בדיקת סינון תרופות ורדיותרפיה בתפוקה בינונית באמצעות אורגנואידים שמקורם במטופל

Summary

אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשימוש באורגנואידים שמקורם בחולה לבדיקות רגישות לטיפול בתפוקה בינונית. הטיפולים שנבדקו כוללים כימותרפיה, הקרנות וכימותרפיה. רמות אדנוזין טריפוספט משמשות כקריאה פונקציונלית.

Abstract

מודלים של אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) מאפשרים הרחבה ותחזוקה ארוכת טווח של תאי אפיתל ראשוניים הגדלים בתלת מימד ובמצב כמעט טבעי. כאשר הם נגזרים מרקמת גידול שנכרתה או ביופסיה, אורגנואידים מסכמים מקרוב את מורפולוגיה הגידול in vivo וניתן להשתמש בהם כדי לחקור את תגובת הטיפול במבחנה. הבנקים הביולוגיים של אורגנואידים של גידולים משקפים את המגוון העצום של גידולים קליניים וחולים ולכן טומנים בחובם הבטחה גדולה ליישומים פרה-קליניים וקליניים. מאמר זה מציג שיטה לסינון תרופות בתפוקה בינונית באמצעות קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר ואורגנואידים של אדנוקרצינומה של המעי הגס. ניתן לאמץ גישה זו בקלות לשימוש עם כל מודל אורגנואיד שמקורו ברקמות, נורמלי וחולה כאחד. מתוארות שיטות לחשיפה חוץ גופית של אורגנואידים לכימותרפיה והקרנות (כשיטת טיפול יחיד או בשילוב). הישרדות התאים לאחר 5 ימים של חשיפה לתרופות מוערכת על ידי מדידת רמות אדנוזין טריפוספט (ATP). רגישות לתרופות נמדדת על ידי ריכוז מעכב חצי מקסימלי (IC₅₀), שטח מתחת לעקומה (AUC) וקצב גדילה (GR). פרמטרים אלה יכולים לספק תובנה האם תרבית אורגנואידים נחשבת רגישה או עמידה לטיפול מסוים.

Introduction

מודלים אורגנואידים שהוקמו מתאי גזע בוגרים וגדלו במטריצה חוץ-תאית תלת מימדית (3D) (ECM) וקוקטייל גורם גדילה ספציפי (הידוע גם בשם HUB Organoids) צוברים אחיזה כפלטפורמות סינון אונקולוגיות פרה-קליניות. ניתן לקבוע תרביות אורגנואידים שמקורן בחולה (PDO) הן מביופסיות רקמה תקינות והן מביופסיות רקמות חולות תוך 1-2 שבועות וניתן להרחיב אותן למשך 1-2 חודשים לפחות עד לטווחי זמן בלתי מוגבלים. שימור בהקפאה מאפשר שימוש ארוך טווח בתרבויות מאופיינות היטב. בניגוד למודלים מסורתיים של קו תאים דו-ממדי הנגזרים באופן משובט, מודלים של PDO מסכמים מקרוב את רקמת הגידול המקורית, הן מבחינה פנוטיפית והן מבחינה גנטית, ושומרים על הטרוגניות הגידול. מסכי תרופות בתפוקה בינונית ב-PDOs, הבודקים מגוון רחב של טיפולים, מספקים פלטפורמה ייחודית לרפואה מותאמת אישית.

מחקרים קודמים תיארו את השימוש במודלים אורגנואידים לסינון טיפול, במיוחד תרופות והקרנות, במודלים שהוקמו מסוגים שונים של גידולים ומראים את פוטנציאל החיזוי של אורגנואידים להנחות קבלת החלטות קליניות 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . מאמר זה מתאר את השיטות של סינון טיפול אונקולוגי באמצעות PDOs בקיבולת תפוקה בינונית (איור 1A). פרוטוקול זה מוגדר בפורמט צלחת של 384 בארות עם אוטומציה למחצה, המאפשרת בדיקת טיפול עבור עד שמונה דגמי אורגנואידים, 16 תרכובות ועד שמונה צלחות של 384 בארות. מלבד מסכי תרופות מורכבות, מאמר זה מתאר גם שיטות לבדיקת רגישות ורגישות לרדיותרפיה. יתר על כן, נדון השימוש ברובוטיקה בעלת תפוקה גבוהה כדי לשדרג את מסך התרופות לאוטומציה מלאה. חשוב לציין, אורגנואידים מרקמות שונות עשויים לדרוש מדיה שונה וטיפול שונה.

כאן, מתואר פרוטוקול בדיקת סינון תרופות כללי, שעשוי להזדקק להתאמה בהתאם לאורגנואיד המעניין. נקודות התחלה והצעות לאופטימיזציה כלולות בדיון, כמו גם המלצות כלליות לגבי הגדרת ניסויים ותרגול אורגנואידים. דוגמאות ניתנות באמצעות אורגנואידים של קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC), שיש להם בדרך כלל מורפולוגיה צפופה, ואורגנואידים של סרטן המעי הגס (CRC) שיכולים להיות בעלי מורפולוגיה ציסטית או צפופה. שימו לב ששיטות תרבית ראשוניות של הקמה והרחבה של אורגנואידים אינן מכוסות בפרוטוקול זה; עבור טכניקות אורגנואידים בסיסיות, על הקורא להתייחס לפרוטוקולים אחרים (למשל, ¹²). פרוטוקול חזותי זה יספק תובנה לגבי תהליך סינון תרופות בתפוקה בינונית באמצעות מודלים אורגנואידים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: לפני השימוש בפרוטוקול זה, אנא ודא כי ההנחיות של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסד מתבצעות. איסוף רקמות המטופל והנתונים המתוארים בפרוטוקול זה בוצע בהתאם להנחיות EUREC ובהתאם לחוק האירופי, הלאומי והמקומי. כל האורגנואידים הופקו ממטופלים בהסכמה, וניתן לבטל את ההסכמה בכל עת.

1. לפני ההקרנה

1. לאשר את זהותם של מודלים חדשים שהוקמו (למשל, על ידי היסטולוגיה ו/או ריצוף DNA 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11) כדי לשלול את האפשרות של צמיחת יתר תקינה של תאים, ולוודא שבדיקת התרופה מבוצעת על תרביות אורגנואידים של גידול (ראה דוגמה ב איור 2D).
2. תכנן את מערך לוחית הניסוי, תוך שימוש בהמלצות הכלליות שניתנו בסעיף הדיון (ראה דוגמה באיור משלים S1).
3. חשב את המספר הנדרש של אורגנואידים, והכן מספיק אורגנואידים מוכנים לפיצול ביום 0 (השתמש בטבלה 1 כהפניה).
   הערה: בהתאם ל-GR של סוג האורגנואיד והדגם, נדרשות כ-1-2 צלחות מלאות של 6 בארות עבור כל לוחית הקרנה מלאה של 384 בארות. כקו מנחה, באר אחת מלאה של צלחת של 6 בארות מכילה ±20,000 אורגנואידים ציסטיים או עד 50,000 אורגנואידים צפופים/דמויי ענבים.
4. בדוק אם מתקן התאים מכויל באמצעות צבע מדווח, וכיול בהתאם לפרוטוקול היצרן במידת הצורך.

2. הכנת ריאגנטים

1. הכן את מדיום הבסיס: DMEM/F12+++ מתקדם (aDF+++). הוסף 5 מ"ל כל אחד של 1x תחליף L-גלוטמין (v/v), 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethanesulfonic acid (HEPES) ו-100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין לבקבוק של 500 מ"ל של DMEM/F12 מתקדם. יש לשמור על aDF+++ בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
2. הכן את מדיום הרחבת האורגנואיד המתאים (כלומר, גדילה) לסוג האורגנואיד בשימוש ^9,10.
3. הכן את אמצעי ההקרנה, שיכול להיות שונה ממדיום ההרחבה בהתאם למערך הניסוי. כדי לסייע בהחלמה לאחר הוצאת האורגנואידים, הוסף 5 מיקרומטר של מעכב Rho kinase (ROCK) (Y-27632) למדיום ההקרנה.
4. הכן תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל של Dispase II ב-aDF+++.
   הערה: תמיסה של פי 100 של הדיספאזה יציבה ב-20 מעלות צלזיוס למשך חודשיים.

3. יום 0: הכנת אורגנואידים

הערה: הנפחים המצוינים להלן מתחילים מצלחת אורגנואידים מלאה של 6 בארות, שווה ערך ל-1200 מיקרוליטר אורגנואידים/ECM (200 מיקרוליטר אורגנואידים/ECM לבאר).

1. בדוק אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר לאיתור זיהום אפשרי, צפיפות ומראה כללי; צלם תמונות של כל הדגמים לעיון לפני המעבר.
2. העבירו את האורגנואידים והזרעים לפי השלבים הבאים. בצע שלבים אלה בטמפרטורת החדר כדי להפחית את תנודות טמפרטורת האורגנואידים. בכל פעם שאתה מטפל בתרחיפים אורגנואידים, השתמש בקצוות בעלי אחיזה נמוכה או בצנרת ופלסטיק רטובים מראש כדי למנוע אובדן אורגנואידים.
   1. בעת שימוש בכמויות גדולות יותר של ECM/אורגנואידים (>1200 מיקרוליטר של ECM), שקול עיכול ECM עם dispase כדלקמן כדי לסייע בהסרת אורגנואידים מה-ECM.
      הערה: Dispase מפרק את ה-ECM, אך אינו משפיע על האורגנואידים.
      1. אופציונלי: יש להוסיף 1 מ"ג/מ"ל דיספאז לכל באר, ולדגור את האורגנואידים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני המעבר כרגיל.
         הערה: מכיוון שהדיספאז אינו מושבת על ידי רכיבים בינוניים, שטוף אותו (באמצעות aDF+++) עם לפחות פי 20 מנפח הדיספאזה שנוסף.
   2. אסוף את האורגנואידים בשלושה צינורות של 15 מ"ל (עד 400 מיקרוליטר ECM לכל צינור). מלאו עד 12 מ"ל עם aDF+++, וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-RT ב-85 × גרם. אם כדורים כראוי, שאפו את הסופרנטנט. אם האורגנואידים לא גלו בבירור, צנטריפוגה במהירות גבוהה יותר (עד 450 × גרם; תלוי בסוג האורגנואיד וגודלו) למשך 5 דקות נוספות. השעו מחדש את הגלולה וחזרו על הכביסה.
      הערה: שכבה דמוית זכוכית מעל הגלולה מעידה על נוכחות של ECM. בדוק שאין אורגנואידים כלואים ב-ECM באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מספר נמוך של אורגנואידים לכודים עשוי להיות מקובל), והסר בזהירות את ה-ECM הנותר עם פיפט p1000. אם (מדי) קיימים אורגנואידים רבים ב-ECM, חזור על שלב הדיסוציאציה של הדיסוציאציה, או שטוף את הכדור וסובב במהירות גבוהה יותר (מקסימום 450 × גרם).
   3. עבור כל צינור של 15 מ"ל, השעו מחדש את הגלולה האורגנואידית ב-1 מ"ל של aDF+++, ונתקו בזהירות את האורגנואידים עד שהם הגיעו לגודל הנכון. השתמש בשיטת הדיסוציאציה המשמשת לפיצול רגיל, בהתאם לסוג/מורפולוגיה (טבלה 1).
      1. במקרה של אורגנואידים ציסטיים ודמויי ענבים, יש לשבש אותם מכנית, לגזור אותם לשברים קטנים (<100 מיקרומטר) על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם p1000 עם קצה p2 למעלה, או עם צינור פסטר מזכוכית רטובה מראש שקצהו הצטמצם בלהבה.
         הערה: אשר שיבוש אורגנואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר פיפטינג למעלה ולמטה כל 5 פעמים, במטרה שהאורגנואידים יהיו קטנים או בטווח הגודל של המסך (טבלה 1).
      2. עבור אורגנואידים צפופים, הוסף 1 מ"ל של תמיסה של 50% v/v של TrypLE ב-aDF+++ כדי להשעות מחדש את גלולת התא, ולדגור למשך 2 דקות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, נער את הצינור במרץ למעלה ולמטה ובדוק תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. באותה גישה כמו לעיל, משבשים מכנית אורגנואידים בעזרת פיפט, בודקים תחת המיקרוסקופ כל הזמן לאורך כל התהליך. עבור אורגנואידים HNSCC, דגרו בתמיסה של 100% של ה-TrypLE למשך 5 דקות.
         הערה: בהתאם לסוג התרבית, שאפו להגיע לקבוצות קטנות של תאים (למשל, אורגנואידים CRC, >20 מיקרומטר) או תאים בודדים (למשל, אורגנואידים HNSCC). ודא שהדגירה הפרוטאוליטית לא תעלה על 15 דקות מכיוון שהדבר עלול להשפיע על כדאיות האורגנואידים.
   4. שוטפים את האורגנואידים עם 10 מ"ל aDF+++. סובב את האורגנואידים בחום של 85 × גרם למשך 5 דקות; שאפו את הסופרנטנט אם כדורים כראוי. לחלופין, אם קשה לגלול את האורגנואידים, צנטריפוגה עד 450 × גרם למשך 5 דקות.
   5. אורגנואידים זרעים בצפיפות גבוהה במדיום התפשטות של 50% / 50% ECM (המאפשר הסרה קלה מ-ECM בסעיף 4). כוונו לצפיפות כפולה בקירוב בהשוואה לפיצול רגיל, מה שמוביל לעתים קרובות לפיצול של 1:1 (ראה דוגמאות באיור 1). זרעי אורגנואידים בטיפות של 10 מיקרוליטר (סה"כ 200 מיקרוליטר לבאר) של צלחת 6 בארות מחוממת מראש.
      הערה: שמור צלחות מחוממות מראש בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות כדי להבטיח התמצקות מהירה של ה-ECM, למנוע התפשטות ECM ובכך להבטיח היווצרות תקינה של כיפת חצי הכדור.
   6. הפוך את הצלחת והחזיר אותה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר
   ה-ECM להגדיר. לאחר 30-60 דקות, הוסיפו בעדינות את אמצעי ההרחבה (טמפרטורת החדר) לבארות.

4. יום 2 (טווח: ימים 1 - 3): חלוקת אורגנואידים

הערה: בהתאם ל-GR האורגנואידי, זה יכול להתרחש גם ביום 1 או 3. לאורך כל בדיקת התרופות, האורגנואידים נשמרים בתרחיף. לשם כך הם מחולקים בריכוז נמוך של ECM (5-10%) בו נשמרת צמיחת האורגנואידים, אך במקום בו לא מתרחשת התמצקות של ה- ECM. זה מאפשר חלוקה אוטומטית, אינטראקציה אופטימלית בין אורגנואידים לתרכובות וליזיס תאים הניתן לשחזור, אך גם מגביל את ההזדמנות לשנות את המדיום.

1. חשב את הריכוז והכמות של תרחיף האורגנואידים הנדרשים למסך התרופות.
   1. בהתאם למתקן התאים בו נעשה שימוש, שקול את הנפח המת במהלך החישוב.
      הערה: כאשר מחלקים 40 מיקרוליטר של תרחיף אורגנואיד לבאר, צלחת אחת של 384 דורשת נפח כולל של 15.4 מ"ל. בממוצע, לכל צינור חלוקת תאים Multidrop יש נפח מת של ~1 מ"ל, וכתוצאה מכך 8 מ"ל של נפח מת בעת שימוש בכל החרירים. התוצאה היא סך של 23.4 מ"ל עבור כל מודל אורגנואיד עבור צלחת שלמה של 384 בארות. הכנת 25 מ"ל של תרחיף אורגנואיד מבטיחה אפוא מספיק אורגנואידים לחלוקת פלוס לניתוח מעקב אופציונלי (פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד, SNP) (ראה 4.4.7).
2. הכנה לאיסוף אורגנואידים
   1. כדי להכין את מאגר הכביסה, הוסף מעכב ROCK (Y-27632) ל-aDF+++ לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. (נדרש ±100 מ"ל לכל תרבית אורגנואידים שתוקרן).
   2. בדוק את האורגנואידים בכל הבארות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את התאוששות האורגנואידים לאחר המעבר וכדי לשלול זיהומים פוטנציאליים. בדקו אם האורגנואידים בגודל הנכון על ידי צילום תמונה מיקרוסקופית ומדידת האורגנואידים באמצעות סרגל קנה מידה דיגיטלי (טבלה 1).
      הערה: אם האורגנואידים אינם בגודל הנכון (גדולים מדי או קטנים מדי), הם יאבדו בתהליך הסינון, וייתכן שלא יהיה מספיק חומר כדי לבצע את בדיקת התרופה. אם זה המקרה, מומלץ לדחות את בדיקת התרופות.
   3. יש להוסיף 1 מ"ג/מ"ל דיספאז לכל באר, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 30-60 דקות (עד 120 דקות לכל היותר) כדי לעכל את ה-ECM. בדוק את התקדמות הדיסוציאציה של ECM תחת המיקרוסקופ כדי לראות אם טיפות ה-ECM צפות. אם לא, צנרת את תכולת הבאר מעל טיפות ה- ECM, שאמורות לרדת בקלות בסיום העיכול.
3. הכן את האורגנואידים לחלוקה לצלחת של 384 בארות לפי השלבים הבאים. בצע שלבים אלה בטמפרטורת החדר (כולל צנטריפוגה) כדי להפחית את תנודות טמפרטורת האורגנואידים.
   1. אוספים את התרחיף האורגנואיד מצלחת התרבות באמצעות פיפט p1000.
   2. בהתאם לשלבי הסינון הנדרשים (בהתאם לסוג האורגנואיד, ראה טבלה 1), בצע את השלב המתאים.
      הערה: הרטבה מוקדמת של מסננים עם מאגר כביסה חיונית כדי למנוע מהאורגנואידים להיצמד למסנן.
      1. בצע סינון יחיד כאשר כוללים את כל השברים הקטנים והתאים הבודדים, למשל, עבור אורגנואידים של גידול HNSCC, סינון לאורגנואידים < 70 מיקרומטר. אוספים את האורגנואידים שנקטפו בצינור של 15 מ"ל ושוטפים אותם פעמיים עם 12 מ"ל של מאגר כביסה. מסננים את האורגנואידים על מסנן 70 מיקרומטר רטוב מראש לתוך צינור של 50 מ"ל, שוטפים את המסנן עם 3 x 4 מ"ל של aDF+++, ומעבירים אותם לצינור של 15 מ"ל. אם הנפח גבוה מדי, סובב ב-85 × גרם למשך 5 דקות, והעביר את הגלולה ב-12 מ"ל של aDF+++ לצינור של 15 מ"ל; המשך ל-4.3.3.
      2. בצע סינון כפול להסרת פסולת ואורגנואידים גדולים, למשל, עבור אורגנואידים של גידול CRC, סנן אורגנואידים של >100 מיקרומטר ו-<20 מיקרומטר. סנן מיד את האורגנואידים שנקטפו על מסנן 100/70/40 מיקרומטר רטוב מראש (טבלה 1) לתוך צינור של 50 מ"ל, ושטוף את המסנן עם 2 x 10 מ"ל של מאגר כביסה. השתמש במסנן אחד של 20 מיקרומטר רטוב מראש לכל שלוש בארות מצלחת אורגנואידים של 6 בארות. סנן את האורגנואידים של <100 מיקרומטר על מסנני 20 מיקרומטר, ושטוף את המסנן עם 2 x 10 מ"ל של מאגר כביסה. שחזר את האורגנואידים מהפילטר על ידי היפוך על גבי צינור נקי של 50 מ"ל ושטיפה עם 3 x 4 מ"ל של aDF+++. העבירו את המתלה האורגנואיד לצינור של 15 מ"ל; אם הנפח הוא >15 מ"ל (ככל שייתכן שתידרש שטיפת מסנן נוספת), סובב ב-85 × גרם למשך 5 דקות, והעביר את הגלולה ב-12 מ"ל aDF+++ לצינור של 15 מ"ל.
         הערה: ניתן לשחזר אורגנואידים שנלכדים במסנן לשימוש מאוחר יותר (מעבר); אורגנואידים < 100 מיקרומטר משמשים בשלב הבא. תאים ופסולת שעברו דרך המסנן יושלכו, אורגנואידים שנתפסו במסנן (>20 מיקרומטר, <100 מיקרומטר) משמשים להקרנה.
   3. צנטריפוגה בחום של 450 × גרם למשך 3 דקות, ושואבים בזהירות את הסופרנטנט. השעו את הגלולה בזהירות ב-1 מ"ל של מדיום סינון, מלאו במדיום נוסף של 1-9 מ"ל (תלוי בגודל הגלולה; שאפו לקבל ~75-150 אורגנואידים/10 מיקרוליטר), והשעו מחדש על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפט סרולוגי רטוב מראש.
      הערה: מומלץ להוסיף 5 מיקרומטר של מעכב ROCK למדיום ההקרנה.
   4. ערבבו היטב את תרחיף האורגנואיד על ידי פיפטינג למעלה ולמטה עם פיפט סרולוגי רטוב מראש פי 5, וספרו את מספר האורגנואידים ב-10 מיקרוליטר של התרחיף על ידי פיפטינג קו בצלחת פטרי וספירתם במיקרוסקופ. עבור אורגנואידים קטנים יותר (<70 מיקרומטר), הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף האורגנואיד לשקופית בת 10 חדרים עם רשת המוציטומטר, וספור את מספר האורגנואידים. חשב את מספר האורגנואידים/מ"ל בהתאם להוראות היצרן.
   5. הכן את הכמות הנדרשת של אמצעי חלוקה על ידי הוספת 5% (v/v) ECM למדיום הקרנה קר כקרח (למשל, עבור 25 מ"ל של מדיום חלוקה, הוסף 1.25 מ"ל של ECM ל-23.75 מ"ל של מדיום סינון קר כקרח). הוסף ECM רק למדיום קר כקרח כדי למנוע מה-ECM להתמצק. בעת סינון מודלים אורגנואידים מרובים, הכן מדיום חלוקה בכמויות גדולות כדי להבטיח עקביות של אחוז ה-ECM בכל הדגמים.
   6. הוסף את המספר הנדרש של אורגנואידים (ראה טבלה 1 להנחיות ודיון להערות) לצינור חדש של 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב-450 × גרם למשך 3 דקות. שאפו בזהירות מבלי להפריע לגלולה, והשעו היטב את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מדיום הקרנה עם פיפט p200. ודא שהגלולה הומוגנית ומושעה לחלוטין ללא גושים אורגנואידים. לאחר מכן מלאו את המתלה בכמות הנדרשת של אמצעי חלוקה קר כקרח, ושמרו את התרחיף האורגנואיד על הקרח מעתה ואילך.
4. מחלקים את האורגנואידים לצלחות של 384 בארות באמצעות מתקן תאים (למשל, Multidrop).
   1. הגדר את מתקן התאים להוציא 40 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר.
      1. תפריט ראשי | בחר סוג צלחת | אישור | 384 סטנדרטי | אוקיי
      2. קלטת צינור סטנדרטית מסוג קלטת (צד ימין) | בחר עוצמת קול באמצעות חצים למעלה ולמטה (40 μL).
      3. בחרו 'לוח מלא' או 'עמודות', בהתאם לפריסת הלוחת.
   2. שטפו את הצינור עם 70% אתנול (EtOH), ואחריו מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט (PBS); השתמש ב->15 מ"ל לכל כביסה. אפשר קצת אוויר בין כל נוזל כדי לדמיין את ההתחלה והסיום של כל כביסה. בדוק אם כל ראשי החלוקה מחלקים 'ישר', ושטוף שוב כאשר זה לא המקרה.
   3. בתפריט הגדרות , בחר הוצאה מוקדמת והגדר ל-60 מיקרוליטר כדי להוציא מראש את תרחיף האורגנואיד לאחר הפריים ולפני החלוקה.
   4. יש להניח את המתקן עם מתלה האורגנואיד תוך שמירה על המתלה על הקרח. השעו מחדש על ידי פיפטינג רציף עם פיפט p1000. היזהר להימנע מיצירת בועות אוויר בתמיסה. לאחר ההכנה והצלחת במקומה, חלק את האורגנואידים על ידי לחיצה על התחל.
      הערה: שלב זה קל יותר לביצוע עם שני אנשים: אדם אחד משהה והשני מפעיל את המתקן.
   5. במידת הצורך, עבור כל דגם אורגנואיד הכלול במסך, יש להוציא לפחות 5 בארות נוספות בלוחית סינון נוספת.
      הערה: זה יאפשר קריאה של T=0 בהמשך היום (ראה סעיף 7 ודיון). ניתן לבצע חלוקה זו גם באופן ידני אם מעדיפים.
   6. החזר מיד את המכסה על הצלחת כדי למנוע זיהום של הבארות. ודא במיקרוסקופ שכל הבארות מולאו כהלכה, ואם האורגנואידים מפוזרים באופן שווה בכל הצלחת.
   7. במידת הצורך, לאחר סיום הציפוי, שחזר את תרחיף האורגנואיד מהצינור (לחץ על ריק), וסובב את האורגנואידים הנותרים כלפי מטה. העבר לצינור של 1.5 מ"ל, והקפיא בהצמדה לניתוח SNP מאוחר יותר.
      הערה: אם אוויר נכנס לצינור במהלך החלוקה, וחלק מהבארות לא התמלאו כהלכה, מלא את הבארות באופן ידני על ידי הוספת 40 מיקרוליטר לבאר.
   8. אם מחולקים מספר דגמי אורגנואידים, שטפו את הצינור עם PBS, EtOH ו-PBS, וחזרו על שלבים 4.4.4-4.4.8 עבור כל דגם.
   9. העבירו את הצלחות לאטמוספירה של 5% CO₂ באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לחלוקת תרופות. כדי למנוע הבדלים בחילופי האוויר בין צלחות שונות, הימנע מערימת הצלחות בחממה.
   10. נקה את הצינור בהקדם האפשרי עם PBS ולאחר מכן EtOH. הקפד לייבש את הצינור לחלוטין על ידי הזרמת אוויר דרך המערכת.

5. יום 2 (טווח: ימים 1 - 3): מתן תרופות באמצעות מתקן תרופות (למשל , D300e)

הערה:. בהתאם לשאלת המחקר, הדפסת תרופות יכולה להיעשות גם יום לאחר הזריעה.

1. הגדר את מתקן התרופות
   1. הפעל את תוכנת המתקן, ובחר את פורמט הלוח הרצוי המשמש למסך על ידי הדגשת לוח 1 ובחירת כלי העיפרון כדי להעלות את עורך הלוחות.
   2. בחר את סוג הצלחת והגדר נפח נוסף של כל באר (נפח נוזל (מתלה אורגנואיד) שכבר נמצא בצלחת). לפורמט של 384 בארות, השתמש ב-40 מיקרוליטר לבאר.
   3. בסרגל השמאלי, השתמש בסמל + כדי להוסיף כל תמיסת תרופה שתשמש במסך.
   4. ערכו כל נוזל על ידי בחירת כלי העיפרון . ערוך את שם התרופה, את סוג התרופה (למשל, מבוסס DMSO או מימי (למשל, מים, PBS)), ואת ריכוז המלאי של התרופה.
      הערה: אין לחרוג מריכוז מלאי של 10 מ"מ של כל תרופה. באופן אידיאלי, הריכוז המרבי של ממס צריך להיות 0.8% עבור DMSO ו-3% עבור PBS/0.3% חומר ניקוי (למשל, טווין) (ראה נורמליזציה להלן ודיון).
   5. לאחר שכל התרופות נוספו לתוכנית, בחר את הבארות להוספת התרופות על ידי הדגשת באר בפריסת הצלחת וגרירתה לרוחבה. לחץ לחיצה ימנית על הבארות שנבחרו והוסף את הריכוז.
      1. הגדר את הערך כדי להגדיר את הריכוז הרצוי של כל תרופה (μM).
      2. עבור טיטרציה, הגדר את הריכוז הגבוה והנמוך ביותר הרצוי של כל תרופה (μM), ההתפלגות (לוגריתמית או ליניארית), שכפולים לכל רמה (למשל, 3) ודפוס הטיטרציה.
      3. עבור טיטרציה ממוקדת, הגדר את הריכוז הגבוה והנמוך ביותר של כל תרופה, ההתפלגות (לוגריתמית או ליניארית), ריכוז המטרה (מיקרומטר), אזור היעד (רמות), טווח המטרה (לוג), שכפולים לכל רמה (למשל, 3) ודפוס הטיטרציה.
   6. לנרמל את כל בארות התרופות לממס המתאים שלהן (למשל, DMSO או מימי + Tween-20). עבור תרופות המומסות בתמיסות מימיות, הוסף Tween-20 (ריכוז סופי של 0.3% במלאי התרופות) כדי להבטיח מתח פנים מתאים של תמיסת התרופה לחלוקה באמצעות D300e (ראה 5.2.6). בחר את כל הבארות, כולל אלה ללא תרופה (בקרות שליליות), לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני, בחר נורמליזציה ולאחר מכן נורמליזציה. בחר את הממס המתאים, ובחר נרמל לנפח הכיתה הגבוה ביותר כדי לנרמל לריכוז הגבוה ביותר של התרופה שנבחרה.
      הערה: משולשים שחורים מופיעים כעת בפינה השמאלית התחתונה של כל באר כדי לאשר את הנורמליזציה. שאפו שיהיו מינימום של 6 (באופן אידיאלי >9) בארות בקרה שליליות עבור כל ממס תרופה בשימוש.
   7. בחר מינימום של 3 בארות (באופן אידיאלי >6) כדי להשתמש בריאגנטים ציטוטוקסיים ידועים כגון סטאורוספורין כבקרות חיוביות (1-5 מיקרומטר) בהתאם לתרבויות. אם הריכוז הציטוטוקסי של הבקרה החיובית אינו ידוע, בחר בריכוז גבוה כדי להרוג את כל האורגנואידים בבארות הבקרה החיוביות.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בנביטוקלקס (20 מיקרומטר) כדי להבטיח מוות אורגנואיד במהלך בדיקת התרופה.
   8. לאחר השלמת פריסת הצלחת, בחר הפעל (אם המכונה מופעלת) בפינה השמאלית העליונה. שמור את הפרוטוקול כדי להמשיך.
      הערה: התוכנית חישבה כעת את הנפח הנדרש של כל תרופה לחלוקה. מכיוון שזה כולל שגיאת פיפטינג, זו הכמות המדויקת של התרופה הדרושה לכל הפרוטוקול. אופציונלי: בחירה ב-Simulate תבצע הדמיה של הפרוטוקול כולו (מבלי להוסיף תרופות) כדי לראות כיצד הפרוטוקול יפעל. הן במצב הפעלה והן במצב סימולציה , נוצר דוח שיתעד את הזמן, הסדר והנפחים של התרופות שנוספו לכל באר. זה יכול להיות שימושי כדי להבטיח שהפרוטוקול נכון וכדי לקבוע את הנפח והמספר המדויקים של קלטות שיידרשו לפני שתמשיך בניסוי.
2. הכנה והדפסה של תרופות
   1. הוסף 0.3% (v/v) Tween-20 למלאי תרופות מימי (למשל, מים או PBS) כדי להבטיח מתח פנים מתאים של תמיסת התרופה לחלוקה באמצעות D300e. ודא שריכוז Tween-20 אינו עולה על 3% PBS/0.3% Tween-20 (v/v), ושמור על הריכוז הסופי של Tween-20 מתחת ל-0.01%.
      הערה: הוסף את Tween-20 למלאי התרופות רק לפני הוספתו לקלטת מדפסת התרופות, מכיוון שהריכוז הגבוה של Tween-20 במלאי עלול לנטרל תרופות (מבוססות חלבון) (למשל, תרופות מבוססות נוגדנים). שלב זה אינו נדרש עבור תרופות המומסות ב-DMSO; עם זאת, וודאו כי האחוז הסופי של DMSO בכל באר אינו עולה על 0.8-1%.
   2. הכינו גם קלטות D8+ בעוצמת קול נמוכה וגם D4+ בנפח גבוה. בדוק השתמש בקלטות בנפח גבוה בתוכנית בעת שימוש בכמויות גדולות של נוזל נורמליזציה.
   3. הפעל את הפרוטוקול כדי להתחיל לחלק את התרופות.
      הערה: התוכנית תריץ את הפרוטוקול בשלבים ותציין מתי וכמה מכל תרכובת צריך להוסיף. השתמש בטיפים לסינון לטיפול בריכוזים גבוהים של סמים. הקפד להשליך פסולת כימית וטיפים משומשים בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית.
   4. לאחר סיום הפרוטוקול, השתמש באטמים דביקים חדירים לאוויר ולנוזל (למשל, אטמי צלחות פוליאוריטן בדרגה רפואית; טבלת חומרים) כדי לכסות את הצלחות, ולהחזיר את הלוחות ל-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
      הערה: שימוש באטמים אלה מונע אידוי "אפקט קצה" (ראה דיון). אם אינך משתמש באטמים, ודא שהקצוות החיצוניים של הצלחת אינם משמשים במסך התרופות. אין לערום צלחות זו על גבי זו, ולוודא שהצלחות נשמרות לכיוון החלק האחורי של החממה, או להשתמש בחממה שאינה נפתחת (לעתים קרובות) כדי למנוע תנודות טמפרטורה.
   5. אם הקרנות משולבות עם תרופות מודפסות, המשך לסעיף 6. אם לא, השאירו את הצלחות בחממה למשך 5 ימים.
      הערה: בהתאם לסוג האורגנואיד וסוג התרופה, ניסויים מסוימים עשויים להימשך יותר מ-5 ימים. עבור ניסויים הנמשכים >7 ימים, שנה בזהירות את המדיום והתרכובות באמצע הליך הניסוי (למשל, על ידי החלפת 50% מהמדיום במדיום סינון טרי) כדי למנוע מוות תאים נרחב בבארות הבקרה השליליות.

6. יום 2 (טווח: ימים 2 - 4): טיפול באורגנואידים באמצעות קרינת קרן פוטון

הערה: השלבים הבאים מתארים הקרנה של אורגנואידים. כדי להעריך את ההשפעות הרגישות לקרינה של תרכובות תרופות, ההקרנה נעשית 24 שעות לאחר חשיפת האורגנואידים לכימותרפיה. אותו פרוטוקול משמש להערכת ההשפעות של הקרנה בלבד, שבה אורגנואידים נזרעים ומוקרנים 24 שעות לאחר הזריעה. זה עשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת בהתאם להשערה ולתרביות האורגנואידים. השלבים הבאים מתארים את התהליך המשמש להקרנת אורגנואידים באמצעות אלומות פוטון של 6 MV שנוצרו במיוחד (טבלת חומרים). מכונה זו מותאמת ליישומים קליניים ולכן משקפת פרקטיקה קלינית אמיתית. מכונות שונות עשויות לדרוש הגדרה שונה ועשויות גם לדרוש אופטימיזציה של המינון מכיוון שהמינון היעיל עשוי להיות שונה מזה שנבחר.

1. הסר את הצלחות מהחממה של 37 מעלות צלזיוס, והחזיר מכסים לכל צלחת על גבי האטמים; אל תסיר את האטמים. קח את לוחית ה-0 Gy בתהליך זה כדי להבטיח שלוחית הבקרה הייתה נתונה לתנאים זהים.
2. העבירו את האורגנואידים לרדיאטור. הגדר את מכשיר ההקרנה על ידי מילוי קופסת פלסטיק במי ברז פושרים, וקבע במחזיק הצלחת כדי למנוע מהצלחת לצוף.
3. טבלו את הצלחת במים כך שהמים יהיו בגובה המשטח העליון של הצלחת. קבע את הצלחת במקומה באמצעות מכשיר שאינו מאפשר לצלחת לצוף (כפי שמוצג בסרטון). צאו מהחדר, והקרינו את הצלחות במינונים הולכים וגדלים (למשל, 1, 2, 4, 6, 8 ו-10 Gy). הקרינו רק צלחת אחת בכל פעם, מכיוון שערימת צלחות אינה מאפשרת פיזור אחיד של קרינה.
   הערה: ודא שנבחרו מינוני הקרנה מתאימים כדי להשיג עקומת מינון-תגובה.
4. יבש היטב את הצלחות לאחר הקרנה ברקמות, והחזר את המכסה הקשיח. העבירו את הצלחות בחזרה לחדר התרבות. הסר את המכסה הקשיח ונגב את החלק החיצוני של כל צלחת ברקמות EtOH מרוססות קלות. אל תסיר את האטמים הנושמים.
5. הנח את הלוחות בחלק האחורי של החממה כדי למנוע תנודות טמפרטורה עקב פתיחת הדלת; אין לערום את הצלחות.

7. יום 2. אופציונלי: לוחית מדידה של CellTiter-Glo 3D Cell Recovery Assay (CTG) T=0 (נדרשת לניתוח GR)

1. אם שואפים לחשב מדדי GR (ראה 11.3.5 ודיון), מדוד ערכי CTG בלוחית T=0 על ידי ביצוע שלבים 9.1-10.4.

8. יום לפני קריאת בדיקת סמים: הכנה

1. חשב את הנפח הכולל של CTG הנדרש. עבור צלחת של 384 בארות, השתמש ב-40 מיקרוליטר CTG לבאר (הוסף CTG 1:1 לפי המלצת היצרן). קח בחשבון את הנפח המת לחלוקת ריבוי טיפות (1 מ"ל לצינור). יש להפשיר CTG למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור.
2. בדוק אם המתקן דורש כיול.

9. יום 7 (טווח: ימים 7 - 14): קריאת סינון סמים: בדיקת CTG

1. יש לאפשר ל-CTG להגיע לטמפרטורת החדר. בדוק ויזואלית את כל הבארות של צלחת 384 הבארות לפני הקריאה, רשום אם התרחשו זיהומים כלשהם.
2. דמיין את הבארות הרלוונטיות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כלול בקרות חיוביות (סטאורוספורין), בקרות שליליות (בארות נורמליזציה) והריכוז הגבוה ביותר של כל תרופה.
3. שטפו והשליכו את מכונת הרב-טיפה לפי השלבים המתוארים בסעיף 4.4. הוצא 40 מיקרוליטר CTG לכל באר, בהתאם להגדרת הצלחת. יש לנער באמצעות שייקר הצלחות של מתקן הטיפות (Shake) למשך 5 דקות, ולדגור בטמפרטורת החדר, מוגן מאור למשך 25 דקות.
   הערה: תגובת ה-CTG היא תגובה אנזימטית ולכן מושפעת מהטמפרטורה וזמן הדגירה. האות יציב כביכול למשך 30-60 דקות; עם זאת, שימוש באותו זמן דגירה עבור כל הצלחות, במיוחד בעת חישוב מדדי GR, מגביר את הדיוק.

10. מדידות ביולומינסנציה CTG

1. הפעל את קורא הלוחות הביו-לומינסנציוני עם קיבולת של 384 בארות ואת המחשב. כאן נעשה שימוש בקורא צלחות ניצוץ.
2. פתח את תוכנת עורך השיטות של Spark (ראה טבלת החומרים). בחר את פורמט הצלחת: COS384fb-Corning 384 שטוח שחור | ללא מכסה | ללא קלטת לחות; בחר את הבארות שצריך למדוד.
3. בתפריט הימני התחתון, בחר זיהוי | זוהר, וגרור מתחת לצלחת. סוג: הנחתה, תפריט שני: ללא. הגדר את זמן האינטגרציה [ms]: 500.
4. הנח את הצלחת, בחר אותה והפעל את השיטה על ידי לחיצה על התחל. שמור את הגיליון האלקטרוני המיוצא.

11. ניתוח נתונים

1. חשב את גורם ה-Z (Z') כדי להעריך את איכות המסך.
   1. חשב את הממוצע (Av) וסטיות התקן (SDs) של פקדים שליליים (Ctrl^neg, למשל, DMSO) וחיוביים (Ctrl^pos, למשל, Staurosporine).
   2. חשב את גורם Z = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      הערה: Z' מבטא את השונות בתוך ואת המרחב היחסי בין הפקדים החיוביים והשליליים ולכן הוא מדד לטווח הדינמי של הבדיקה¹³. אל תכלול תוצאות בדיקת תרופות עם Z' נמוך מ-0.3; מומלץ להשתמש בנתונים עם Z' > 0.5. Z' ממוצע נע בדרך כלל בין 0.5 ל-0.7 (תלוי במודלים האורגנואידים שבהם נעשה שימוש). כדי שה-Z' יהיה אינפורמטיבי, כל האורגנואידים בבארות הבקרה החיוביות היו צריכים למות.
2. חשב את הכדאיות האורגנואידית היחסית עבור כל באר על ידי הגדרת Ctrl^neg ל-100% ו-Ctrl^pos ל-0% כדאיות.
   1. השתמש בנוסחה זו כדי לחשב את הכדאיות של אורגנואידים.
      כדאיות אורגנואידית = 100% × (ערך באר ניסוי - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. עבור אורגנואידים מוקרנים, חשב את ערך האחוזים.
         אחוז כדאיות אורגנואידית = 100% × (ערך באר ניסוי של x GY) / (Av Ctrl^neg באר ערך של 0 GY)
   2. דמיין את הנתונים בתוכנת ניתוח נתונים על ידי העתקת נתוני הכדאיות לטבלת xy, ובחירת המספר המתאים של ערכי שכפול לכל ריכוז.
   3. עבור ריכוזי תרופות לוגריתמיות, הפוך את ריכוזי התרופה והעתק ערכים אלה לעמודה הראשונה של הטבלה.
   4. כדי לעצב את הגרף, בחר את סוג התרשים (XY), בחר את שגיאת התקן של הממוצע (SEM) והגדר את המקור לפינה השמאלית התחתונה.
3. קבע מדדי IC₅₀ יחסיים, שטח מתחת לעקומה (AUC) ומדדי GR.
   1. עבור רגרסיה לא ליניארית, בכרטיסיה ניתוח , בחר התאם עקומה עם רגרסיה לא ליניארית. בחר באפשרות יומן (מעכב) לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה כדי ליצור עקומת הריגה.
   2. לחץ על הכרטיסייה תוצאות כדי להציג את ה-IC₅₀ היחסי עבור כל תרופה.
      הערה: זהו ריכוז התרופה שנותן תגובה באמצע הדרך בין החלק התחתון לחלק העליון של העקומה. החלק התחתון והחלק העליון הם מישורים ביחידות ציר ה-y.
   3. עבור אזור מתחת לעקומה (AUC), תחת הכרטיסייה ניתוח , בחר אזור מתחת לעקומה, השתמש בהגדרות שהוגדרו מראש ובחר אישור.
   4. לחץ על הכרטיסייה תוצאות כדי להציג את ה-AUC (השטח הכולל) עבור כל תרופה.
      הערה: ה-AUC הוא מדידה משולבת של השפעה מדידה, המשמשת כמדידה מצטברת של השפעת תרופה. עם מולקולות מסוימות, כגון נוגדנים, עקומת המינון-תגובה אינה בצורת סיגמואידית, וערכי IC₅₀ קשים לפירוש. במצב כזה, ערכי AUC עשויים לספק מידע נוסף כמדד להשוואת הבדלים בין קווים אורגנואידים.
   5. לחלופין, אם מדידות CTG נלקחות ביום השני (שלבים אופציונליים 4.4.5 וסעיף 7), חשב את מדדי ה-GR. נתח את מדדי ה-GR באמצעות מחשבון GR מקוון¹⁴, תוך התחשבות בהבדלים בקצב ההתפשטות בין מודלים אורגנואידים לאורך מסך תרופות כדי להבטיח מדידות ניתנות לשחזור ורגישות יותר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מטרת ניסוי זה הייתה לבחון את הרגישות של אורגנואידים HNSCC לכימותרפיה והקרנות כחומרים בודדים. בדקנו גם את יכולת השחזור של התוצאות על ידי ביצוע הניסוי מספר פעמים במרווח של שבוע, וכתוצאה מכך מספר שכפולים ביולוגיים (ניסויים 1-3) (איור 2). בעקבות הפרוטוקול, ביום 0, PD...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מאמר וסרטון זה מתארים כיצד לבצע סינון תרופות בתפוקה בינונית באמצעות PDOs. ניתן לאמץ פרוטוקול זה, עם אופטימיזציה, לסינון אורגנואידים שמקורם בסוגי רקמות שונים מאלה המתוארים כאן. קביעת מסגרת הזמן האידיאלית למעבר לפני המסך חשובה מכיוון שהיא תשתנה עבור תרביות אורגנואידים בוד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel