שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות

Summary

חומצות פנוליות הן פיטוכימיקלים חשובים הנמצאים בדגנים מלאים. יש להם תכונות ביו-אקטיביות כגון פונקציות הגנה נוגדות חמצון. עבודה זו נועדה לדווח על שיטה כללית לזיהוי HPLC, הערכת תכולה פנולית כוללת וקביעת היכולת נוגדת החמצון של חומצות פנוליות בדגנים וקטניות.

Abstract

חומצות פנוליות הן סוג של תרכובות אורגניות הנושאות הן קבוצה פנולית והן קבוצה קרבוקסילית. הם נמצאים בדגנים ומתרכזים בסובין של דגנים או בציפוי זרעים של קטניות. הם בעלי תכונות נוגדות חמצון שעוררו עניין מחקרי רב בשנים האחרונות, על תפקודי הבריאות המגנים הפוטנציאליים שלהם. עבודה זו מציגה שיטה כללית למיצוי של חומצות פנוליות מסיסות בחינם מדגנים מלאים וניתוח של יכולת נוגדת החמצון שלהם. נעשה שימוש בחמש דגימות מדגנים מלאים שכללו שני דגנים (חיטה ותירס צהוב) ושלוש קטניות (שעועית פרה, שעועית כליה וסויה). הדגנים נטחנו לקמח והחומצות הפנוליות המסיסות בחופשיות שלהם הופקו באמצעות מתנול מימי. לאחר מכן זוהו התרכובות באמצעות כרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (HPLC). שיטת Folin-Ciocalteu שימשה לקביעת התכולה הפנולית הכוללת שלהם, בעוד שיכולות נוגדות החמצון שלהם נקבעו באמצעות יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC) ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). החומצות הפנוליות שזוהו כללו חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרולית. חומצה ונילית זוהתה רק ב-cowpea בעוד שחומצה קפאית זוהתה רק בפולים בכליות. חומצה p-Coumaric זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה, בעוד שחומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות. חומצה פרולית הייתה החומצה הפנולית השלטת שזוהתה. הריכוז הכולל של חומצות פנוליות בדגימות ירד בסדר הבא: פולי סויה > שעועית פרה > תירס צהוב = שעועית כליה > חיטה. היכולת נוגדת החמצון הכוללת (סכום הערכים של מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC) ירדה באופן הבא: פולי סויה > שעועית כליות > תירס צהוב = שעועית פרה > חיטה. מחקר זה הגיע למסקנה כי ניתוח HPLC, כמו גם מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC מספקים מידע שימושי על הרכב החומצה הפנולית ועל התכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים.

Introduction

חומצות פנוליות הן בין הפיטוכימיקלים החשובים ביותר שנחקרו בצמחים בשל התפקיד החיוני שהם ממלאים בהגנה על הצמחים מפני זיהום עשבוני ופטרייתי, כמו גם בשמירה על תמיכה מבנית ושלמות ברקמות הצמח ^1,2. הם מצויים בשפע בסובין של דגנים ובמעיל זרעים של קטניות³. מבחינה מבנית, הם מחולקים לשתי קבוצות: החומצות ההידרוקסיבנזואיות (איור 1) וחומצות הידרוקסיצינמיות (איור 2). החומצות ההידרוקסיבנזואיות הנפוצות בדגנים ובקטניות כוללות חומצות גאליות, p-הידרוקסיבנזואיות, 2,4-דיהידרוקסיבנזואיות, פרוטוקאצ'ואיות, וניליות וסירינגיות, בעוד שהחומצות ההידרוקסיצינמיות הנפוצות כוללות חומצות קפאיות, p-קומרית, פרוליות וסינפיות³. לחומצות פנוליות יש גם תכונות נוגדות חמצון, שכן הן מסוגלות לטרוף רדיקלים חופשיים, הגורמים לעופש חמצוני בשומנים, וליזום ולהפיץ עקה חמצונית הנגרמת על ידי רדיקלים במערכות פיזיולוגיות ^4,5. בשל תפקיד פיזיולוגי חיוני זה כמו נוגדי חמצון, הם הנושא של המחקר האחרון. הסיבה לכך היא שכאשר הם נצרכים כמרכיבים של מזונות צמחיים, הם יכולים להפעיל הגנה נוגדת חמצון.

דגנים ומוצרי דגנים הם מקורות מזון עיקריים לפחמימות עבור בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם⁶. דגנים כוללים חיטה, אורז, תירס (תירס), שעורה, טריטיקל, דוחן וסורגום. ביניהם, התירס הוא המנוצל ביותר, עם ניצול עולמי מוערך של 1,135.7 מיליון טון בשנת 2019/2020, ואחריו חיטה עם ניצול עולמי מוערך של 757.5 מיליון טון באותה תקופה⁷. מזונות דגנים הם מקורות אנרגיה נהדרים לצרכנים שכן הם מקורות עשירים של פחמימות. הם גם מספקים קצת חלבון, שומן, סיבים, ויטמינים ומינרלים⁶. בנוסף לערכם התזונתי, דגנים הם מקורות טובים לנוגדי חמצון פיטוכימיים, במיוחד חומצות פנוליות, שיש להן פוטנציאל להגן על המערכת הפיזיולוגית מפני נזקי חמצון הנגרמים על ידי רדיקלים³. קטניות הן גם מקורות טובים של חומרים מזינים והן בדרך כלל עשירות יותר בחלבון מאשר דגנים. הם מכילים גם ויטמינים ומינרלים ומשמשים להכנת מזונות שונים⁸. בנוסף, קטניות הן מקורות טובים למגוון נוגדי חמצון פיטוכימיים, כולל חומצות פנוליות, פלבנואידים, אנתוציאנינים ופרואנתוציאנידינים ^9,10. זנים שונים של דגנים וקטניות עשויים להיות בעלי הרכב שונה של חומצה פנולית. לכן יש צורך לחקור את הרכב החומצה הפנולית של דגנים וקטניות ואת הזנים שלהם, על מנת לדעת את היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם ביחס לנוגדי חמצון פנוליים.

מספר בדיקות דווחו על מדידת כמות החומצות הפנוליות בדגנים ובגרגרי קטניות, וקביעת פעילותן נוגדת החמצון. שיטות הניתוח הנפוצות ביותר עבור חומצות פנוליות מדגנים מלאים הן ספקטרופוטומטריה וכרומטוגרפיה נוזלית¹¹. מטרת עבודה זו הייתה להדגים שיטה כרומטוגרפית נוזלית כללית בלחץ גבוה לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית, ושיטות ספקטרופוטומטריות לקביעת התכולה הפנולית הכוללת והיכולת נוגדת החמצון של חלק מדגנים מלאים וקטניות.

Protocol

1. סוג הדגימות

1. השתמש בחמש דגימות דגנים מלאים, הכוללות שני דגנים (למשל, חיטת דורום ותירס צהוב) ושלוש קטניות (למשל, שעועית פרה שחורה, סויה ושעועית אדומה) לצורך מחקר זה.
2. טוחנים 50 גרם של כל גרגר במשולש לקמח, באמצעות מטחנת קפה, ומעבירים אותם דרך מסננת של 500 מיקרומטר.
3. אחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת דוגמאות

1. קביעת תכולת החומר היבש וביטוי בסיס משקל יבש
   הערה: קבע את תכולת החומר היבש של כל דגימת אבקה לפי השיטה של AOAC (2000)¹².
   1. הפעילו תנור הסעה כפוי והגדירו את הטמפרטורה ל-130 מעלות צלזיוס.
   2. חומר מייבש יבש (ג'ל סיליקה) בתנור למשך 30 דקות עד שעה ומעביר את ג'ל הסיליקה המיובשת למייבש.
   3. שקלו במדויק 2 גרם מכל דגימה לתוך פחית אלומיניום נקייה, מיובשת מראש ושקולה.
   4. מייבשים את הדגימות השקולות בטמפרטורה של 130 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בתנור הסעה מאולץ.
   5. מעבירים את הדגימה המיובשת למייבש ומאפשרים להתקרר לטמפרטורת הסביבה.
   6. שקלו את הדגימה המיובשת והמקוררת ותעדו את משקלה.
   7. חשב את תכולת החומר היבש של כל דגימה באופן הבא:
      
   8. ציין כל פרמטר שנמדד על בסיס משקל יבש באמצעות הנוסחה הבאה:
      
2. מיצוי חומצה פנולית
   הערה: חלץ את התרכובות הפנוליות החופשיות המסיסות בדגימות הדגנים באמצעות שינוי השיטה של Y. Qiu et ^al.5 המאפשרת מיצוי פנולי מכמויות מיליגרם של דגנים מלאים.
   1. שקלו במדויק 100 מ"ג מדגימת הקמח המלא ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בצבע ענבר בקיבולת של 2 מ"ל. הצבע הכהה של הצינור מסייע למנוע חשיפה של התערובת לאור.
   2. הוסף 1 מ"ל של 80% מתנול מימי ברמת HPLC לכל אחד מהצינורות המכילים את הדגימות.
   3. מערבולת לזמן קצר כדי לערבב את תמיסת המתנול ואת הדגימות.
   4. Sonicate את הדגימות במשך 60 דקות כדי לחלץ את התרכובות הפנוליות המסיסות בחינם. שים כיסוי על הדגימות למשך הזמן של הסוניקציה להגנה נוספת מפני אור.
   5. לאחר הסוניקציה, צנטריפוגה של התערובת ב-20,000 × גרם למשך 5 דקות כדי להקדיש את השאריות המוצקות ולהשאיר את הסופרנאטנט למעלה. תרכובות פנוליות חופשיות יהיו קיימות בסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה.
   6. מעבירים את ה-supernatant לתוך צינור מיקרו-סנטריפוג' נקי.
      הערה: יש לסנן את ה-supernatant לפני ההזרקה למכשיר ה-HPLC. כדי לסנן את המזרק, הסר את הבוכנה של מזרק 3 מ"ל והצמד מסנן מזרק. המסנן צריך להיות בגודל נקבובית של לא יותר מ 0.22 μm.
   7. פיפטה כ-0.4 מ"ל של ה-supernatant לתוך החלק העליון של המזרק. הכנס מחדש את הבוכנה ודחף את הנוזל דרך המסנן לתוך בקבוקון HPLC המכיל תוספת בקבוקון.
   8. לאחר שהמכשיר הוגדר להפעלת השיטה המתוארת בכתב היד לניתוח HPLC, טען את הבקבוקונים לתוך הקרוסלה כדי להתאים לרשימת הדגימות.
   9. קבל כרומטוגרמות HPLC ב- 320 ננומטר ו- 280 ננומטר המציגות פסגות נפרדות המייצגות תרכובות פנוליות שונות.
   10. באמצעות עקומות סטנדרטיות מתאימות, כימתו חומצות הידרוקסיצינמיות ב-320 ננומטר מכיוון שיש להן ספיגה מקסימלית באורך גל זה. על פי אותו עיקרון, לכמת חומצות הידרוקסיבנזואיות ב 280 ננומטר.
   11. אחסן את התמציות הנותרות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לניתוחים אחרים.

3. הרכב פנולי

1. השתמש בכרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (טבלת חומרים) כדי לזהות ולכמת את התרכובות הפנוליות המופקות בדגימות, בהתבסס על השיטה של J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu ו- T. Beta ⁴.
2. הכינו את תקני החומצה הפנולית (חומצה ונילית, חומצה קפאית, חומצה p-קומרית, חומצה פרולית וחומצה סינאפית) כדי לזהות ולכמת תרכובות פנוליות מרכיבות בתמציות.
3. לשם כך, שקלו 1 מ"ג מכל תקן והתמוססו ב-1 מ"ל של 50% מתנול מימי כדי לייצר 1,000 מיקרוגרם/מ"ל מכל תקן.
4. מערבבים נפחים שווים של כל חמשת התקנים בצינור צנטריפוגת ענבר של 2 מ"ל כדי לייצר קוקטייל של תקנים, שלכל אחד מהם יש ריכוז של 200 מיקרוגרם/מ"ל.
5. מכינים דילולים סדרתיים של הקוקטייל הסטנדרטי על ידי לקיחת נפח לתוך צינור חדש ודילול בנפח שווה של ממס מתנול מימי.
6. חזור על הדילולים הסדרתיים עד לריכוז של 3.125 מיקרוגרם/מ"ל.
7. כמו כן, דיללו בנפרד כל תקן 40 פעמים עם הממס כדי לקבל ריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל של כל תקן.
8. הגדר את טמפרטורת העמודה ל- 35 °C (85 °F) ואת טמפרטורת התנור לדוגמה ל - 15 °C (74 °F).
9. כדי להכין פאזה ניידת A (0.1% חומצה פורמית מימית), מעבירים 1 מ"ל של חומצה פורמית לבקבוקון נפחי בקיבולת של 1 ליטר ומוסיפים מים ברמת HPLC לסימן 1 ליטר. לנער היטב כדי לערבב.
10. כדי להכין פאזה B ניידת (0.1% חומצה פורמית במתנול), מעבירים 1 מ"ל של חומצה פורמית לתוך בקבוקון נפחי בקיבולת של 1 ליטר ומוסיפים מתנול ברמת HPLC לסימן 1 ליטר. לנער היטב כדי לערבב.
11. התאם את אמצעי האחסון לסימן 1 L במידת הצורך.
12. סנן את שני השלבים הניידים באמצעות מסנן הידרופילי של 0.45 מיקרומטר.
13. לצורך הניתוח, הזריקו 10 μL מכל תמצית או תקן (תקני 25 מיקרוגרם/מ"ל והקוקטיילים הסטנדרטיים) לעמודת הפאזה ההפוכה.
14. Elute עם השלבים הניידים על פי תוכנית השיפוע הליניארית למשך 25 דקות ריצה כדלקמן: 0-3.81 דקות, 9%-14% B; 3.81-4.85 דקות, 14%-15% B; 4.85-5.89 דקות, 15%-15% B, 5.89-8.32 דקות, 15%-17% B; 8.32-9.71 דקות, 17%-19% B; 9.71-10.40 דקות, 19%-19% B; 10.40-12.48 דקות, 19%-26% B; 12.48-13.17 דקות, 16%-28% B; 13.17-14.21 דקות, 28%-35% B; 14.21-15.95 דקות, 35%-40% B; 15.95-16.64 דקות, 40%-48% B; 16.64-18.37 דקות, 48%-53% B; 18.37-22.53 דקות, 53%-70% B; 22.53-22.88 דקות, 70%-90% B; 22.88-25.00 דקות, 90% B.
15. השווה את זמני השמירה של פסגות כרומטוגרפיות שהתקבלו עבור הסטנדרטים האותנטיים של ריכוזים 25 מיקרוגרם/מ"ל, ב-280 ננומטר ו-320 ננומטר, עם אלה של התמציות, על מנת לזהות את התרכובות הפנוליות המרכיבות בדגימות.
16. עקומות כיול התוויה עבור קוקטיילים סטנדרטיים של חומצה פנולית, עם ריכוז של התקנים על הציר האופקי, ושטח השיא על הציר האנכי
17. השתמש בעקומות הכיול כדי להעריך את הריכוזים של התרכובות הפנוליות שזוהו, על ידי השוואת אזורי השיא בחלקה לאלה של התרכובות שזוהו ב-280 ננומטר ו-320 ננומטר כפי שצוין בסעיף הקודם.

4. סך הכל תוכן פנולי

הערה: קבע את התוכן הפנולי הכולל של התמציות באמצעות שיטת Folin-Ciocalteu המתוארת על ידי F.B. Apea-Bah et ^al.13.

1. הכינו את תקני החומצה הפרולית וחומצה הגאלית בטווח הריכוזים של 0.025 עד 0.150 מ"ג/מ"ל כדי להתוות עקומות כיול בהשוואה, להערכת התוכן הפנולי הכולל.
2. כדי לעשות זאת, שקלו במדויק 1 מ"ג כל אחד מהסטנדרטים של חומצה פרולית וחומצה גלית לצינורות צנטריפוגה בקיבולת של 2 מ"ל.
3. הוסיפו 1 מ"ל של 50% מתנול מימי לכל תקן ומערבולת להתמוססות, והפיקו מלאי של 1 מ"ג/מ"ל מכל תקן.
4. הכן סדרה של דילולים מכל פתרון מלאי בסך הכל 500 μL.
5. פיפט 18.2 μL של כל תמצית או תקן לתוך באר נפרדת על לוחית מיקרו של 96 בארות.
6. הוסף 36.4 μL של 10% (v/v) מגיב Folin-Ciocalteu מימי לכל תמצית או תקן.
7. לאחר מכן, הוסף 145.4 μL של 700 mM נתרן פחמתי לכל תערובת תגובה.
8. דגירה של תערובות התגובה בחושך בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך שעתיים.
9. קרא את הספיגה בקורא מיקרו-לוחיות ב-750 ננומטר.
10. התווה עקומות כיול של שינוי בספיגה כנגד ריכוז תקני החומצה הפנולית והשתמש בהן כדי להעריך את סך התוכן הפנולי.
11. ציין את התוצאות כשווה ערך לחומצה פרולית מיליגרם לגרם של דגימה טחונה (mg FAE/g) וחומצה גאלית מיליגרם שווה ערך לגרם של דגימה טחונה (mg GAE/g) על בסיס משקל יבש.

5. מבחני נוגדי חמצון

הערה: קבע את הקיבולת נוגדת החמצון של תמציות הדגנים באמצעות שלושת המבחנים הבאים: 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידראזיל (DPPH) יכולת נבלה רדיקלית של 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידרזיל (DPPH); 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) יכולת נבלה רדיקלית (ABTS), הנקראת גם יכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC); ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC).

1. הכנת תקני Trolox לקימורים סטנדרטיים
   1. השתמשו ב-Trolox, אנלוגיה מסיסה במים של ויטמין E, כסטנדרט כדי להעריך את היכולת נוגדת החמצון במבחנה של תמציות הדגנים המלאים.
   2. שוקלים במדויק 1 מ"ג של Trolox לתוך צינור 15 מ"ל. להמיס ב 4 מ"ל של 50% מתנול מימי. מערבולת להתמוסס כדי להכין תמיסת מלאי של 1 mM (1000 μM).
   3. הכינו שישה ריכוזים של Trolox, כלומר, 50, 100, 200, 400, 600 ו-800 μM כדי להתוות עקומות סטנדרטיות להערכת יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH ויכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC). באופן דומה, הכינו ריכוזים של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרומטר של Trolox להערכת יכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). התאם את הנפח הכולל של כל ריכוז ל- 500 μL כפי שמוצג בטבלה 1.
2. דילול תמציות דגימה
   1. דיללו את תמציות הדגימה עם מתנול לפני הניתוח. כאן, תמציות תירס צהובות ופרות דוללו פעמיים, החיטה ופולי הכליה דוללו חמש פעמים ואילו תמצית הסויה דוללה 10 פעמים עם מתנול.
3. בדיקת יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC)
   1. מדוד את היכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC) של הדגימות בשיטה שתוארה קודם לכן על ידי F.B. Apea-Bah et ^al.14.
   2. שקלו 8.23 מ"ג של ABTS לתוך צינור צנטריפוגת ענבר נקי בקיבולת של 2 מ"ל.
   3. לאחר מכן, שקלו 1.62 מ"ג של אשלגן פרסולפט לצינור צנטריפוגת ענבר נקי נוסף בקיבולת של 2 מ"ל.
   4. מוסיפים 1 מ"ל מים מזוקקים לכל אחד מהם ומערבולת כדי להמיס אותם.
      הערה: התוצאה היא תמיסת מלאי ABTS של 16 mM עם תמיסת אשלגן פרסולפט מימית של 6 mM.
   5. הכן את תמיסת מלאי ABTS על ידי ערבוב תמיסות ABTS ואשלגן פרסולפט בכמויות שוות. הפתרון ישתנה מיד לצבע כהה.
   6. דגירה של תערובת הריאגנטים בחושך במשך 12-16 שעות.
   7. דיללו את תמיסת ה-ABTS 30 פעמים עם 200 mM פוספט עם מלח (PBS), כדי ליצור את תמיסת העבודה של ABTS. לשם כך, הוסף 58 מ"ל של 200 mM PBS ל-2 מ"ל של פתרון המניות ABTS. הפתרון העובד יכיל 0.27 mM ABTS ו 0.1 mM אשלגן persulfate.
   8. לצורך הניתוח, יש למקם 10 μL של כל תמצית מדוללת או Trolox לתוך מיקרו-פלטה של 96 בארות.
   9. מוסיפים 190 μL של תמיסת עבודה ABTS לכל באר ומדגרים את תערובות התגובה למשך 60 דקות.
   10. מודדים את הספיגה של תערובות התגובה ב-750 ננומטר בקורא מיקרו-פלטה.
   11. השתמש בתקני Trolox בריכוז הנע בין 100 ל-800 מיקרומול/ל' כדי להתוות עקומת כיול.
   12. הערך את יכולת הנבלה הרדיקלית של ABTS מעקומת הכיול.
   13. להביע את התוצאות כמיקרומול Trolox שווה ערך לכל גרם (μmol TE/g) דגימה על בסיס משקל יבש.
4. בדיקת DPPH
   הערה: קבע את יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH של הדגימות בשיטה שתוארה קודם לכן על ידי F.B. Apea-Bah et ^al.13. הבדיקה נוגדת החמצון DPPH דורשת תרכובת יוצרת רדיקלים, DPPH (2,2-דיפניל-1-פיקריל הידרזיל).
   1. שקלו במדויק 1.2 מ"ג של DPPH לתוך צינור צנטריפוגה ריק בקיבולת של 50 מ"ל. ממיסים את ה-DPPH ב-30 מ"ל של מתנול כדי להכין תמיסת מתאנולית של 60 מיקרומול/ל'.
      הערה: בדיקת DPPH בודקת את היכולת של תמציות הדגימה לנטרל רדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי DPPH.
   2. לצורך הניתוח, הוסף 5 μL של תמציות הדגימה או תמיסת Trolox לתוך בארות microplate.
   3. לאחר מכן, הוסיפו 195 μL של תמיסת 60 μmol/L DPPH methanolic ודגירה למשך 60 דקות.
   4. למדוד את הספיגה של תערובת התגובה ב 515 ננומטר.
   5. השתמש בתקני Trolox (50-800 μmol/L) כדי להתוות עקומת כיול, עם השינוי בספיגה על הציר האנכי וריכוזי Trolox על הציר האופקי.
   6. הערך את יכולת הנבלה של DPPH מעקומת הכיול.
   7. להביע את התוצאות כמיקרומול Trolox שווה ערך לכל גרם (μmol TE/g) דגימה על בסיס משקל יבש.
5. יכולת ספיגת רדיקלי חמצן
   1. קבע את יכולת הספיגה של רדיקלי החמצן (ORAC) של הדגימות בהתבסס על השיטה של F.B. Apea-Bah et ^al.13.
   2. כדי להתחיל, הכינו את תקני Trolox בריכוזים 6.25, 12.5, 25 ו-50 μM מתמיסת מלאי סטנדרטית של 1,000 μM Trolox ב-75 mM אשלגן פוספט (K₂HPO₄/KH₂PO₄).
   3. כדי לעשות זאת, שקלו 1 מ"ג אבקת Trolox והתמוססו ב-4 מ"ל של תמיסת המאגר תחת סוניקציה כדי להכין תמיסת מלאי של 1,000 μM.
   4. לאחר מכן, קח 50 μL של תמיסת המלאי לתוך צינור צנטריפוגה בקיבולת של 2 מ"ל ודילל עם 950 μL של תמיסת buffer כדי להשיג 1,000 μL של תמיסת μM Trolox של 50 μM.
   5. Pipette 500 μL של תמיסת 50 μM לתוך צינור חדש ומדולל עם נפח שווה של חיץ כדי לקבל תמיסת 25 μM Trolox.
   6. חזור על הדילול הטורי של 25 μM כדי לקבל 12.5 μM, ולאחר מכן חזור באופן דומה על הדילול של 12.5 μM כדי לקבל 6.25 μM.
   7. הכן דילולים מתאימים של תמציות הדגימה.
   8. מדללים את תמציות התירס הצהוב והפרה 20 פעמים, את תמציות החיטה והשעועית הכליות 50 פעמים, ואת תמצית הסויה 100 פעמים עם תמיסת החיץ.
   9. העבר 200 μL של כל דגימה או תקן Trolox לתוך הבארות של מיקרו-לוח שחור של 96 בארות עבור צנרת אוטומטית.
   10. לאחר מכן, מלא את שלושת מיכלי הריאגנטים המסופקים עם ציוד ORAC, עם הדברים הבאים: (1) פתרון החיץ; (2) 0.816 ננומטר פלואורסצין במאגר; ו-(3) 153 מ"מ של 2,2′-אזוביס(2-אמידינופרופאן) דיהידרוכלוריד (AAPH) בחיץ.
   11. הניחו אותם בכלי הקיבול שלהם לצורך צנרת אוטומטית.
   12. הגדר את מכונת ORAC ואת מערכת הצינורות האוטומטית לניתוח, בהתבסס על נוהל ההפעלה הסטנדרטי.
   13. לצורך הניתוח, הגדר את מערכת הצינורות האוטומטית להעברת 25 μL של כל תמצית מדוללת או תקן לבארות של מיקרו-פלטה שחורה שקופה של 96 בארות.
   14. לאחר מכן, הוסף באופן אוטומטי 150 μL של 0.816 ננומטר פלואורסצין במאגר.
   15. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במכונת ORAC.
   16. לאחר מכן, הוסף באופן אוטומטי 25 μL של AAPH לכל תערובת תגובה.
   17. דגירה אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות במכונת ORAC.
   18. הגדר את מכונת ORAC למדידת הדעיכה הפלואורסצנטית, במהלך תקופת הדגירה, באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ננומטר ו-520 ננומטר, בהתאמה.
   19. לאחר המדידות, התווה עקומת תקן Trolox, עם Trolox (6.25-50 μM) על הציר האופקי ודעיכה פלואורסצנטית על הציר האנכי.
   20. הערך את יכולת הספיגה של רדיקלי החמצן של התמציות מהעקומה הסטנדרטית של Trolox.
   21. ציין את התוצאות כדגימת μmol TE/g על בסיס משקל יבש.
6. ניתוח סטטיסטי
   1. הצג את כל התוצאות כאמצעי ± סטיית תקן של לפחות משולשים.
   2. בצע ניתוח של שונות (ANOVA) כדי לקבוע את ההשפעה של סוג גרגר על משתני התגובה.
   3. כאשר קיימים הבדלים משמעותיים ב- p < 0.05, השתמש בהפרש הכי פחות משמעותי (LSD) כדי להשוות את האמצעים.
   4. בצע ניתוח מתאם פירסון כדי להעריך את הקשר בין התוכן הפנולי ליכולות נוגדות החמצון.

תוצאות

טבלה 2 מציגה את החומצות הפנוליות שזוהו בדגנים ובגרגרי הקטניות. בהתבסס על סטנדרטים אותנטיים זמינים, ארבע חומצות פנוליות זוהו בדגימות והן: חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרוליות. חומצה ונילית היא חומצה הידרוקסיבנזואית ואילו שלוש האחרות הן חומצות הידרוקסיצינמיות. חומצה וניל...

Discussion

הדגנים המלאים נבחרו כדגני דגנים וקטניות מייצגים שמוצאים שימושים נרחבים במזון ברחבי העולם. בעוד ששינויים עשויים להתקיים בין זנים של כל גרגר, מוקד המחקר הזה היה להדגים שיטה כללית למיצוי ואנליזה של חומצה פנולית בחינם עבור דגנים מלאים. שיטת המיצוי שונתה על ידי הפחתה משמעותית של כמויות הדגימו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	05-527-90
2 mL Amber glass ID Surestop vial	Thermo Scientific	C5000-2W
2 mL Amber microcentrifuge tubes	VWR	20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)	Sigma-Aldrich	440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%,	Sigma Aldrich	A1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)	Sigma Aldrich	D913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98%	Fluka Chemika	56510
9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps	Thermo Scientific	60180-670
96 well flat bottom plates	Fisher Scientific	12565501
Agilent BioTek ELx800 microplate reader	Fisher Scientific	BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System	Fisher Scientific	N/A
Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader	Fisher Scientific	N/A
Analytical balance SI-114	Denver Instrument	SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus	Waters	WAT078900
BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip	BD	309657
Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510	Millipore Sigma	Z245143
Corning LSE Vortex Mixer	Corning	6775
Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane)	Merck Millipore Ltd	HVLP04700
Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV)	Merck Millipore Ltd	HVHP04700
Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL	Eppendorf	3123000071
Eppendorf Research plus, 100-1000 µL	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research plus, 10-100 µL	Eppendorf	3123000047
Ethyl acetate, HPLC grade	Fisher Chemical	E195-4
Ferulic acid standard	Sigma Aldrich	128708-5G
Fluorescein	Fisher Scientific	AC119245000
Folin & Ciocalteu phenol reagent	Sigma Aldrich	F9252
Formic acid, 99%	Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a	27048-0010
Gallic acid standard	Sigma	G7384
High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695	Waters	960402
Methanol, HPLC grade	Fisher Chemical	A452-4
Micro pipet tips, 0.5-10 µL	Fisherbrand	21-197-2F
Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge	Thermo Scientific	75002435
Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL	Sartorius	728240
Photodiode array detector, Waters 2996	Waters	720000350EN
Pipet tips, 1000 µL	VWR	83007-382
Pipet tips, 1-5 mL	VWR	82018-840
Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0%	Sigma Aldrich	216224-100G
Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4)	Fisher Scientific	P288-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-500
PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom	Corning	4321-250
Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ	Thermo Scientific	17326-103030
Roto evaporator, IKA RV 10	IKA	0010005185
Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous	Fisher Chemical	S263-1
Sodium chloride (NaCl)	Mallinckrodt AR®	7581
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)	Fisher Scientific	BP332-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4)	Fisher bioreagents	BP329-500
Standardization pipet tips 0-200µL	Fisherbrand	02-681-134
Syringe Driven Filter unit (0.22 µm)	Millex®-GV	SLGVR04NL
Target micro-serts vial insert (400 µL)	Thermo Scientific	C4011-631
Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump)	Millipore	ZRQSVP030