בדיקות אנטי-ויראליות בעלות תפוקה גבוהה למסך עבור מעכבי שכפול וירוס זיקה

Summary

בעבודה זו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים בבדיקות מבוססות אנזים מבוססות replicon ויראלי כדי לסנן מעכבים של שכפול וירוס זיקה בפורמט הקרנה תפוקה גבוהה.

Abstract

גילוי תרופות אנטי ויראליות דורש פיתוח של בדיקות ביוכימיות ותאיות אמינות שניתן לבצע בפורמטים של סינון תפוקה גבוהה (HTS). חלבוני הפלביוירוס הלא מבניים (NS) נחשבים להרכיב באופן תרגום משותף על ממברנות רטיקולום אנדופלסמי (ER), ויוצרים את קומפלקס השכפול (RC). ה- NS3 וה- NS5 הם האנזימים הנחקרים ביותר של ה- RC ומהווים את המטרות העיקריות לפיתוח תרופות בשל תפקידיהם המכריעים בשכפול הגנום הנגיפי. תחום הפרוטאז NS3, הדורש NS2B כגורם המשנה שלו, אחראי על המחשוף של פוליפרוטאין ויראלי לא בוגר לתוך חלבוני NS בוגרים, בעוד NS5 RdRp תחום אחראי על שכפול RNA. להלן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקולים המשמשים בהקרנות מבוססות replicon ובדיקות אנזימטיות לבדיקת ספריות מורכבות גדולות עבור מעכבי וירוס זיקה (ZIKV) שכפול. replicons הם מערכות תת-גנומיות המשכפלות את עצמם המתבטאות בתאי יונקים, שבהן הגנים המבניים הנגיפיים מוחלפים בגן עיתונאי. ההשפעות המעכבות של תרכובות על שכפול RNA ויראלי ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת הירידה בפעילות חלבון הכתב. ההקרנות מבוססות השלילה בוצעו באמצעות קו תא BHK-21 ZIKV המבטא את רנילה לוציפראז כגן עיתונאי. כדי לאפיין את המטרות הספציפיות של תרכובות מזוהות, הקמנו בדיקות מבוססות פלואורסצנטיות במבחנה עבור פרוטאז NS3 ו- NS5 RdRp. הפעילות הפרוטאוליטית של הפרוטאז הנגיפי נמדדה באמצעות מצע הפפטיד הפלואורוגני Bz-nKRR-AMC, בעוד שפעילות התארכות NS5 RdRp זוהתה ישירות על ידי הגידול של האות הפלואורסצנטי של SYBR Green I במהלך התארכות RNA, באמצעות תבנית הפרימטינג העצמית הביוטינילית הסינתטית 3′UTR-U30 (5'-ביוטין-U30-ACUGGAGAUCUCUCCAGU-3').

Introduction

נגיף זיקה (ZIKV) הוא חבר וירוס מתפתח המועבר בפרוקי רגליים בסוג Flavivirus, הכולל את נגיף דנגי הקשורים קשר הדוק (DENV), וירוס דלקת המוח היפנית (JEV) ווירוס קדחת צהובה (YFV), המהווים איומים מתמידים על בריאות הציבור¹. התפרצות ZIKV 2015-16 באמריקה קיבלה תשומת לב עולמית בעקבות הופעתה בברזיל בשל הקשר עם הפרעות נוירולוגיות חמורות, כגון מיקרוצפליה מולדת הקשורה ל- ZIKV בתינוקות^{2,3 ותסמונת} גיליאן-בארה במבוגרים⁴. למרות שמספר מקרי ההדבקה ירד במהלך השנתיים הבאות, שידורים אוטוכטוניים המועברים על ידי יתושים של ZIKV אומתו ב -87 מדינות וטריטוריות בשנת 2019, ולכן, מה שמפנה את הפוטנציאל של הנגיף להתגלות מחדש כמגיפה⁵. עד כה, אין חיסונים מאושרים או תרופות יעילות נגד זיהום ZIKV.

גילוי תרופות אנטי-ויראליות דורש פיתוח של בדיקות תאיות וביוכימיות אמינות שניתן לבצע בפורמטים של סינון תפוקה גבוהה (HTS). הקרנות מבוססות Replicon ובדיקות ויראליות מבוססות אנזימים הן שתי אסטרטגיות חשובות לבדיקת תרכובות מולקולה קטנה עבור מעכבי ZIKV¹. חלבוני הפלביוירוס הלא מבניים (NS) נחשבים להרכבה תרגומית משותפת על הממברנות הרטיקולום האנדופלזמי (ER), ויוצרים את קומפלקס השכפול (RC)⁶. ה- NS3 וה- NS5 הם האנזימים הנחקרים ביותר של ה- RC ומהווים את המטרות העיקריות לפיתוח תרופות בשל תפקידיהם המכריעים בשכפול הגנום הנגיפי. תחום פרוטאז NS3, הדורש NS2B כגורם המשנה שלו, אחראי על המחשוף של פוליפרוטאין ויראלי לא בוגר לתוך חלבוני NS בוגרים, ואילו NS5 RdRp תחום אחראי על שכפול RNA⁶.

replicons הם מערכות תת-גנומיות המשכפלות את עצמם המתבטאות בתאי יונקים, שבהן הגנים המבניים הנגיפיים מוחלפים בגן עיתונאי. ההשפעות המעכבות של תרכובות על שכפול RNA ויראלי ניתן להעריך בקלות על ידי מדידת הירידה בפעילות חלבון הכתב⁷. להלן, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים להקרנת מעכבי שכפול ZIKV בתבנית לוחית 96-well. ההסתה המבוססת על replicon בוצעה באמצעות BHK-21 ZIKV Rluc קו תא כי פיתחנו לאחרונה^8. כדי לאפיין את המטרות הספציפיות של תרכובות מזוהות, הקמנו בדיקות מבוססות פלואורסצנטיות במבחנה עבור פרוטאז NS3 המובע באופן רקומביננטי באמצעות מצע הפפטיד הפלואורוגניים, Bz-nKRR-AMC, ואילו עבור NS5 RdRp מדדנו את ההארכה של תבנית הפרימה עצמית ביוטינילית סינתטית 3′UTR-U30 (5'-ביוטין-U30-ACUGGAGAUCUCUCUCCAGU-3'), באמצעות צבע intercalating SYBR Green I.

פרוטאז ZIKV (45-96 שאריות של קופקטור NS2B המקושר לשאריות 1-177 של NS3 תחום פרוטאז על ידי מקשר עשיר גליצין [G₄SG₄]) הושג, כמתואר עבור YFV⁹, בעוד פולימראז (276-898 שאריות של תחום RdRp) שוכפל ובא לידי ביטוי, כפי שמפורט ב¹⁰. שני רצפי האנזים נגזרו מ- GenBank ALU33341.1. כמו הקרנות אנטי ויראליות ראשוניות, תרכובות נבדקים ב 10 μM ואלה המציגים פעילויות ≥ 80% מוערכים לאחר מכן באופן תלוי מינון, וכתוצאה מכך יעיל / עיכוב (EC₅₀ או IC₅₀) ואת ריכוזים ציטוטוקסית (CC₅₀). בהקשר של תוצאות מייצגות, ערכי EC₅₀ ו CC₅₀ של NITD008, מעכב flaviviruses ידוע¹¹, מן הקרנות מבוססות replicon מוצגים. עבור התקפות אנזימטיות, ערכי_{IC 50} של שתי תרכובות מתיבת התגובה למגיפה MMV / DNDi, ספרייה המורכבת מ -400 מולקולות עם פעילויות אנטיבקטריאליות, אנטי פטרייתיות ואנטי ויראליות, מוצגים. הפרוטוקולים המתוארים בעבודה זו ניתן לשנות כדי לסנן מעכבים של flaviviruses הקשורים אחרים.

Protocol

1. פעילות לוציפראזה

הערה: ודא שכל ההליכים הקשורים לתרבות התאים מתנהלים בברדסים מאושרים של בטיחות ביולוגית (ראה טבלת חומרים).

1. הכן מדיה צמיחה המורכבת בינונית של נשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 500 מיקרוגרם / מ"ל G418.
2. הכן פתרון מלאי 10 mM של תרכובות שנבדקו ב- DMSO 100%, ולאחר מכן לדלל אותם ל 1 mM ב 100% DMSO.
3. תרבות ZIKV Rluc replicon תאים במדיה צמיחה 75 ס"מ² תרבית בקבוקון ב 37 °C בחממה CO₂-לח (ראה טבלה של חומרים)עד שהם מגיעים 70-90% השפעה.
4. זרוק את המדיום. הוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוקון במשך 5 עד 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 125 x g במשך 5 דקות.
5. השלך את supernatant, resuspend התאים ב 5 מ"ל של DMEM 10% FBS ולספור 10 μL של תאים resuspended בהמוציטומטר.
6. התאים מתאימים ל-2 x 10⁴ תאים/באר ב-DMEM 10% FBS וזרע 100 מיקרו-ל של תאים לבאר בצלחת תרבית תאים של 96-well (ראו טבלת חומרים).
7. לדגור על הצלחת במשך 16 שעות ב 37 °C בחממה CO₂-לח (ראה טבלה של חומרים).
8. לאחר מכן, להשליך את המדיום עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 100 μL / באר של DMEM 2% FBS לצלחת.
9. הוסף 1 μL של תרכובות לבאר כדי לגרום לריכוז הסופי של 10 μM 1% DMSO במצב בינוני. בעמודה הראשונה, הוסף רק 1% DMSO כבקרת ללא עיכוב ו- NITD008 בעמודה האחרונה, כשליטה חיובית (100% עיכוב).
10. לדגור את הצלחת במשך 48 שעות ב 37 °C בחממה CO₂-לח (ראה טבלה של חומרים).
11. להפשיר את ערכת מערכת אסאי רנילה luciferase בטמפרטורת החדר, להכין 1x רניל לוציפראז תמיס חוצץ ונפח מתאים של ריאגנט רנילה לוציפראז (חוצץ אסאי + מצע; 100 μL לבאר), על פי הוראות היצרן.
12. להשליך את supernatant מן התאים עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 25 μL של 1x רנילה לוציפראז ליסיס חוצץ לבאר.
13. לדגור את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולאחר מכן להעביר 20 μL של lysates התא עם micropipette רב ערוצית לצלחת אטומה לבנה 96-באר (ראה טבלה של חומרים) המכיל 100 μL / באר של רנילה לוציפראז אסאי ריאגנט.
14. קרא את האותות הזוהרים ב- luminometer או בכל ציוד שיש לו את האפשרות לקרוא זוהר (ראה טבלת חומרים).
15. עבור כל צלחת, לחשב את ערך גורם Z ¹², כדלקמן: Z′ = 1 - ((3SD של מדגם + 3SD של שליטה)/│ממוצע של מדגם - ממוצע שליטה│); SD - סטיית תקן. גורם Z בין 0.5 ל-1.0 פירושו בדיקת אסאי באיכות טובה ¹².
16. כדי לקבוע את ערכי EC₅₀ של תרכובות, המשך כמתואר בשלבים 1.3 עד 1.8 ולאחר מכן הוסף את התרכובות מדוללות באופן סדרתי לתאים , יחד עם הפקדים השליליים (1% DMSO) וחיוביים (NITD008 ב- 10 מיקרומטר). בצע את בדיקת ההסתה פעמיים בכפילויות.
17. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי EC_50.

2. תבחן MTT מבוסס התפשטות תאים

1. המשך כמתואר בפריט 1 שלבים 1.1 עד 1.8.
2. הוסף את התרכובות בתחילה ב 10 μM ואת הפקד 1% DMSO לתאים.
3. הכן פתרון 5 מ"ג/מ"ל MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפניל טטרזוליום ברומיד) בתמיסת תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS - 137 מ"מ NaCl, 2,7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na₂HPO₄, 1,8 מ"מ KH₂PO₄; pH 7.4) ומערבולת עד סולוביליזציה מלאה של MTT.
4. הוסף את פתרון MTT לתאים בעשירית מנפח הבאר (10 μL/well).
5. לדגור על הצלחת ב 37 °C בחממה CO₂לח (ראה טבלה של חומרים)עבור 3-4 שעות.
6. השלך את supernatant עם micropipette רב ערוצי ולהוסיף 100 μL של DMSO (100%) לכל באר.
7. Solubilize גבישי formazan על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן לקרוא את הספיגה ב 570 ננומטר בספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים).
8. כדי לקבוע את ערכי_{CC 50} של תרכובות, המשך כמתואר בפריט 1 שלבים 1.1 עד 1.8 ולאחר מכן הוסף את התרכובות מדוללות באופן סדרתי לתאים, יחד עם הפקד השלילי (1% DMSO). בצע את בדיקת ההסתה פעמיים בכפילויות.
9. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי CC_50.

3. NS2B-NS3 פעילות פרוטאז

1. להפשיר עלי-קוט חלבונים על קרח.
2. הגדר את הטמפרטורה של קורא הלוחות(ראה טבלת חומרים ) ל- 37°C.
3. הכן את הכמות המתאימה של חלבון מדולל ל 80 ננומטר (5 μL / well). ריכוז החלבון הסופי הוא 4 ננומטר.
4. להפשיר את הכמות המתאימה של מצע Bz-nKRR-AMC על קרח (פתרון מלאי 300 μM מדולל במאגר אסאי, 10 μL / טוב).
5. בצלחת לבנה 96-well (ראה טבלה של חומרים),לחלק 84 μL של חוצץ אסאי (20 mM טריס pH 8.5, 5% גליסול ו 0.01% טריטון X-100) בכל באר.
6. כדי להפוך את תגובת השליטה החיובית, לכל באר של העמודה האחרונה לוותר 1 μL של אפרוטינין כדי להשיג ריכוז סופי של 1 μM (פתרון מלאי 100 מיקרומטר מדולל במים)
7. כדי להפוך את תגובת השליטה השלילית, לעמודה הראשונה לחלק 1 μL של DMSO (ריכוז סופי 1%).
8. כדי לבצע את ההקרנה המורכבת, לחלק 1 μL של כל תרכובת כדי להשיג ריכוז סופי של 10 μM (1 mM ריכוז מלאי) למעט בארות שליטה חיובית ושלילית.
9. מחלק 5 μL של פתרון פרוטאז.
10. לדגור על הצלחת ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
11. כדי להתחיל את התגובה, לוותר על 10 μL של פתרון מלאי Bz-nKRR-AMC (ריכוז סופי של 30 מיקרומטר).
12. הגדר את אורך גל העירור ל 380 ננומטר ופליטה ל 460 ננומטר ולקרוא את פלואורסצנטיות במשך 30 דקות כל 1 דקות בקורא מיקרופלסטיק (ראה טבלה של חומרים). בצע את הניסוי כולו ב 37 °C (50 °F).
13. חשב את הערכים הממוצעים של הפלואורסצנטיות עבור תגובות שליטה חיוביות ושליליות. הגדר כ- 100% מפעילות הפרוטאז את הערך הממוצע של פלואורסצנטיות לתגובות שליטה שליליות שהופחת מהערך הממוצע של שליטה חיובית וחשב את אחוזי הפעילות עבור כל מתחם.
14. עבור כל צלחת, חשב את ערך גורם Z, כמתואר בשלב 1.15.
15. המשך עם קביעת_{IC 50} עבור תרכובות שהפגינו שיעור עיכוב גבוה מ 80%.
16. בצע את ההסתייגות במשולשים כמתואר בשלבים 3.1-3.13, באמצעות דילול סדרתי של המתחם.
17. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי IC_50.

4. NS5 RdRp הארכה

הערה: כל החומרים המשמשים ב- assay זה הם RNase, DNase ו pyrogenase ללא אישור.

1. הכן הן את חיץ ה- Assay (50 mM Tris pH 7.0, 2.5 mM MnCl₂, 0.01% טריטון X-100) והן את פתרון מלאי ATP 200 mM עם 0.1% מים מטופלים על ידי דיתילפירוקרבונט (DEPC).
2. אנל 5 μL aliquot של 200 מיקרומטר 3′UTR-U₃₀ (5'-ביוטין-U₃₀-ACUGGAGAUCUCUCCAGU-3') במים שטופלו ב- PCR על ידי דגירה במשך 5 דקות ב 55 °C (55 °F) בתרמוציט.
3. להפשיר את פתרון המלאי של NS5 RdRp, 200 mM ATP ו x10.000 SYBR ירוק I על קרח.
4. לדלל את החלבון לריכוז סופי של 250 ננומטר ב 3 מ"ל של חוצץ אסאי.
5. הכן פתרון מצע על ידי דילול פתרונות המלאי של ATP, 3'UTR-U₃₀ ו SYBR ירוק I ב 3 מ"ל של מאגר בדיקה לריכוז סופי של 1 mM, 300 nM ו 1X, בהתאמה.
6. בלוח PCR של 96 באר (ראה טבלת חומרים), הוסף 24.5 μL של חלבון מדולל בעמודות 1 עד 11 של כל שורה. הוסף את אותו נפח של מאגר צ'ייד בבארות הנותרות.
7. לשליטה ולתגובה ריקה, הוסף 0.5 μL של DMSO בעמודות 1 ו- 12. הוסף 0.5 μL של תרכובת מדוללת DMSO לריכוז סופי של פתרון מלאי 1mM 10 μM).
8. אוטמים את הצלחת בסרט איטום ודגרה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
9. התחל את התגובה על ידי הוספת 25 μL של פתרון מצע ולאטום את הצלחת שוב.
10. דגירה ב 30 °C (50 °C) במערכת PCR בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים)ולנטר את הפלואורסצנטיות במשך שעה אחת, מדידת פלואורסצנטיות כל 30 s עם מסנן FAM (פליטה:494 ננומטר / עירור:521 ננומטר).
11. עבור כל צלחת, חשב את ערך גורם Z, כמתואר בשלב 1.15.
12. המשך עם קביעת_{IC 50} עבור תרכובות שהפגינו שיעור עיכוב גבוה מ 80%, כפי שתואר בשלב 3.15.
13. התווה את הערכים הממוצעים של שיעורי עיכוב לריכוז מורכב ולהשתמש בתוכנת ניתוח גרף כדי לבצע התאמה סיגמוידלית ולקבל את ערכי IC_50.

תוצאות

כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יובשו בלוחות 96-well ומאפשר הערכה של 80 תרכובות לצלחת בהקרנה ראשונית של ריכוז יחיד, כולל הפקדים השליליים והחיוביים שהוצבו בעמודה הראשונה והאחרונה של הלוחות, בהתאמה. ההקרנות מבוססות replicon מיוצגות באיור 1, הכולל את מבנה הרנ"א שפותח כדי להשיג את קו התא BH...

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להיות מותאמים בקלות להקרנות בפורמטים של 384 או 1536-well. עבור הקרנות ביוכימיות ו/או מבוססות תאים המבוצעות בתבנית HTS, ערך פקטור Z' , פרמטר סטטיסטי, מחושב עבור כל צלחת כדי להבטיח את הרגישות, הרבייה והדיוק של בדיקות^{אלה 12}. ערך פקטור Z של 0.5 ומעלה צפוי להקרנו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-biotin-U30- ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU -3'	Dharmacon	-	100 ng
96-well cell culture plates	KASVI	K12-096
96-well PCR Microplate	KASVI	K4-9610
96-well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate	Corning	3922
AMC (7-amine-4-methylcoumarin)	SIGMA-Aldrich	257370	100 mg
Aprotinin from bovine lung	SIGMA-Aldrich	A1153	10 mg
ATP	JenaBioscience	NU-1010-1G	1 g
Bz-nKRR-AMC	International Peptides	-	5 mg
Class II Biohazard Safety Cabinet	ESCO
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA-Aldrich	D5758	25 mL
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	SIGMA-Aldrich	472301	1 L
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	GIBCO	3760091
Fetal Bovine Serum	GIBCO	12657-029	500 mL
G418	SIGMA-Aldrich	A1720	Disulfate salt
Glycerol	SIGMA-Aldrich	G5516	1 L
HERACELL VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific
MnCl2 tetrahydrate	SIGMA-Aldrich	203734	25 g
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)	Invitrogen	M6494
NITD008 ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	SML2409	5 mg
qPCR system Mx3000P	Agilent
Renilla luciferase Assay System	PROMEGA	E2810
SpectraMax Gemini EM Fluorescence Reader	Molecular Devices
SpectraMax i3 Multi-Mode Detection Platform	Molecular Devices
SpectraMax Plus 384 Absorbance Microplate Reader	Molecular Devices
SYBR Green I	Invitrogen	S7563	500 µl
Triton X-100	SIGMA-Aldrich	X100	500 mL
Trizma base	SIGMA-Aldrich	T1503	1 kg
Trypsin-EDTA Solution 1X	SIGMA-Aldrich	59417-C	100 mL