דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

Summary

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

Abstract

חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2.} תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג'ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.

Introduction

במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון¹. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים^2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5⁺ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינם^{טעם 5}. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טעם פוסט-מיוטי (תאי IV מסוג) המוזנים לבלוטות טעם ומסוגלים להבדיל לכל אחד משלושת סוגי TRC⁶. המחזור המהיר של TRCs הופך את מערכת הטעם רגישה לשיבושים על ידי טיפולים רפואיים, כולל קרינה וטיפולים תרופתיים מסוימים^{7,8,9,10,11,12,13}. לכן, לימוד מערכת הטעם בהקשר של ויסות תאי גזע טעם ובידול TRC חיוני להבנת כיצד להקל או למנוע תפקוד לקוי של הטעם.

עכברים הם מודל מסורתי למחקרי in vivo במדעי הטעם שכן יש להם מערכת טעם מאורגנת בדומה לבני אדם^14,15,16. עם זאת, עכברים אינם אידיאליים עבור מחקרים תפוקה גבוהה, כפי שהם יקרים לתחזוקה זמן רב לעבוד עם. כדי להתגבר על זה, שיטות תרבות האורגנויד במבחנה פותחו בשנים האחרונות. אורגנוידים טעם יכול להיווצר מרקמת CVP מקורית, תהליך שבו organoids ניצן מן האפיתל CVP עכבר מבודד תרבית ex vivo¹⁷. אורגנוידים אלה מציגים אפיתל רב שכבתי העולה בקנה אחד עם מערכת הטעם של in vivo. דרך יעילה יותר ליצור organoids שאינו דורש תרבות CVP ex vivo פותחה על ידי רן ואח'בשנת 2014¹⁸. התאמת שיטות ומדיה תרבית שפותחה לראשונה כדי לגדל organoids מעיים, הם בודדו Lgr5-GFP⁺ תאי אבות יחידים מ CVP העכבר וציפו אותם בג'ל מטריצה¹⁹. תאים בודדים אלה יצרו אורגנוידים לשוניים המתרבים במהלך 6 הימים הראשונים של התרבות, מתחילים להבדיל סביב יום 8, ועד סוף תקופת התרבות מכילים תאים אפיתל שאינם טעם וכל שלושת סוגי TRC^18,20. עד כה פורסמו מחקרים רבים המשתמשים במערכת מודל האורגנויד הלינגואלי^{17,18,20,21,22}; עם זאת, שיטות ותנאי תרבות המשמשים ליצירת organoids אלה משתנים בין פרסומים (טבלה משלימה 1). לכן, שיטות אלה הותאמו ומותאמו כאן כדי להציג פרוטוקול סטנדרטי מפורט לתרבות האורגנוידים הלשויים הנגזרים מ- LGR5⁺ אבות של CVP עכבר מבוגר.

אורגנוידים לשוניים מספקים מודל ייחודי לחקר התהליכים הביולוגיים של התא המניעים את התפתחות והתחדשות תאי הטעם. ככל שהיישומים של אורגנוידים לשוניים מתרחבים ומעבדות נוספות נעות לכיוון ניצול מודלים אורגנוידים במבחנה, חשוב שהתחום ישאף לפתח ולאמץ פרוטוקולים סטנדרטיים לשיפור יכולת הרבייה. הקמת organoids לשוני ככלי סטנדרטי במדעי הטעם תאפשר מחקרי תפוקה גבוהה להקניט לגזרים כיצד תאי גזע בודדים ליצור את התאים המובחנים של מערכת הטעם הבוגרת. בנוסף, אורגנוידים לשוניים יכולים להיות מועסקים כדי לסנן במהירות תרופות עבור השפעות פוטנציאליות על הומאוסטזיס טעם, אשר לאחר מכן ניתן לחקור ביסודיות רבה יותר במודלים בעלי חיים. גישה זו בסופו של דבר תגביר את המאמצים לתכנן טיפולים שישפרו את איכות החיים של מקבלי תרופות עתידיים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו במתקן מוסמך AAALAC בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים ומדיניות שירות בריאות הציבור, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו Anschutz. עכברי Lgr5^{EGFP-IRES-CreERT2} המשמשים בפרוטוקול זה הם ממעבדת ג'קסון, מלאי מס ' 008875.

הערה: השלבים הבאים יש להשלים לפני תחילתו כדי להבטיח התקדמות חלקה בזמן של הפרוטוקול: להגדיר אמבט מים ל 37 °C ,, להגדיר צנטריפוגה ל 4 °C (5 °C), להפוך פתרונות אנזימי הזרקה ודיסוציאציה מן 10 מ"ג / מ"ל Dispase, Collagenase, ופתרונות מלאי אלסטאז (ראה טבלה של חומרים), להסיר ג'ל מטריצה מ -20 °C מקפיא (~ 750 μL הדרוש צלחת 48-באר) ולהפשיר על ידי טביעת הלווייני בקרח עבור ב לפחות 3-4 שעות, צינורות microcentrifuge טרום מעיל ב FBS לא מדולל על ידי נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות לפחות (שני צינורות 2 מ"ל לאיסוף רקמות, שני צינורות 1.5 מ"ל לתאים מנותקים, וצינור אחד 1.5 מ"ל לאיסוף תאים בודדים מממיין התאים; הסר FBS עודף לפני השימוש).

1. בידוד אפיתל CVP

הערה: כדי להשיג מספיק LGR5⁺ תאים עבור צלחת מלאה 48-well, לאסוף שלושה CVPs Lgr5-EGFP באותו צינור ולעבד בו זמנית. חשוב לציין, לקצור ולעבד את CVP של לפחות סוג בר אחד המלטה במקביל בצינור נפרד ולהשתמש בו כפקד gating כדי להגדיר פרמטרי FACS (ראה תוצאות מייצגות).

1. המתת חסד העכברים עם חנק CO₂ על פי תקנות IACUC, ואחריו שיטה משנית מאושרת כגון בית החזה הדו צדדי, נקע צוואר הרחם, עריפת ראש, או דממה.
2. השתמש במספריים גדולים סטריליים כדי לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. הרם את הלשון וחתוך את frenulum לשוני כדי להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה. חותכים את הלשון ואוספים אותה בתחבולה סטרילית של דולבק עם חוצץ פוספט (dPBS) עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺.
3. הסר והשלך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק את קהוריו של ההצטיידות הבין-עמיתית עם סכין גילוח (איור 1A, קו מקווקו). השתמש בנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מהלשון האחורית.
4. מלא מזרק 1 מ"ל עם 200-300 μL של פתרון אנזימי הזרקה (ריכוז סופי: 2 מ"ג / מ"ל סוג-I Collagenase ו 5 מ"ג / מ"ל Dispase II ב Ca^{2 +}/ Mg^{2 +}- המכיל dPBS, מדולל מ 10 פתרונות מלאי מ"ג / מ"ל) ולהכניס מחט 30 G x 1/2 רק מעל המעמד הבין-עמי (איור 1B,חץ שחור) עד רק לפני ה- CVP (איור 1B, קופסה שחורה). הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות (למינה פרופריה, שריר). למשוך את המזרק לאט ברציפות מן הלשון כמו הזריקה מבוצעת.
5. לדגור על הלשון ב- Ca סטרילי^{2 +}/ מ"ג^{2 +}- dPBS חינם בטמפרטורת החדר במשך 33 דקות בדיוק.
6. לעשות חתכים קטנים באפיתל דו-צדדי ופשוט קהורי ל- CVP באמצעות מספריים חתך דקים במיוחד, ולקלף בעדינות את האפיתל על ידי הרמתו עם מלקחיים עדינים. לאחר אפיתל התעלה הוא ללא רקמת החיבור הבסיסית, למקם אותו בצינור microcentrifuge 2 מ"ל ריק מצופה מראש עם FBS. האם חיתוך אפיתל לפני או אחרי ניתוק האפיתל CVP(איור 1C,D).

2. דיסוציאציה של אפיתל CVP

הערה: דיסוציאציה של האפיתל והצילה של CVP מיוצגים באופן גרפי באיור 2.

1. הוסיפו את קוקטייל אנזימי הדיסוציאציה (ריכוז סופי: 2 מ"ג/מ"ל סוג-I Collagenase, 2 מ"ג /mL אלסטאז, ו-5 מ"ג/מ"ל Dispase II ב-Ca²⁺/Mg²⁺- המכיל dPBS, מדולל מ-10 פתרונות מלאי מ"ג/מ"ל) לצינורות המכילים אפיתליה קלופה CVP (200 μL לכל CVP). דגירה באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 45 דקות. מערבולת בקצרה כל 15 דקות.
   הערה: טרום מלחמה 0.25% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 °C במהלך 15 הדקות האחרונות של דגירה קוקטייל אנזימים.
2. לאחר הדגירה, מערבולת (שלושה פולסים) ואז triturate עם פיפטה פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה הסופר-נט המכילה את האוסף הראשון של תאים מנותקים, לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים מצופים FBS בגודל 1.5 מ"ל המתאימים לגנוטיפ. לעבד את חתיכות הרקמה הנותרות עוד יותר כמתואר בשלב 2.3. מתחת.
   1. ספין את supernatant במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.
   2. הסר את supernatant וכתוצאה מכך resuspend גלולה התא ב- Ca^{2 +}/ Mg^{2 +}- חינם PBS (50 μL לכל CVP)). תחסן על קרח.
3. בעת ביצוע שלבים 2.2.1 ו 2.2.2, לנתק את חתיכות הרקמה הנותרות לשלב 2.2 על ידי הוספת טריפסין-EDTA התחממות מראש (200 μL לכל CVP) לצינורות microcentrifuge המקוריים 2 מ"ל ודגרה באמבט מים 37 °C במשך 30 דקות. מערבולת בקצרה כל 10 דקות.
4. לאחר הדגירה, מערבולת הצינור המכיל חתיכות רקמה (שלושה פולסים) ולאחר מכן triturate עם פיפטת פסטר זכוכית במשך 1 דקות. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה את הסופר-נט לתוך צינורות המיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים תאים החל מהשלב 2.2.2. השלך את הצינורות המכילים את חתיכות הרקמה הנותרות.
   1. לסובב את הצינורות עם תאים מנותקים במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה.
   2. הסר את כדורי תא supernatant ו resuspend במאגר FACS (100 μL לכל CVP). תחסן על קרח.
5. להעביר את התאים דרך מסנן רשת ניילון 30 מיקרומטר ולהוסיף DAPI_(פליטת λ = 450 ננומטר) לתערובות תאים לפני FACS. לבודד Lgr5-GFP⁺ תאים באמצעות FACS באמצעות ערוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק_(עירור λ = 488 ננומטר;_פליטת λ = 530 ננומטר). מיין את התאים באמצעות זרבובית 100 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל טרי מצופה FBS המכיל 300 μL של Ca^{2 +}/ Mg^{2 +} חינם dPBS. מניחים את התאים על קרח עד ציפוי.

3. ציפוי של תאי Lgr5-EGFP

1. קבע את עוצמת הקול של השעיית LGR5⁺ תא שהתקבלה מציטומטר הזרימה.
2. בהתבסס על מספר התאים שהתקבלו מהממיין, חשב את מספר התאים ל- μL. לאחר מכן, לקבוע את הנפח הדרוש כדי להשיג את המספר הרצוי של תאים לציפוי (אנו משתמשים 200 תאים לכל באר של צלחת 48 טוב) ולהעביר את הנפח הכולל של תאים מושעים לתוך צינור microcentrifuge חדש.
3. ספין את הצינור במשך 5 דקות ב 370 x g ו 4 °C לתאי גלולה (גלולה לא יכול להיות גלוי). הסר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח.
4. בעדינות resuspend את גלולה התא בכמות המתאימה של ג'ל מטריצה (15 μL לבאר עבור 48-טוב צלחות); pipette למעלה ולמטה בעדינות כדי להפיץ ביסודיות תאים בג'ל מטריצה. מניחים 15 μL של תערובת ג'ל מטריצה / תא במרכז כל באר. שמור את צינור microcentrifuge על קרח בצינור חרוטי 50 מ"ל במהלך ציפוי כדי למנוע ג'ל מטריצה מג'ל. ממשיכים לערבב תערובת ג'ל/תאים מטריקס לאורך כל ה ציפוי על ידי צנרת למעלה ולמטה כל שלוש בארות כדי להבטיח התפלגות שווה של תאים על פני בארות.
5. מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C), 5% CO₂, ~ 95% לחות) במשך 10 דקות כדי לאפשר ג'ל מטריצה. לאחר מכן, להוסיף 300 μL של טמפרטורת החדר WENRAS + Y27632 מדיה לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור.

4. תחזוקת אורגנויד

הערה: Organoids גדלים במדיה organoid קונבנציונאלי (WENR) הכוללת EGF רקומביננטי ו 50% מדיה מותנית המכיל Wnt3a, Noggin, ו R-ספונדין²³. תרופות A8301 ו- SB202190 מתווספות במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות כדי לייעל את הצמיחה (מדיה WENRAS) (איור 5),ולאחר מכן הוסרו כדי לקדם בידול (מדיה WENR)²⁰. Y27632 מתווסף ליומיים הראשונים של התרבות כדי לקדם הישרדות. תנאי המדיה ביחס לציר הזמן של התרבות מוצגים באיור 4.

1. יומיים לאחר ה ציפוי, להסיר WENRAS + Y27632 מדיה מכל באר באמצעות pipette 1 מ"ל, להבטיח ללא זיהום צולב. הוסף 300 μL של מדיה WENRAS בצד של הבאר כדי לא לשבש את ג'ל מטריצה. תחזיר את הצלחת לאינקובטור.
2. שנה את המדיה כל יומיים, תוך שימוש באמצעי התקשורת המתאימים לשלב התרבות(איור 4). לשמור על organoids עד היום 12, כאשר organoids מוכנים לקצור.

5. עיבוד RNA

1. קצירת אורגנוידים לרנ"א
   1. מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי depolymerize ג'ל מטריצה.
   2. באמצעות פיפטה 1 מ"ל, למשוך את המדיה organoid; לאחר מכן, כמו התקשורת מוחזרת לבאר, להשתמש בקצה של pipette כדי לגרד עוד יותר לשבור את ג'ל מטריצה. העבר את התוכן לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, איגום תוכן של שלוש בארות בצינור אחד. צנטריפוגות הצינורות במשך 5 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר.
   3. הסר מדיה רבה ככל האפשר ללא הסרת organoids; לאחר מכן, לסובב את הצינורות שוב במשך 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
   4. הסר את המדיה הנותרת ו resuspend organoids ב 350 μL מאגר תמוגה + β-mercaptoethanol (βME) (10 μL βME לכל 1 מ"ל מאגר תמוגה). מניחים את הדגימות על קרח להפקת RNA מיידית או לאחסן ב -80 °C (70 °F).
2. ניתוח RT-PCR כמותי
   1. מדוד כמות RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. רנ"א לתמלל לאחור באמצעות ערכת סינתזה של cDNA.
   2. ערבבו cDNA שווה ערך ל- 5 ננוגרם RNA עם פריימרים קדמיים והופוכים של 200 ננומטר אומתו מראש (טבלה 1) ותערובת מאסטר PCR פלואורסצנטית. הפעל את תגובת qRT-PCR עבור 40 מחזורים ב: 95 °C (70 °F) עבור 15 s, ולאחר מכן 60 °C (60 °F) עבור 60 s.

6. אימונוהיסטוכימיה

1. קציר ותיקון האורגנוידים
   1. מניחים צלחת 48-well על קרח במשך 30 דקות כדי לשחרר את ג'ל מטריצה.
   2. הסר את מדיית האורגנויד ולהוסיף 400 μL של PBS קר כקרח לכל באר. לאחר מכן, להסיר PBS ולהוסיף 400 μL של פתרון שחזור תאים קר כקרח לכל באר. רוק בעדינות ב 4 °C (5 °F) במשך 30 דקות.
   3. יש לצפות קצה צינור של 1 מ"ל עם 1% BSA ב-PBS, ולהזרים בעדינות את תכולת הבאר למעלה ולמטה כדי לפרק את ג'ל המטריצה. מעבירים את האורגנוידים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המונח על קרח.
   4. לשטוף כל באר עם 300 μL PBS + 1% BSA ולהעביר את כל organoids הנותרים לצינורות המתאימים. הסר פתרון שחזור תאים/PBS + BSA מכל צינור. הוסיפו 400 מיקרו-אל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן חזרו על הפעולה עם שטיפה נוספת של PBS קרה כקרח.
   5. הסר PBS ולתקן organoids עם 300 μL קר כקרח 4% PFA (ב 0.1 M PB) במשך 20 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר. הסר PFA ולשטוף organoids עם 400 μL קר כקרח PBS.
   6. הסר PBS; לאחר מכן, להוסיף 400 μL PBS + 1% BSA. יש לאחסן ב-4 °C (75°F).
2. כתמי אימונופלואורסצנטיות
   1. לשטוף organoids ב 500 μL PBS + 1% BSA. לאחר מכן, אורגנוידים מדגירה בתמיסת חסימה (5% סרום עז או חמור רגיל, 1% אלבומין בסרום בקר, 0.3% Triton X 100 ב- 1x PBS pH 7.3) למשך 2 שעות, נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר.
   2. מוסיפים את תמיסת הנוגדנים העיקרית (נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת חסימה) ומנענעים בעדינות במשך 3 לילות ב-4 מעלות צלזיוס.
   3. לשטוף organoids 4x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מתנדנד בעדינות בטמפרטורת החדר. הוסף פתרון נוגדנים משני (נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת חסימה) ואורגנוידים סלע לילה, מוגן מפני אור, ב 4 °C (4 °F).
   4. לשטוף organoids 3x עבור 1 שעה עם 500 μL PBS + 0.2% טריטון, מוגן מפני אור נדנדה בעדינות בטמפרטורת החדר. דגירה עם DAPI מדולל 1:10,000 ב 0.1 M PB במשך 20 דקות, מתנדנד ומכוסה בטמפרטורת החדר.
   5. לשטוף את organoids 3x במשך 20 דקות עם 0.1 M PB, מתנדנד בעדינות ומכוסה בטמפרטורת החדר.
3. הרכבה של אורגנוידים למיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה.
   הערה: תמונות שלב אחר שלב של תהליך הרכבת השקופיות מוצגות באיור 7.
   1. צור היקף מרובע בעובי ~1 מ"מ של חימר מידול לא רעיל במגלשת מיקרוסקופ.
   2. הסר 0.1 M PB מצינור microcentrifuge, בעדינות resuspend organoids ב 100 μL הרכבה אמצעי בחירה; לאחר מכן, להעביר למרכז כיכר החימר.
   3. ממלאים את ריבוע החימר עד שהמדיום הרכבה כמעט למעלה. לאחר מכן, מניחים כיסויים מרובעים בגודל 22 x 22 מ"מ מעל חימר ולחצו בחוזקה על צידי הכיסוי כדי לאטום. תן לו לרפא על פי הוראות היצרן (כאן, טמפרטורת החדר במשך 1-2 ימים) ולאחסן ב 4 °C (50 °F).

תוצאות

לעכברים יש CVP אחד, הממוקם בחלק האחורי של הלשון, שממנו ניתן לבודד תאי LGR5⁺ גזע(איור 1A, קופסהשחורה). הזרקת תמיסת אנזימים מתחת ל- CVP ובסביבתהגורמתלנפיחות קלה של האפיתל והעיכול של רקמת החיבור. עיכול מספיק מושגת לאחר דגירה של 33 דקות, המאפשרת הפרדה קלה ...

Discussion

דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות-עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP⁺ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG	Molecular Probes	A11056, RRID: AB_142628	1:2000
Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A11010, RRID:AB_2534077	1:2000
Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG	Invitrogen	A11075, RRID:AB_2534119	1:2000
Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG	Molecular Probes	A31573, RRID:AB_2536183	1:2000
Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG	Molecular Probes	A21247, RRID:AB_141778	1:2000
DAPI (for FACS)	Thermo Fischer	62247
DAPI (for immunohistochemistry)	Invitrogen	D3571, RRID:AB_2307445	1:10000
Goat anti-CAR4	R&D Systems	AF2414, RRID:AB_2070332	1:50
Guinea pig anti-KRT13	Acris Antibodies	BP5076, RRID:AB_979608	1:250
Rabbit anti-GUSTDUCIN	Santa Cruz Biotechnology Inc.	sc-395, RRID:AB_673678	1:250
Rabbit anti-NTPDASE2	CHUQ	mN2-36LI6, RRID:AB_2800455	1:300
Rat anti-KRT8	DSHB	TROMA-IS, RRID: AB_531826	1:100
Equipment
2D rocker	Benchmark Scientific Inc.	BR2000
3D Rotator	Lab-Line Instruments	4630
Big-Digit Timer/Stopwatch	Fisher Scientific	S407992
Centrifuge	Eppendorf	5415D
CO2 tank	Airgas	CD USP50
FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator	Thermo Scientific	4110	184 L, Polished Stainless Steel
Incucyte	Sartorius	Model: S3	Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100	Cytomation Inc	Model: S13211997	Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	Excella E1
Real-Time PCR System	Applied Biosystems	4376600
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5417R
Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi SV6
Thermal Cycler	Bio-Rad	580BR
Vortex	Fisher Scientific	12-812
Water bath	Precision	51220073
Media
A83 01	Sigma	SML0788-5MG	Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
B27 Supplement	Gibco	17504044	Stock concentration 50X, final concentration 1X
Gentamicin	Gibco	15750-060	Stock concentration 1000X, final concentration 1X
Glutamax	Gibco	35050061	Stock concentration 100X, final concentration 1X
HEPES	Gibco	15630080	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Murine EGF	Peprotech	315-09-1MG	Stock concentration 500 µg/mL, final concentration 50 ng/mL
Murine Noggin	Peprotech	250-38	Stock concentration 50 µg/mL, final concentration 25 ng/mL
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165	Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM
Nicotinamide	Sigma	N0636-100g	Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM
Pen/Strep	Gibco	15140-122	Stock concentration 100X, final concentration 1X
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	Stock concentration 500X, final concentration 1X
SB202190	R&D Systems	1264	Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 µM
WRN Conditioned media			Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC® CRL-3276™) cells
Y27632 dihydochloride 10ug	APExBIO	A3008-10	Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM
Other
1 ml TB Syringe	BD Syringe	309659
2-Mercaptoethanol, min. 98%	Sigma	M3148-25ML	β-mercaptoethanol
2.0 mL Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1420-2700
48-well plates	Thermo Scientific	150687
5 3/4 inch Pasteur Pipets	Fisherbrand	12-678-8A
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Life Science	A9647-100G
Buffer RLT Lysis buffer	QIAGEN	1015750
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cohan-Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-02
Collagenase from Clostridium histolyticum, type I	Sigma Life Science	C0130-1G
Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear	R&D Systems	3533-005-02	Matrigel
Dispase II (neutral protease, grade II)	Sigma-Aldrich (Roche)	4942078001
Disposable Filters	Sysmex	04-0042-2316
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)	Gibco	10010-023
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ & Mg2+	Sigma Life Sciences	D8662-500ML
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)	Promega	V4231
Elastase Lyophilized	Worthington Biochemical	LS002292
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
HEPES Solution	Sigma Life Science	H3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTA	Thermo Scientific	25200-056
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1706691
Modeling Clay, Gray	Sargent Art	22-4084
Needle	BD Syringe	305106
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Normal Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PowerSYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
RNeasy Micro Kit	QIAGEN	74004
Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppendorf	022363204
Sodium Chloride	Fisher Chemical	7647-14-5
Sodium Phosphate dibasic anhydrous	Fisher Chemical	7558-79-4
Sodium Phosphate monobasic anhydrous	Fisher Bioreagents	7558-80-7
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Triton X-100	Sigma Life Science	T8787-100ML
VWR micro cover glass	VWR	48366067	22x22mm