הסר את מאגר החימול.
7. לשטוף את גלולה עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
8. Resuspend ולהכתים את גלולה עם 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (המתאים 500 μU) ב 100 μL של מאגר קרבס במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
   הערה: זנים אחרים של אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי זמינים מסחרית וניתן להחליף אותם במהלך ההסתעפות. ריכוז של פאלודין ואת נפח המדגם הכולל של הדגירה ייתכן שיהיה שונה בהתאם לכמות וסוג של רקמה / מדגם נבדק תנאים אופטימליים צריך להיות סטנדרטי בהתאם.
9. צנטריפוגה דגימות מוכתמות ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
10. הסר את הפאלוקדין הבלתי מאוגד (על-טבעי).
11. לשטוף את המדגם עם 200 μL של מאגר קרבס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 5 דקות.
12. Resuspend ב 200 μL של מאגר קרבס המכיל 0.32 M סוכרוז.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול לזמן קצר כאן.

6. ניתוח פלואורומטרי ופיזור אור

1. לוותר על אלקסה פלואור 647 דגימות מוכתמות פאלודין בצלחת שחורה 96-באר.
2. למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באורך גל עירור של 645 ננומטר ואורך גל פליטה של 670 ננומטר בקורא צלחת בטמפרטורת החדר.
3. מעבירים את הדגימות מהצלחת השחורה של 96 באר לצלחת ה-96 באר השקופה באמצעות 200 טיפים לצינור μL.
4. למדוד את פיזור האור ב 540 ננומטר כדי לתקן עבור כל ההפסדים שעלולים להתרחש במהלך השלבים הקודמים של קיבעון, חדירה וכתמים.
   הערה: וריאציות בחומר ביולוגי שנשמר בדגימות המוכתמות עשויות להיות בולטות יותר עבור כמויות קטנות יותר של חומר התחלתי (ראה דיון).
5. כלול קבוצה של אלקסה פלואור 647 פאלודין במאגר קרבס בריכוזים שונים (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x ו 1x המתאימים 25, 50, 125, 175, 250, 375 ו 500 μU) עבור כל אצווה של ההסתערות כעקומה סטנדרטית.
   הערה: זהו שלב אופציונלי ואינו משפיע על תוצאות הבדיקה במיוחד כאשר רמות F-actin באות לידי ביטוי באופן יחסי (סעיף 7). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

7. ניתוח נתונים

1. כמות F-actin בדגימות היא פרופורציונלית ישירות לעוצמת הפלואורסצנטיות של פאלודין מאוגד. אקספרס במונחים מוחלטים של יחידות של פאלודין מאוגד מחושב מן העקומה הליניארית של תקן פאלודין מתויג.
   הערה: כדוגמה, ראו איורים 2A-B, 3A, 4A-B ואיור משלים 2.
2. רמות F-actin אקספרס כשבר של דגימות הבקרה.
   הערה: כדוגמה, ראה איורים 5A-B.

תוצאות

ליניאריות של ההסתעפות להערכת רמות F-actin
ראשית, נקבעה עקומה סטנדרטית לעלייה הליניארית בפלואורסצנטיות של אלקסה פלואור 647 פאלודין וחזרה על עצמה בכל קבוצת ניסויים(איור 1). כדי לחקור את הטווח הליניארי של ההסתעפות, עובדו כמויות שונות של הומוגנטים במוח ממכרסמים (איו...

Discussion

ההסתייגות המתוארת כאן, המותאמת למעשה ממחקר קודם³⁰ עם שינויים, מעסיקה פלוטוקסין, פאלודין מתויג עם תווית פלואורסצנטית. אנלוגים פאלודין פלואורסצנטי נחשבים תקן הזהב עבור כתמי סיבי actin ברקמות קבועות^47,48,49. למעשה, הם הכלים העתיקים ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube	Beckman Coulter	349622	For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH	Abcam	Ab181602	For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	4693159001	For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene	Corning	3596	For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner)	Li-Cor Biosciences		For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II	Sigma-Aldrich	G6257	Fixative
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A	Sigma-Aldrich	L5163	Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O)	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm	Millipore	LSWP01300	Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate	Thermo Fisher Scientific	237105	For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm	Millipore	NY1H02500	Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV	Abcam	ab201115	For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs buffer component
SpectraMax i3x	Molecular Devices		For fluorometric measurements
Sucrose	Fisher Chemical	S/8600/60	Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder	Millipore	Sx0001300	Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem	Duran Wheaton Kimble	358034	For tissue homogenization
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Component of Permeabilization buffer
Trizma base	Sigma-Aldrich	T6066	Buffer ingredient for sample preparation