קציר ופיזור: צעד מתעלם במחקר שיטות ביופילם

Summary

מאמר זה מפרט שיטות הממחישות שלוש טכניקות נפוצות של קצירת ביופילם ופירוק חומרים על שני סוגי משטחים, בדיקות מחוספסות של שיטת קציר ומידע מינימלי שיש לקחת בחשבון בעת בחירה ואופטימיזציה של טכניקות קצירה ופירוק כדי להגביר את הרבייה.

Abstract

שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים נפרדים: גידול הביופילם במודל רלוונטי, טיפול בביופילם הבוגר, קצירת הביופילם מפני השטח ופירוק הגושים וניתוח המדגם. מבין ארבעת השלבים, קצירה ופירוק הם הפחות נחקרים אך בכל זאת קריטיים כאשר בוחנים את הפוטנציאל להטיית מבחן. מאמר זה מדגים טכניקות קציר ופירוק נפוץ עבור biofilm גדל על שלושה משטחים שונים. שלוש טכניקות קצירת הביופילם והפירוק, שלקטו מסקירת ספרות נרחבת, כוללות מערבולת ו sonication, גירוד והומוגניזציה, ושפשוף, מערבולת ו sonication. שני סוגי משטח נחשבים: קשה לא נקבובי (פוליקרבונט וזכוכית borosilicate) ונקבובי (סיליקון). בנוסף, אנו מספקים המלצות למידע המינימלי שיש לכלול בעת דיווח על טכניקת הקציר ואחריה ושיטה נלווית לבדיקת הטיה.

Introduction

ההגדרה של ביופילם התפתחה בעשורים האחרונים וכוללת קשר מיקרוביאלי עם מגוון משטחים ביולוגיים ו/או לא ביולוגיים, הכללת רכיבים נוצרליים1 המציגים צמיחה שונה וביטוי ^גנטי2 בתוך מטריצה. Biofilm מספק הגנה מפני לחצים סביבתיים כגון ייבוש ועשוי להפוך את הפעולה של חומרי חיטוי כימיים פחות יעיל וכתוצאה מכך ההישרדות של חיידקים. הניצולים בתוך ביופילם יכולים לספק מקור למיקרואורגניזמים פתוגניים המהווים דאגה לבריאות ^{הציבור3}.

שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים, צמיחה, טיפול, דגימה (קצירה ופירוק) וניתוח. צמיחה, הצעד הראשון, שבו המשתמש קובע את תנאי הצמיחה האורגניזם, טמפרטורה, מדיה, וכו ', הוא הנחשב ביותר ודווח על בספרות biofilm4,5,6,7. שלב הטיפול מעריך מיקרוביאלים (למשל, חומרי חיטוי) כדי לקבוע את יעילותם או נגד biofilm ^{בוגר3,8,9} או מיקרוביאלית עשוי להיות משולב לתוך פני השטח כדי לקבוע את היכולת של המוצר למנוע או להפחית את הצמיחה biofilm10. השלב השלישי, דגימה, כולל צעדים לקצור את הביופילם מפני השטח שעליהם הוא גדל ולפרק את הגושים שהוסרו ^3,8,11. השלב הרביעי, ניתוח, עשוי לכלול ספירת תאים בת קיימא, מיקרוסקופיה, מדידות פלואורסצנטיות, תוצאות מולקולריות ו/או הערכת רכיב ^{מטריצה8,9}. הערכת נתונים מספקת מידע על התוצאה של ניסוי. מבין הארבעה, דגימה היא לעתים קרובות הצעד המתעלמים ביותר מכיוון שהיא מניחה שטכניקת קצירת הביופילם ו/או הפירוק הנבחרת יעילה ב-100%, לעתים קרובות ללא ^אימות11.

השעיות פלנקטוניות של חיידקים, הנחשבות לעתים קרובות הומוגניות, דורשות מערבולת פשוטה לפני הניתוח. ביופילמים, לעומת זאת, הם קהילות מורכבות המורכבות ממיקרואורגניזמים (פרוקריוטים ו/או אואוקריוטים), אקסופוליסכרידים, חלבונים, שומנים, דנ"א חוץ-תאי ותאים ^{מארחים12}. צעדים מעבר לשיטות התרבות המיקרוביולוגיות הפלנקטוניות המסורתיות נדרשים על מנת לקצור כראוי ביופילם מפני השטח ולאחר מכן לפרק אותו לתוך השעיה הומוגנית של תא יחיד. סקירת ספרות מקיפה (מידע שאינו כלול בפרסום זה) הראתה כי הבחירה בטכניקת ההסרה וההתפרקות תלויה במספר גורמים, כולל מינים הנמצאים בביופילם, משטח שהביופילם מחובר אליו (לא נקבובי או נקבובי), נגישות למשטחי צמיחה (קופון נשלף בקלות או הרס פיזי של המנגנון שבו הביופילם גדל), גיאומטריה על פני השטח (שטח וצורה), צפיפות של ביופילם על משטחי צמיחה, וציוד מעבדה זמין.

כאשר ביופילם נקצר מפני השטח, ההשעיה התאית המתקבלת היא הטרוגנית. אם יש לספור במדויק את ההשעיה הלא-יוניפורמית הזו, יש לפרק אותה לתאים בודדים. ספירת לוחות קיימא מניחה שיחידת הרכבת מושבה מקורה בחיידק אחד. אם אגרגטים של ביופילם ממוקמים על מדיום הצמיחה, אי אפשר להבחין בין תאים בודדים אשר יכול להוביל להערכות לא מדויקות. לדוגמה, במהלך בדיקות יעילות חיטוי, אם טיפול מסיר biofilm ביעילות רבה מפני השטח לעומת הפקד, הפחתת יומן יכול להיראות גדול באופן מלאכותי לעומת הפקד. מצד שני, חומר חיטוי כימי שמתקן ביופילם על משטח בהשוואה לבקרה ייראה כבעל הפחתת יומן נמוכה ^יותר11. סוג זה של תרחיש יכול להוביל לפרשנות מוטה של נתונים ניסיוניים.

לקראת הפרסום, סקירה של הספרות קבעה כי גישות נפוצות לקטיף ופירוק ביופילם כוללות גירוד, ניקוי, sonication, מערבולת או שילוב של אלה. גירוד מוגדר כהסרה פיזית של ביופילם ממשטחים עם מקל סטרילי, מרית או כלי אחר. ניקוי מתייחס להסרת ביופילם ממשטחים עם מוט כותנה או חומר סופג קבוע אחר. Sonication מתייחס שיבוש של biofilm מפני משטחים באמצעות גלים קוליים מופצים דרך מים. מערבולת מתייחסת לשימוש במיקסר כדי להשיג מערבולת נוזלית של המדגם בתוך צינור. הומוגניזציה משתמשת בלהבים מסתובבים כדי להטות גושי ביופילם שנקטפו לתוך השעיה של תא יחיד. במאמר זה, אנו מציגים שלוש שיטות קציר ופירוק עבור שני סוגי משטח שונים, קשה / לא נקבובי ונקבובי.

רשימה של מידע מינימלי מומלץ שהחוקרים צריכים לכלול בסעיפי השיטות של הפרסומים מסופקת. אנו מקווים כי הכללת מידע זה תאפשר לחוקרים אחרים לשחזר את עבודתם. אין שיטת קציר ופירוק מושלמת, ולכן, המלצות כיצד לבדוק את הטכניקה מסופקים גם.

שלוש שיטות נפוצות לקצור ולפרק ביופילם ממשטחי גדילה נפוצים מודגמות במאמר זה. מידע זה יאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את הדיוק וההטיה הכוללים של שיטת בדיקת ביופילם. השיטות המתוארות הן כדלקמן: (1) ביופילם פסאודומונס aeruginosa הגדל על קופונים פוליקרבונט (משטח קשה שאינו נקבובי) תחת גזירה נוזלית גבוהה בכור Biofilm CDC נקטף ומפוזר בעקבות שילוב של חמישה שלבים של מערבולת ו sonication כדי להשיג קציר ביופילם ופירוק (2) A P. aeruginosa ביופילם שגדל על קופונים זכוכית borosilicate (משטח קשה לא נקבובי) בכור זרימת טפטוף תחת גזירה נוזלית נמוכה נקטף ומנוטרל באמצעות גירוד והומוגניזציה (3) ביופילם קולי Escherichia גדל בצינורות סיליקון (משטח נקבובי) הוא נקצר ומפוזר באמצעות גירוד, ואחריו sonication ו מערבולת.

Protocol

1. מערבולת ו sonication

1. לגדל ביופילם בוגר P. aeruginosa ATCC 15442 הגדל על פי תקן ASTM E25622.
2. בסוף תקופת הצמיחה של 48 שעות, היכונו לטיפול בביופילם ובקופונים לדוגמה על פי תקן ASTM E28718
3. הכנס באופן אספטי שומרי התזה משועבדים אוטומטית לצינורות חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל באמצעות מלקחיים מעוקרים. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות שיקבלו טיפול. צינורות עבור תלושי בקרה לא צריך מגן התזה.
4. הסר באופן אספטי מוט שנבחר באקראי מכור הביופילם של המרכז לבקרת מחלות. לשטוף קופונים כדי להסיר תאים מחוברים באופן רופף על ידי טבילה עדינה של המוט לתוך 30 מ"ל של מים חוצצים סטריליים.
5. החזק את המוט במקביל לחלק העליון של הספסל, מעל שפופרת חרוטית ריקה וסטרילית של 50 מ"ל ובאמצעות מפתח ברגים אלן מעוקר להבה, שחרר בורג מוגדר כדי להפיל קופון מצופה ביופילם לצינור. חזור על הפעולה עבור מספר הקופונים הרצוי. מוציאים את שומרי ההתזה ומניחים במיכל נפרד לעיקור.
6. באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל, לאט פיפטה 4 מ"ל של הטיפול או שליטה לתוך הצינורות, כך הנוזל זורם במורד החלק הפנימי של הקיר של הצינור.
7. הקש בעדינות על החלק התחתון של הצינור, כך כל בועות אוויר מתחת לקופון נעקרו. אפשר 30 - 60 s בין כל תוספת.
8. בסוף זמן המגע שצוין, פיפטה 36 מ"ל של מנטרל לתוך הצינורות באותו סדר שבו הטיפול (או הפקד) הוחל.
   הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת.
9. מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 ± 5 s. ודא כי מערבולת מלאה מושגת.
   הערה: יש לנקוט זהירות כאשר מערבולת קופונים כבדים כגון נירוסטה בבקבוקוני זכוכית שבו שבירה יכולה להתרחש.
10. קבע את המספר האופטימלי של צינורות לכל אמבטיה ומיקום בתוך מדף המבחנה לפני עיבוד דגימות בפועל. אם עיבוד דגימות מרובות, לאשר כי טמפרטורת המים באמבטיה sonicating הוא 21 ± 2 ^oC.
11. מניחים צינורות במתלה צינור מושעה sonicator degassed כך מפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזל בצינורות. Sonicate ב 45 kHz, 100% כוח ותפקוד רגיל עבור 30 ± 5 שניות. חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולאחר מכן לסיים עם מערבולת סופית (5 מחזורים בסך הכל).
    הערה: צינורות אלה עם biofilm שנקטפו ומפורקים הם דילול ¹⁰⁰ או 0.
12. מדללים באופן סדרתי דגימה במים חוצצים. צלחת על אגר R2A בשיטת ציפוי מתאימה. דגירה ב 36 ± 2 ^oC עבור 24 שעות. ספור מושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש ורשום נתונים.

2. גירוד והומוגניזציה

1. לגדול בוגר P. aeruginosa ATCC 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E264713.
2. הקימו את תחנת הדגימה כך שתכלול לוח דגימה, 95% אתנול בכוס, מבער אלכוהול, המוסטטים, כלי להסרת קופונים, כוסות עם מי דילול סטריליים וצינורות דילול לשטיפת הקופונים.
3. כבה את המשאבה. הסר כיסוי ערוץ ולהשתמש בכלי להסרת קופונים סטריליים hemostats כדי להסיר את הקופון, נזהר לא להפריע biofilm.
4. לשטוף את הקופון על ידי טבילה עדינה, עם תנועה נוזלית, ב 45 מ"ל של מי דילול סטריליים (הכלול צינור צנטריפוגה 50 מ"ל). מיד להפוך את התנועה כדי להסיר את הקופון.
5. מניחים את הקופון לתוך המכילה 45 מל של מי דילול סטריליים. לגרד את משטח הקופון מכוסה biofilm בכיוון כלפי מטה עבור כ 15 s, באמצעות מרית סטרילית או מגרד. יש לשטוף את המרית או המגרדת על ידי ערבוב בכוס. חזור על תהליך גירוד ושטיפה 3-4 פעמים, הבטחת כיסוי מלא של משטח הקופון.
6. לשטוף את הקופון על ידי החזקתו בזווית של 60° מעל הכוס הסטרילית וצינורות 1 מ"ל של מי דילול סטריליים על פני השטח של הקופון. יש לחזור על הפעולה במשך 5 שטיפה. הכרך הסופי בכוס הוא 50 מ"ל.
   הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת.
7. החלף כל כיסוי ערוץ כמו הקופונים מוסרים.
8. עבודה בארון בטיחות ביולוגית, הומוגניזציה מדגם biofilm שרוט. חברו גשושית הומוגניזר סטרילית להומוגניזר, הניחו את קצה הגשוש בנוזל, הפעילו את ההומוגניזר והגדילו את ה-20,500 סל"ד.
9. הומוגניזציה המדגם עבור 30 s. תנמיך את האר-פי-אם ותכבה את ההומוגניזר.
10. לחטא את הבדיקה בין דגימות ביופילם על ידי הומוגניזציה של 9 מ"ל של דילול סטרילי ריק ב 20,500 סל"ד עבור 30 s כמתואר לעיל. הומוגניזציה צינור 9 מ"ל של 70% אתנול עבור 30 s, לנתק את הגשוש ולתת לעמוד בצינור האתנול במשך 1 דקות. הומוגניזציה שני כדורי דילול נוספים.
    הערה: ניתן להשתמש בבדיקת הומוגניזר חד פעמית עבור כל דגימה.
11. לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על אגר R2A באמצעות שיטת הציפוי המתאימה. לוחות דגירה ב 36 ± ^2oC עבור 24 שעות, לספור מושבות בהתאם לשיטת ציפוי בשימוש ולהקליט נתונים.

3. גירוד, מערבולת ו sonication

1. לגדל Escherichia coli בוגר ATCC 53498 ביופילם בצנרת ^{סיליקון10}.
2. הכינו חומרי דגימה: צינורות שטיפה, שפופרת צנטריפוגה סטרילית, צלחת פטרי סטרילית ריקה, המוסטאט נירוסטט נירוסטה מעוקר להבה ומספריים, טיימר וסרגל.
3. עם המשאבה מושהית, השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלק החיצוני של הצינורות. מדוד 2 ס"מ מהסוף, הימנעות מהשטח המחובר למחבר, וסמן את הצינורות כדי לקבוע את מיקומי החיתוך.
4. עם מספריים מעוקרים להבה, לחתוך את הצינורות על הסימן 2 ס"מ ומניחים את הקטע בצלחת פטרי סטרילית ריקה. נגב את הצינורות עם 70% אתנול וחבר מחדש את הקצה הדיסטלי לצינורות פסולת.
5. יש לשטוף את מקטע הצינורות כדי להסיר תאים פלנקטוניים. עם מלקחיים מעוקרים להבה, יש לטבול בעדינות את מקטע הצינורות ב-20 מ"ל של מי דילול סטריליים ולאחר מכן להסיר מיד. מניחים את המקטע ב- 10 מ"ל של מנטרל.
6. עם מלקחיים מעוקרים להבה, להחזיק את קטע הצינורות ולגרד עם מקל אפליקטור עץ סטרילי עד כל האזורים הפנימיים של הצינורות כבר גירד. מדי פעם לשטוף את המקל ב 10 מ"ל של מנטרל ולהניח את המקטע בחזרה לתוך צינור המדגם. קטע הצינורות המגרדים הוא דילול ¹⁰⁰ או 0.
   הערה: הנפח הסופי של טיפול משולב ומנטרל חשוב לקביעת צפיפות יומן ביופילם מדויקת.
7. מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 ± 5 s. מניחים את הצינור במתלה צינור מושעה sonicator כך מפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזל בצינורות. Sonicate ב 45 kHz, 100% כוח ותפקוד רגיל במשך 30 ± 5 שניות. חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולאחר מכן לסיים עם מערבולת סופית.
   הערה: צינור זה עם הביופילם שנקטף ומפוזר הוא ¹⁰⁰ דילול.
8. לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על טריפטי סויה אגר באמצעות שיטת הציפוי המתאימה.
9. צלחות דגירה ב 36 ± 2 ^oC עבור 24 שעות. ספור מושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש, רשום נתונים וחשב את הממוצע האריתמטי.

תוצאות

אימות/אישור של שיטת קציר
מספר מחקרים שנערכו במעבדה שלנו בחנו את היכולת של מערבולת ו sonication לקצור ביעילות ביופילם גדל בכור biofilm (ASTM E2562)² באמצעות שיטת צינור יחיד (ASTM E2871)⁸.

P. aeruginosa ATCC 15442 ביופילם גדל על פי ASTM E25622 על קופונים זכו?...

Discussion

מידע מינימלי לשיטות קצירה ופיזור
כדי ליצור נתוני ביופילם הניתנים לשחזור ברחבי הקהילה המדעית, חובה על המחברים לכלול כמה שיותר פרטים לגבי כל אחד משלבי הצמיחה, הטיפול, הדגימה והניתוח של שיטת ביופילם. התקינה של שיטות ביופילם סייעה במאמץ זה שכן היא מאפשרת לחוקר להתייחס לשיטה ספציפי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506