בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.

Abstract

בידול והתבגרות של megakaryocytes להתרחש בשיתוף הדוק עם הרכיבים התאיים והחוץ תאיים של מח העצם. תהליכים אלה מאופיינים בהופעה הדרגתית של מבנים חיוניים בציטופלסמה של מגהקריוציטים כגון גרעין פוליפלואידי ופוליבולוס, רשת ממברנות פנימית הנקראת מערכת קרום תיחום (DMS) וגרגרי אלפא צפופים ואלפא שיימצאו בטסיות דם במחזור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי למחקר אולטרה-מבני של מקרונים מורין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), המאפשר זיהוי של מאפיינים מרכזיים המגדירים את שלב ההתבגרות שלהם ואת הצפיפות התאית במח העצם. מח העצם הוא סמוק, קבוע, מיובש באתנול, מוטבע שרף פלסטיק, ומותקן ליצירת חתך. חלקים דקים ודקים למחצה מוכנים לתצפיות היסתולוגיות ו- TEM, בהתאמה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל תא מח עצם, בכל מתקן EM ויש לו את היתרון של שימוש בגדלים מדגם קטן המאפשר שילוב של מספר גישות הדמיה על אותו עכבר.

Introduction

Megakaryocytes הם תאים פוליפלואידים גדולים מיוחדים, מקומי במח העצם, אחראי על ייצור טסיות דם¹. מקורם בתאי גזע hematopoietic באמצעות תהליך התבגרות מורכב, שבמהלכו מבשרי megakaryocyte גדלים בהדרגה, תוך כדי שינויים מורפולוגיים בו זמנית נרחבים בציטופלסמה ובגרעין². במהלך ההבשלה, megakaryocytes לפתח מספר אלמנטים מבניים בולטים כולל: גרעין polylobulated, פולשים של קרום פני השטח היוצרים את מערכת קרום התיחום (DMS), אזור היקפי נטול אברונים מוקף רשת cytos שלד מבוסס actin, אברונים רבים כולל α-גרגירים, גרגירים צפופים, ליזוזומים, ומתחמי Golgi מרובים. ברמה האולטרה-מבנית, שינוי משמעותי שנצפה הוא המידור הציטופלסמי לאזורים נפרדים המופרדים על ידי DMS³. אספקה נרחבת זו של ממברנות תדלק את הרחבת התהליכים הציטופלסמיים הארוכים בשלב הראשוני של ייצור טסיות הדם, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך טסיות בתוך מחזור הדם. כל פגם במהלך בידול megakaryocyte והתבגרות יכול להשפיע על ייצור טסיות דם במונחים של ספירת טסיות דם ו /או פונקציית טסיות דם.

מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת שכבה דקה (TEM) הייתה גישת ההדמיה של בחירה במשך עשרות שנים ומספקת אולטרה-מבנה באיכות גבוהה של מגהקריוציטים שעיצבו את הבנתנו את הפיזיולוגיה של תרומבוזיס^4,5. מאמר זה מתמקד בשיטת TEM מתוקננת המאפשרת ללכוד את תהליך ביוגנזה טסיות הדם המתרחשות במקום בתוך microenvironment מח העצם המקומי, אשר יכול לשמש גם כבסיס לנתח כל סוג תא מח עצם. אנו מספקים דוגמאות אולטרה-מבניות להתפתחות של מגהקריוציטים ממבוגרים עד בוגרים לחלוטין, המרחיבים תהליכים ציטופלסמיים לתוך מיקרו-סירקולציה של^{סינוסים 6}. אנו מתארים גם הליך קל לכימות שלבי ההתבגרות השונים של המגקריוציט, המלמדים על התחדשות ויכולת ייצור טסיות הדם של מח העצם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). הפרוטוקול מוצג באופן סכמטי באיור 1.

1. איסוף מח עצם קיבעון ( איור 1A)

זהירות: הליך זה כולל חומרים מסרטנים, מוטגניים ו/או רעילים ומבוצע תחת מכסה מנוע כימי. ללבוש ציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנות.

1. הכן את הפתרון הקיבוטורי המורכב 2.5% glutaraldehyde במאגר קקודילאט (ראה קובץ משלים).
2. אוסף מח עצם
   1. השתמש עכברי C57BL/6 בוגרים של כל מין 12-18 שבועות של גיל. להרדים את העכברים על ידי חנק CO₂ ונקע צוואר הרחם.
   2. עם זוג מספריים דקים, לחתוך את העור סביב הירך ולהשתמש פינצטה כדי לקלף את העור. הסר את הגפיים של כף היד ולאחר מכן לחתוך בין הירך לירך. לנתק את השוקה מ עצם הירך על ידי חיתוך בניסוח הברך ולהסיר רקמה דבקה על השוקה ועל עצם הירך באמצעות אזמל.
   3. הסר את האפיפיזות עם סכין גילוח חד. בעת החזקת עצם הירך עם פינצטה, השתמש מזרק 5 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט עם מחט 21 G כדי לשטוף את מוח העצם לתוך צינור 15 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט 2 מ"ל. כדי לעשות זאת, להכניס את שיפוע המחט לתוך פתח מח העצם ולאט לאט לחץ על הבוכנה עד מוח הוא גורש.
3. קיבוע מח עצם על ידי טבילה מהירה לתוך קיבוע.
   1. מיד לאחר שטיפה, להשתמש pipette פלסטיק להעביר את גליל מח העצם לתוך 1 מ"ל של פתרון קיבוע glutaraldehyde טרי (שהוכן בעבר 1.1) במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: כדי לשמר את הרקמה, ודא כי התהליך כולו, מ ניתוח עצם לשלב הקיבעון, הושלם בתוך פחות מ -10 דקות. עבור הקיבעון, ודא כי הפתרון הקיבוינטיבי הוא בטמפרטורת החדר כדי למנוע הלם חום.

2. הטמעת מח עצם באגרוז

הערה: רקמת מח עצם אינה מגובשת מספיק כדי לשמור על שלמותה במהלך שלבי הכביסה השונים והחומר יכול ללכת לאיבוד בקלות. כדי להתגבר על בעיה זו, מח העצם מכוסה בג'ל אגר לפני התייבשות.

1. הכן את פתרון אגרוז כמתואר בקובץ המשלים.
2. לשטוף את מח העצם הקבוע מסעיף 1.3 במאגר קקודילט ולהעביר אותו בזהירות למגלשת זכוכית באמצעות pipette פלסטיק. באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גליל מח העצם.
   הערה: אגר מתמצק במהירות בעת קירור. כדי להבטיח כיסוי הומוגני של מח העצם, יש לשמור על פתרון אגר חם עד שהוא מופקד על המגלשה.
3. מניחים במהירות את המגלשה במהירות על הקרח עד שהאגר מתמצק (1-2 דקות).
4. תחת מיקרוסקופ, השתמש בסכין גילוח חדה כדי לחתוך ולהשליך את הגפיים של גליל מח העצם בגלל דחיסת רקמות אפשרית באזורים אלה. העבר את בלוקי מח העצם בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של חוצץ קקודילאט.

3. הטמעת מח עצם בשרף

זהירות: רכיבי שרף רעילים; חלקם מסרטנים ויש לטפל בהם בזהירות תחת מכסה מנוע מיצוי כימי. יש להשתמש בציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנה. אוסמיום tetroxide הוא נדיף מאוד בטמפרטורת החדר והאדים שלה מזיקים מאוד לעיניים, לאף ולגרון. לפני שהושלך, 2% osmium tetroxide חייב להיות מנוטרל על ידי הוספת כפול נפח שמן צמחי שלה.

1. הכן את שרף אפוקסי כמתואר בקובץ המשלים.
2. הטבעת שרף
   הערה: שמור את הדגימות באותם צינורות microcentrifuge במהלך דגירה באמבטיות רצופות של אוסמיום, אצטט אורניל ואתנול. שאפו את אנטנטי העל עם פיפטת פסטר. נפח הפתרון המשמש עבור כל אמבטיה חייב להיות שווה לפחות פי 10 מנפח המדגם.
   1. לאחר לתקן את הבלוקים עם 1% אוסמיום במאגר קקודילאט עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F), לשטוף פעם אחת במאגר קקודילציה ולאחר מכן פעם במים מזוקקים.
   2. כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך שעה אחד, לשטוף פעמיים במים מזוקקים.
   3. להתייבש דרך סדרה מדורגת של אתנול במים מזוקקים: 4 פעמים ב 75% אתנול במשך 5 דקות, ואחריו 3 פעמים ב 95% אתנול במשך 20 דקות ולאחר מכן 3 פעמים ב 100% אתנול במשך 20 דקות. בשלב זה, להוציא מזרק אחד של שרף אפוקסי מהמקפיא.
      הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה ב 100% אתנול במשך 1 שעה.
   4. כדי להשיג חדירה אחידה פילמור של שרף אפוקסי בתוך מח העצם, דגירה תחילה בלוקים ב 2 אמבטיות רצופות של תחמוצת פרופילן במשך 15 דקות.
   5. מוסיפים תערובת 1:1 של תחמוצת פרופילן 100% ושרף אפוקסי ודגרה במשך שעה אחת. מניחים את הדגימות על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורת החדר.
   6. מוסיפים 100% שרף אפוקסי להשאיר את המדגם עבור דגירה לילה תחת תסיסה.
   7. מוסיפים 100% שרף אפוקסי לדגירה של 2 שעות, עדיין תחת עצבנות.
   8. תחת מיקרוסקופ, מניחים את גושי מח העצם לתוך תבניות סיליקון שטוחות. כוון דגימות כדי לאפשר חתך רוחבי עוקב של מח העצם כולו. ממלאים את התבניות בשרף אפוקסי ומניחים אותן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
      הערה: כל הפתרונות (למעט אתנול ותחמוצת פרופילן) מסוננים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום דגימות. כדי להבטיח פילמור נאות של שרף, להימנע בועות בעת מילוי התבניות.

4. חתך אולטרה-דק (איור 1B)

הערה: שידור EM דורש מקטעי רקמות דקות שדרכם אלקטרונים יכולים לעבור יצירת תמונת הקרנה של פנים התאים, המבנה, וארגון של אברונים פנימיים (גרגירים, רטיקולום אנדופלסמי, Golgi) ואת הסידור של קרום התא התא התאי.

1. הר את בלוק המדגם בתמיכה אולטרה-מיקרוטומית. שים את זה על מחזיק הדגימה. חותכים את הדגימות ב 45° על מנת להסיר את עודף השרף סביב הרקמה עם יהלום מסתובב או חותך טונגסטן כרסום.
2. הר את הדגימות על ultramicrotome עם להב סכין יהלום מצויד במיכל מים. חתוך מקטעים רוחביים של 500 ננומטר ועובי של 100 ננומטר עבור ניתוחים היסתולוגיים ו- TEM, בהתאמה. לאסוף קטעים צפים על פני המים עם לולאה.
3. הפקד את החלק בעובי 500 ננומטר על מגלשת זכוכית וחלקים בעובי 100 ננומטר על רשתות נחושת 200 רשת דק-בר עם מסנן נייר מתחת. הכן חמש רשתות לתנאי אחד: הכתים שתי רשתות תחילה ושמור על שלוש הרשתות הנותרות כגיבוי במידת הצורך.

5. תכתם כחול טולואידין להיסתולוגיה

הערה: מקטעי הכתמה עבור היסתולוגיה חשוב משלוש סיבות: 1) כדי לוודא כי הרקמה נחתכת למעשה ולא את השרף, 2) כדי לבדוק את איכות ההכללה, ו 3) כדי להעריך במהירות את דגימת מח העצם. אם זה לא נכון, לחתוך עמוק יותר בבלוק.

1. יבש את החלקים הדקים למחצה להחליק על צלחת חום (60 °C (60 °C ).
2. הוסף מסנן 1% טולואידין כחול / 1 % נתרן בוראט במים מזוקקים על המגלשות וחום על צלחת חמה (60 °C )C) במשך 1-2 דקות. לשטוף את המגלשות עם מים מזוקקים ולתת לו להתייבש על צלחת החום.
3. הרכבה של מקטעים על כיסויים עם טיפה של פולי (בוטיל מתקליט-שותף-מתיל מת'קרילט) הרכבה בינונית ובוחנת תחת מיקרוסקופ אור.

6. כתמי מתכת כבדה לתצפית TEM (איור 1C)

הערה: עבור הניגודיות, הצד העליון של הרשתות הפוכים על 100 טיפות μL של כל אמבטיה רצופה עם לולאה. לפני השימוש, כל פתרון מסונן ב- 0.22 מיקרומטר. הסר את עודף הנוזל בין כל אמבטיה על ידי מגע עדין בצד הרשת על נייר מסנן.

1. כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך 5 דקות.
2. לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
3. כתם עם ציטוט עופרת במשך 3 דקות.
4. לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
5. הפקד את הרשתות בצד התחתון במגע עם נייר המסנן כדי לאפשר להם להתייבש.
   הערה: מתכות כבדות מגיבות בנוכחות פחמן דו חמצני. כדי למזער את המשקעים, הימנעו מהתזוזת אוויר במהלך הניגודיות, אל תדברו, שמרו על הסביבה רגועה וכבה את המזגן.

7. טמ (איור 1E)

הערה: המקטעים מוצגים במיקרוסקופ TEM ונבדקים ב- 120 kV.

1. ראשית לבחון את הסעיפים בהגדלה נמוכה (< 500x) כדי להעריך את ההיבט הכללי של ההכנה (היעדר חור בשרף, קפלים / דחיסה בקטעים, משקעים עקב כתמים).
2. לאחר מכן לבחון את הסעיפים בהגדלה גבוהה יותר (~ 2000x המאפשר להבחין בין שלב ההתבגרות). ספירה ידנית של המגקריוציטים מכל שלב של התבגרות על-פני מקטעים רוחביים שלמים (ראה תוצאות מייצגות כיצד לזהות חזותית כל שלב).
   הערה: כל ריבוע של הרשתות מוגדר כאזור לבדיקה (השווה ל- 16000 מיקרומטר2 עבור 200 רשתות נחושת רשת).
3. כדי להעריך את מספר המגקריוציטים, לכמת רק את הריבועים המכוסים במלואם במקטע. כדי לעשות זאת, השתמש במודל המבוסס על הקרנת טווחים. צפה בטווח הראשון של ריבועים מקיצוניות של המקטע למשנהו, ואז טווח אחר באותו אופן, וכו '. באמצעות הליך זה, לסנן באופן מלא ושיטתי את כל מח העצם רוחבי קטע מרובע אחר ריבוע.
4. עבור כל ריבוע, הבקיעו את מספר המגקריוציטים שלב I, II או III.
   הערה: הגדלות גבוהות יותר נדרשות כדי לנתח את הגרגרים, ארגון DMS, את גודל השטחים הציטופלסמיים ואת הגרעין polylobulated.

תוצאות

היסתולוגיה של מח עצם
התבוננות בהיסתולוגיה הכחולה של מח העצם תחת מיקרוסקופ אור היא המפתח לנתח במהירות את ארכיטקטורת הרקמות הכוללת במונחים של למשל, דחיסות רקמות, המשכיות מיקרו-בסל, וגודלם וצורה של מגה-קריוציטים (איור 1D). זה מבוצע לפני קטעים ultrathin כדי לקבוע...

Discussion

בדיקה ישירה של megakaryocytes בסביבתם הטבעית חיונית כדי להבין megakaryopoiesis היווצרות טסיות דם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור המשלבת שטיפה של מח עצם קיבעון על ידי טבילה, ומאפשר לנתח במקום את המאפיינים המורפולוגיים של כל התהליך של מורפוגנזה מגהקריוציט המתרחש במח העצם.

<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620