JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת למדידת איזולבוגלנדינים ברקמות על ידי אימונופלואורסנציה באמצעות נוגדן ScFv D11 מצומד אלקליין פוספטאז. מודלים של יתר לחץ דם הן בעכברים והן בבני אדם משמשים כדי להסביר את ההליכים שלב אחר שלב ואת עקרונות היסוד הקשורים למדידת איזולבוגלנדין בדגימות רקמות.

Abstract

איזולבוגלנדינים (IsoLGs) הם גמא קטואלדהידים תגובתיים מאוד הנוצרים מאיזופרוסטנים H2 דרך חמצון שומנים וחלבונים צולבים המובילים לדלקת ולמחלות שונות, כולל יתר לחץ דם. איתור הצטברות IsoLG ברקמות הוא קריטי כדי לשפוך אור על מעורבותן בתהליכי המחלה. עם זאת, מדידת IsoLGs ברקמות היא קשה ביותר, והכלים הזמינים כיום, כולל ניתוח ספקטרומטריית מסות, הם מייגעים ויקרים מאוד. כאן אנו מתארים שיטה חדשנית לזיהוי באתרו של IsoLGs ברקמות באמצעות D11 ScFv מצומד אלקליין פוספטאז ונוגדן תצוגת פאגים רקומביננטי המיוצר ב- E. coli במיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי. ארבעה פקדים שימשו לאימות הצביעה: (1) צביעה עם ובלי D11, (2) צביעה עם תמצית פריפלסמית חיידקית עם מקשר phosphatase אלקליין, (3) צביעת נוגדנים scFV לא רלוונטי, ו (4) בקרה תחרותית עם IsoLG לפני הצביעה. אנו מדגימים את היעילות של D11 מצומד פוספטאז אלקליין הן ברקמות אנושיות והן ברקמות עכבר עם או בלי יתר לחץ דם. שיטה זו תשמש ככל הנראה ככלי חשוב לחקר תפקידם של IsoLGs במגוון רחב של תהליכי מחלה.

Introduction

איזולבוגלנדינים (IsoLGs), הידועים גם בשם איזוקטלים, הם איזומרים ממשפחת 4-קטואלדהידים, שהם תוצרים של חמצון שומנים, ומגיבים עם אמינים ראשוניים על חלבונים 1,2. IsoLGs היו מעורבים במספר מחלות, כולל לב וכלי דם, אלצהיימר, מחלות ריאה וכבד, וסוגים רבים של סרטן3. IsoLGs נחקרו באופן הנרחב ביותר בתרומתם למחלות לב וכלי דם (CVD), המהוות נטל בריאותי וכלכלי משמעותי ברחבי העולם, כולל ארצות הברית. ההערכה היא כי 92.1 מיליון מבוגרים בארה"ב יש לפחות סוג אחד של CVD, עם תחזיות מוערך 2030 להגיע ל 43.9% מהאוכלוסייה הבוגרת בארה"ב4. הורדת לחץ הדם, כולסטרול והפסקת עישון מפחיתה את הסיכון הכולל להתרחשות אירועי CVD5.

לחץ דם גבוה או יתר לחץ דם הוא גורם סיכון מרכזי למחלות לב וכלי דם ומשפיע על כמחצית מאוכלוסיית ארה"ב6. מחקרים קודמים מצאו כי דלקת היא הגורם הבסיסי ליתר לחץ דם וכי IsoLGs ממלאים תפקיד7. גירויים יתר לחץ דם, כולל אנגיוטנסין II, קטכולאמינים, אלדוסטרון ועודף מלח תזונתי, גורמים להצטברות IsoLG בתאים מציגי אנטיגן כולל תאים דנדריטיים (DCs), אשר בתורם מפעילים תאי T כדי להתרבות ולייצר ציטוקינים דלקתיים התורמים ליתר לחץ דם 8,9.

בעבר, IsoLGs נמדדו על ידי אימונוהיסטוכימיה, ספקטרומטריית מסות, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים וציטומטריית זרימה10,11. כדי להקל על המדידה של IsoLGs, נוגדן רקומביננטי בעל שרשרת אחת (scfv) (D11) פותח כנגד IsoLGs12. בתחילה, נוגדן D11 זה הכיל תג E של 11 חומצות אמינו ודרש נוגדן משני לזיהוי אימונוהיסטוכימיה11. עם זאת, היה קשה למצוא נוגדן משני אמין נגד תג E לאחר הפסקת הייצור שלה על ידי היצרן. לכן, פיתחנו פרוטוקול אמין לצביעה אימונופלואורסצנטית של IsoLGs באמצעות D11 מצומד עם phosphatase אלקליין (D11-AP), אשר הדגמנו ברקמות עכבר ואדם עם וללא יתר לחץ דם.

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ונדרבילט אישרה את כל ההליכים המתוארים בכתב יד זה. עכברים שוכנים ומטופלים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הנבדקים נתנו הסכמה מדעת בכתב לפני ההרשמה למחקר כפי שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ונדרבילט. כל ההליכים בוצעו על פי הצהרת הלסינקי.

1. הכנת פלסמידים המקודדים חלבון היתוך D11-אלקליין פוספטאז ווקטורי בקרה שליליים

  1. בנה גרסה שונה של פלסמיד pCANTAB5E13,14 שבה מקטע משתנה מקטע שרשרת יחיד (scFv) מקושר בקצה 3' שלו לרצף המקודד phosphatase אלקליין חיידקי (AP).
    הערה: מיד במורד הזרם של אתר הגבלת NotI של רצף scFv, הפלסמיד שהשתנה אינו מכיל עוד את רצף הקידוד של תג E ובמקום זאת מקודד את רצף המקשר GGSGGHMGSGG, ואחריו את הרצף עבור AP (מספר הצטרפות GenBank AXY87039.1, T16-K464)15,16. במורד הזרם של AP, הפלסמיד יקודד תגי 8xHis ו- DYKDDDDK. בקצה 3' של התגים, רצף הקידוד מסתיים בקודון עצירה ענבר. הפלסמיד שעבר שינוי נקרא pCANTAB5-AP.
  2. Clone D11 scFv (מספר הצטרפות GenBank AAW28931.1) לתוך pCANTAB5-AP עם אתרי ההגבלה SfiI/NotI.
  3. שכפל את D20 scFv לתוך pCANTAB5-AP באמצעות אתרי ההגבלה SfiI/NotI.
    הערה: D20 scFv הוא בקרה שלילית שנועדה להעריך את דפוס האינטראקציה בין רקמות של scFv לא רלוונטי. scFv זה נבחר במקור על ידי תצוגת פאגים בשל יכולתו לתקשר עם קבוצת גליקן המכונה A2.
  4. צור וקטור "ריק" על ידי הסרת חלק scFv מהפלסמיד לחלוטין והחלפתו ברצף קידוד "AP linker" המורכב מחומצות אמינו GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. הפוך את כל הפלסמידים ל- TG1 E. coli מוכשר וגדל חיידקים בן לילה ב- 30 ° C, על לוחות אגר 0.5% המכילים 2xYT בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין ו -2% גלוקוז (2xYTAG) בינוני.
    הערה: זנים עם הגן supE (כגון TG1 E. coli) אינם מדכאים את קודון עצירת הענבר ב-100%. ההערכות נעות בין 0.8 - 20% מהזמן, כך שעדיין יש הרבה מוצרים שמסתיימים רק במורד הזרם של BAP, כפי שהוא מיועד לניסויים אלה17. TG1 E. coli משמשים בעיקר מסיבות מעשיות, כגון הפחתת זמן ועלויות, התאמתם למערכת ביטוי החלבונים pCANTAB, והשימוש בהם בתצוגת פאגים, המתבצעת בדרך כלל במעבדה. במורד הזרם של קודון עצירת הענבר בעקבות BAP הוא רצף עבור geneIII. חלבוני היתוך GeneIII צריכים לבוא לידי ביטוי לעתים רחוקות כדי שתצוגת הפאגים תתפקד כמתוכנן, מכיוון שחלבוני היתוך scFv-geneIII מפריעים לחלבון הגן המסוים הזה להדביק מחדש חיידקים נאיביים. לכן, חלבוני geneIII נטולי היתוך צריכים להתקיים במהלך הרכבת נגיפים ליצירת פאגים מתפקדים, כלומר, תוצרי חלבון scFv-geneIII הם בדרך כלל נדירים יחסית בתוך החיידק. D11-AP, D20-AP, וקטור ריק, וכל המבנים המשמשים במאמר זה מושפעים כולם באופן דומה מביטוי מזדמן של חלבון היתוך geneIII. עדיין נצפים הבדלים באופן שבו חלבונים אלה מתנהגים.
  6. בחר מושבה בודדת וחסן 5 מ"ל טריים של תרבית 2xYTAG. לאפשר לחיידקים לגדול במשך הלילה ב-30°C ולרעוד ב-150 סל"ד.
  7. משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 3,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל של 85% 2xYTAG ו-15% גליצרול.
  8. יש לשמור את מלאי הגליצרול במקפיא בטמפרטורה של -80°C.

2. ביטוי חלבון ויצירת תמצית פריפלסמית

הערה: יצירת תמצית פריפלסמית היא שיטה נפוצה לביטוי חלבונים בתצוגת פאגים, בעיקר משום שהיווצרות קשרים דיסולפידים חשובה בייצור scFv ונוגדנים. השיטה חוסכת את הצורך ביצירת ליזטים (המכילים בדרך כלל גופי הכללה) ומבטיחה שהחלבונים מקופלים כראוי. ל-pCANTAB יש רצף אותות gIII במעלה הזרם של חלק scFv של חלבון ההיתוך D11-BAP. רצף האותות מבטיח שהחלבון מועבר לחלל הפריפלזמי של החיידק, ואז רצף האותות נבקע. החלל הפריפלסמי מספק סביבה מחמצנת, שהיא חיונית להיווצרות נכונה של גשרים דיסולפידים. הלם אוסמוטי משמש להפקת תמציות פריפלסמיות מכיוון שהוא משבש את הממברנה החיצונית מספיק כדי לשחרר את החלבונים הפריפלסמיים לתוך התווך שמסביב, תוך שמירה על שלמות החיידק.

  1. יש לחסן את מלאי TG1 E. coli גליצרול המכיל את הפלסמידים הרלוונטיים לתרבית של 60 מ"ל של 2xYTAG ולתרבית לילה ב-30°C עם רעידות ב-150 סל"ד.
  2. כדי לגרום לביטוי חלבון, תרביות חיידקים גלולות ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות, להשהות מחדש ב 60 מ"ל של 2xYTA בינוני, ותרבית לילה ב 30 ° C עם רעד ב 150 סל"ד.
    הערה: המעבר ממדיום 2xTYAG למדיום 2xYTA מסייע בהשראת ביטוי חלבוןמספקת 18. כאשר גלוקוז נמצא בתווך החיידקי, מקדם הלאק מדוכא מכיוון שחיידקים מעדיפים לצרוך גלוקוז ולהתעלם מלקטוז, מכיוון שלגלוקוז לוקח פחות אנרגיה לעבד. כאשר גלוקוז מוסר בעקבות מתג המדיום, חיידקים מסתמכים על פחמימות המסופקות על ידי מדיום 2xYT. תמצית שמרים (רכיב Y ב-2xYT) מכילה פחמימות, ביניהן לקטוז, ולכן היא מסוגלת להניע ביטוי חלבונים באמצעות מקדם הלק. IPTG אינו הכרחי עם מבנה pCANTAB ויכול לגרום לביטוי חלבון מוגזם, יחד עם גופי הכללה הגורמים לחלבון לא פונקציונלי.
  3. צור תמציות periplasmic באמצעות הלם אוסמוטי.
    1. תרביות חיידקים גלולות ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות.
    2. יש להשהות מחדש ב-20 מ"ל של 1xTES (0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M סוכרוז) ולדגור במשך שעה אחת על קרח.
    3. גלולה שוב ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות, ו resuspend ב 15 מ"ל של 0.05 M Tris, pH 7.6.
  4. לדגור על מתלה זה על קרח במשך 1 שעה, ולאחר מכן להבהיר על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x גרם במשך 10 דקות.
  5. העבירו סופרנאטנטים לצינור טרי ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לצורך טיהור או שימוש ישיר בניסויים.
  6. להעריך את ליזה התא על ידי נוכחות של D11-BAP פעיל ב ELISA. הוסף 3-5 μL של תמצית periplasmic אחד מ"ל של pNPP, ולאחר מכן לבחון אם שינוי צבע קורה במהלך 10 הדקות הבאות (הצבע עובר מ צהוב ברור צהוב אינטנסיבי).
    הערה: ניתן להשוות את הצבע זה לצד זה לשפופרת של pNPP שלא קיבלה שום ליזט או לשפופרת של pNPP שקיבלה ליזט של חיידקי TG1 נאיביים. לכמת עם ספיגה ב 405 ננומטר.

4. אפיון טיטר D11-AP ב-ELISA

  1. צפו צלחת פוליסטירן 384 בארות למשך הלילה ב-4°C עם 25 μL/באר פוספט-חוצץ מלוחים (PBS) (1.8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl) המכילים 5 מיקרוגרם/מ"ל אלבומין בסרום עכבר (MSA) (בקרה שלילית), או 5 מיקרוגרם/מ"ל של IsoLG/MSA (בקרה חיובית).
  2. רוקנו את הצלחת וייבשו ברז. יש לכבס פעם אחת עם PBS + 0.1% Tween (PBS-T). רוקנו את הצלחת וייבשו ברז.
  3. מלא את הצלחת עם PBS-T כחיץ חוסם (120 μL / באר). יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. רוקנו את הצלחת וייבשו ברז. יש למרוח דילולים סדרתיים ביחס של 1:2 של תמציות פריפלסמיות D11-AP ב-25 μL/באר ומדוללים ב-PBS-T. כלול באר אחת המכילה רק PBS-T כבקרה שלילית.
    הערה: טווחי דילול אופייניים לתמציות פריפלסמיות הם 1:8 - 1:4096. עבור נפח בדיקה של 25 μL, התחל עם 50 μL של ריכוז "1:8" התחלתי: 6.25 μL תמצית periplasmic ו 43.75 μL PBS-T. לאחר מכן, בצע דילול פי 2 על ידי הסרת 25 μL של תמיסה זו והוספתו לבאר הבאה המכילה 25 μL של PBS-T ופיפטה אותו למעלה ולמטה. באר זו מכילה כעת את דילול "1:16". חזור שוב על הדילול פי 2 כדי ליצור את סדרת הדילול המתוארת ביחס של 1:2.
  5. יש לדגור במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר.
  6. רוקנו את הצלחת וייבשו ברז. יש לשטוף 5 פעמים עם PBS-T. יש לרוקן ולייבש ברז.
  7. הכן תמיסת pNPP על ידי המסת 1 גרם של pNPP ב 1 ליטר של 930 mM diethanolamine (98% תמיסת מלאי מדולל 1:10 ב H 2O), עם 0.5 mM MgCl2 מותאם pH 9.5 עם HCl.
  8. יש למרוח תמיסת pNPP של 25 μL/באר כדי לפתח AP. לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולקבוע את הספיגה ב-405 ננומטר בתוך כל באר באמצעות קורא לוחות תואם.
  9. השווה את האות המופק מבארות IsoLG/MSA לרעש המופק מבארות MSA ומצא את טווח הדילולים שבהם האות גבוה לפחות פי 5 מהרעש.
  10. התווה את סדרת דילול אותות D11-AP זו על גרף, קבע את הטווח הליניארי של העקומה וקבע את הדילול שבו ניתן לצפות ב- 50% מהאות.
    הערה: אם דילול זה שווה ערך ל-1:1,000 בקירוב, ניתן להשתמש בתמיסת D11-AP בריכוז של 1:10 ב-IHC/IF.

5. אימונופלואורסנציה

  1. חותכים חלקים טוריים של עכבר ורקמות משובצות פרפין אנושי (5 מיקרומטר עובי) באמצעות מיקרוטום ומניחים באמבט מים חמים (37 ° C). הרכיבו חלקי רקמות על מגלשות זכוכית והניחו להם להתייבש למשך הלילה.
    הערה: עבור מחקר זה, אבי העורקים התקבלו מעכברים. קטעי המעי הגס של בני אדם נורמוטנסיים ויתר לחץ דם התקבלו מרשת הרקמה האנושית השיתופית של ונדרבילט.
  2. לטבול שקופיות קסילן שלוש פעמים במשך 5 דקות כדי deparaffinize רקמות.
  3. Rehydrate רקמות ב 2 שוטף כל אחד של 95%, 70% ו 50% אתנול ב H2O.
  4. שטפו שקופיות במי מלח חוצצים של Tris (TBS) עם 0.1% Tween20 (TBST) שלוש פעמים בשטיפות מהירות על-ידי מילוי מחזיק השקופיות ב-TBST ולאחר מכן השלכת TBST.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות לחות ב-TBST בטמפרטורה של 4°C למשך לא יותר משבוע לפני שליפת האנטיגן.
  5. כדי לבצע אחזור אנטיגן המושרה בחום של שקופיות, הניחו שקופיות במאגר נתרן ציטראט שחומם מראש (80-95 מעלות צלזיוס) (10 מילימטר נתרן ציטראט, 0.05% טווין 20, pH 6.0) ודגרו בסיר לחץ המוגדר ל-4 דקות בלחץ גבוה לזמן שליפת אנטיגן כולל של 20 דקות.
  6. הסירו את המגלשות מסיר הלחץ ותנו להן להתקרר במשך 20 דקות לטמפרטורת החדר.
  7. שטפו שקופיות ב-TBST שלוש פעמים בשטיפות מהירות.
    הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב-TBST לאחר שליפת אנטיגן לא יותר משבוע לפני הצביעה.
  8. הוסף 2% BSA מומס ב- TBST כדי לחסום שקופיות. מכסים את המגלשות ברצועה של סרט פרפין ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  9. מחק את מאגר החסימה מהשקופיות.
  10. הוסף 200 μL של 1:10 D11-AP ב- TBST לשקופיות וכסה ברצועה של סרט פרפין.
  11. יש לדגור בתא לח כדי למזער את אידוי תמיסת הנוגדנים למשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
  12. שטפו שקופיות שלוש פעמים ב-TBST.
  13. פיתוח עם מפתח phosphatase אלקליין קולורימטרי או פלואורסצנטי עבור immunohistochemistry או immunofluorescence, בהתאמה. שטפו שקופיות פעם אחת עם TBST כדי להסיר מפתח עודף ולמנוע התפתחות צבע נוספת.
  14. כתם נגדי מחליק עם כתם גרעיני Hoechst ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS עבור immunofluorescence. שטפו את המגלשות פעם אחת ב-TBST כדי להסיר כתם נגדי עודף.
  15. יש למרוח כיסויים באמצעות אמצעי ההרכבה.
  16. הצג שקופיות תחת מיקרוסקופ אור הפוך עבור אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי עבור immunofluorescence.

6. בקרות שליליות

הערה: ניתן לבצע ארבעה ניסויי בקרה שלילית כדי לאשר את הספציפיות של צביעת D11-AP עבור IsoLG. ניסויי בקרה שלילית צריכים להתבצע באותו סט צביעה באותם תנאים.

  1. בניסוי הבקרה השלילית הראשון, דגרו רקמות עם D11-AP מדולל ב-TBST או TBST בלבד.
  2. לדגור על רקמות עם D11-AP מדולל ב-TBST ותמצית פריפלסמית חיידקית ללא D11-AP (AP Linker) מדולל ב-TBST.
  3. בצע בדיקה תחרותית עם IsoLG/MSA או MSA ללא ניפוי כפי שתואר קודם לכן12.
    1. הכן IsoLG ו- IsoLG המודבקים לאלבומין בסרום עכבר (MSA) כמתוארקודם 19, ביחס מולארי של 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).
    2. לדלל את D11-AP 1:10 ב-TBST.
    3. יש לדגור על D11-AP מדולל עם IsoLG/MSA של 50 מיקרוגרם/מ"ל או MSA ללא ניכוי למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    4. הוסף D11-AP עם IsoLG/MSA או D11-AP עם MSA ללא ניפוי לרקמות לצורך צביעה.
  4. השתמש בנוגדן scFv לא רלוונטי, D20, כדי להכתים רקמות עבור ערכת הבקרה השלילית הסופית.

תוצאות

בניסויים מייצגים, D11 scfv עם צימוד פוספטאז אלקליין (D11-AP) שימש באימונופלואורסנציה כדי לזהות IsoLGs הנמצאים בעכברים שטופלו באנגיוטנסין II בהשוואה לעכברי דמה רגילים ובני אדם עם יתר לחץ דם בהשוואה לבני אדם נורמוטנסיים. עכברים טופלו באנגיוטנסין II במינון של 490 ננוגרם/ק"ג/דקה במשך שבועיים, ויתר לחץ דם אושר עם לחץ דם סיסטולי מוגבר בהשוואה לעכברי דמה10. כדי להבטיח ספציפיות של D11-AP, רקמות הוכתמו עם או בלי נוכחות של D11-AP. כפי שהודגם על-ידי צביעת D11-AP, אבי העורקים של עכברים עם יתר לחץ דם המושרה על ידי אנגיוטנסין II הראה ריכוז גבוה של IsoLGs בהשוואה לעכברי ביקורת (איור 1). צביעת רקע או אוטופלואורסצנטיות הייתה מוגבלת, כפי שניתן לראות בבקרות שליליות שלא הוכתמו ב-D11-AP.

D11-AP שימש לזיהוי IsoLGs הנמצאים ברקמות מעיים של חולים אנושיים עם יתר לחץ דם (HTN) או בני אדם נורמוטנסיים (NTN). מצב יתר לחץ דם נקבע מרישומי בית החולים כלחץ דם סיסטולי מעל 140 ולחץ דם דיאסטולי מעל 80 מ"מ כספית. חוקרים שפיתחו פרוטוקול אימונופלואורסנציה עבור D11-AP היו עיוורים למצב יתר לחץ דם של רקמות אנושיות. חלקים הוכתמו בנוכחות ובהיעדר D11-AP כדי להבטיח ספציפיות נוגדנים ולהראות צביעת רקע או אוטופלואורסצנטיות. כפי שניתן לראות באיור 2, מצאנו שברקמות של מטופלים עם HTN היו ריכוזים גבוהים של IsoLGs בהשוואה למטופלים עם NTN. צביעה ללא D11-AP הראתה גם צביעת רקע מינימלית ואוטופלואורסצנטיות. פוספטאז אלקליין אנדוגני מבוטא על ידי אפיתל מעיים, ולכן הפלואורסצנטיות המוגבלת של רקמות מוכתמות ללא D11-AP מראה כי שליפת האנטיגן המשמשת בפרוטוקול זה הספיקה בהשבתת פוספטאז אלקליין אנדוגני הקיים ברקמות. בשילוב עם התוצאות בעכברים, תוצאות אלה מראות גם כי פרוטוקול immunofluorescence מראה ביעילות IsoLGs גבוהים ביתר לחץ דם בהשוואה למצב נורמוטנסיבי.

D11-AP בודד ואוחסן בתמצית הפריפלסמית החיידקית. רקמות עכבר ורקמות אנושיות הוכתמו ב-D11-AP ובתמצית פריפלסמית המכילה את מקשר AP ללא D11 כדי להבטיח שגורמים אחרים שעשויים להיות נוכחים בתמצית הפריפלסמית, כגון פוספטאז אלקליין עודף או לא מצומד, אינם תורמים להכתמה שנצפתה ברקמות שטופלו ב-D11-AP (איור 3). רקמות שהוכתמו ב-D11-AP גרמו להכתמה בהירה יותר בהשוואה לרקמות שהוכתמו בתמצית פריפלסמית. תוצאות אלה מאשרות כי D11-AP מכתים את הרקמות, והצביעה אינה נובעת מפופטאז אלקליין אלקליין לא מצומד שיכול להימצא בתמצית הפריפלסמית ולגרום להכתמה כוזבת של IsoLGs או לתרום לצביעת רקע.

בקרה תחרותית בוצעה על ידי דגירה מוקדמת של D11-AP עם IsoLG המוצמד ל-MSA או MSA ללא ניפוי לפני צביעת רקמות כדי להראות את הספציפיות של D11-AP ל-IsoLG. אם D11-AP הוא ספציפי עבור IsoLG, הנוגדן ייקשר ל- IsoLG-MSA, וכתוצאה מכך זמינות D11-AP לרקמות, ו- D11-AP המודגר עם MSA שאינו מנוקד יהיה בעל צביעה דומה ל- D11-AP רגיל. ברקמות שהוכתמו ב-D11-AP שהודגרו מראש עם המתחרה IsoLG, מצאנו ירידה בכתמים בהשוואה לרקמות שהוכתמו ב-D11-AP ללא כל דגירה מוקדמת (איור 4). ברקמות שהוכתמו ב-D11-AP עם MSA לא מודגר, מצאנו שהכתמים דומים להכתמה שנצפתה ברקמות עם D11-AP. תוצאות אלה מראות את הספציפיות של D11-AP ל- IsoLGs עקב צביעה מופחתת של רקמות כאשר D11-AP הודגר מראש עם IsoLG/MSA, אך לא MSA שאינו מנוכה. בבקרה השלילית הסופית, רקמת העכבר הוכתמה בנוגדן D11-AP או נוגדן scFv לא רלוונטי, D20. צביעת אבי העורקים של עכבר עם D11-AP גרמה להכתמה חזקה בהשוואה ל-D20, מה שמצביע על הספציפיות של D11-AP ל-IsoLGs באבי העורקים עם יתר לחץ דם (איור 5).

figure-results-3426
איור 1: אימונופלואורסנציה של אבי העורקים בעכברים עם יתר לחץ דם ונורמוטנסיב. עורקים מאנגיוטנסין II ועכברים עם דמה הוכתמו עם וללא D11-AP (D11) כדי להראות נוכחות של IsoLGs. (A) עורק מעכבר שטופל באנגיוטנסין II שנבדק עם D11-AP (ירוק) וכתם נגדי גרעיני (מגנטה), (B) עורק מעכבר שעבר טיפול דמה עם D11-AP, (C) עורק מעכבר שטופל באנגיוטנסין II ללא D11-AP, (D) עורק מעכבר שעבר טיפול דמה ללא D11-AP (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4248
איור 2: אימונופלואורסנציה של רקמות מעיים אנושיות ממטופלים עם יתר לחץ דם ונורמוטנסיב. רקמות מחולים עם יתר לחץ דם (HTN) ובני אדם נורמוטנסיים (NTN) הוכתמו עם וללא D11-AP (D11) כדי להראות נוכחות של IsoLGs בחולים עם HTN. (A) רקמות HTN מוכתמות ב-D11-AP (ירוק) וכתם נגדי גרעיני (מגנטה), (B) רקמות NTN מוכתמות ב-D11-AP, (C) רקמות HTN מוכתמות ללא D11-AP, (D) רקמות NTN מוכתמות ללא D11-AP (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5064
איור 3: רקמות עכבר ורקמות אנושיות מוכתמות בתמצית פריפלסמית עם וללא D11-AP. רקמות עכבר ורקמות אנושיות הוכתמו בתמציות פריפלסמיות עם וללא D11-AP. התמונות מראות צביעה מוגבלת של רקמות עם תמצית פריפלסמית ללא D11-AP, אשר מראות כי הצביעה נובעת בעיקר מקישור D11-AP ולא מרכיב אחר שעשוי להימצא בתמצית פריפלסמית. (A) אבי העורקים של עכבר אנג מוכתם D11-AP (ירוק) וכתם נגדי גרעיני (מגנטה), (B) אבי העורקים של עכבר אנג מוכתם בתמצית פריפלסמית, (C) אבי העורקים של עכבר דאם מוכתם ב-D11-AP, (D) אבי העורקים של עכבר דמה מוכתמים בתמצית פריפלסמית, (E) רקמת מעי אנושית עם יתר לחץ דם המוכתמת ב-D11-AP, (F) רקמת מעיים אנושית עם יתר לחץ דם המוכתמת בתמצית פריפלסמית, (G) רקמת מעיים אנושית נורמוטנסיבית מוכתמת ב-D11-AP, (H) רקמת מעיים אנושית נורמוטנסיבית מוכתמת בתמצית פריפלסמית (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6320
איור 4: בקרה תחרותית בכלי שיט של עכברי אנג ושאם. בבקרה תחרותית זו, D11-AP הודגר מראש עם MSA במינון IsoLG או MSA ללא ניפוי. D11-AP ללא כל דגירה מוקדמת שימש כבקרה. תוצאות אלה מראות את הספציפיות של D11-AP ל- IsoLGs מכיוון שיש צביעה מופחתת של רקמות אצל המתחרה IsoLG-MSA בהשוואה ל- D11-AP. הפחתה זו נובעת מ- IsoLG ולא מ- MSA מכיוון שהדגירה המוקדמת של MSA ללא ניכוי גרמה לכתמים דומים לבקרת D11-AP. אבי העורקים של עכבר אנגיוטנסין II (A) ושאם (B) מוכתמים ב-D11-AP (ירוק) וכתם נגדי גרעיני (מגנטה), אנגיוטנסין II (C) ושאם (D) עכבר מוכתמים ב-D11-AP לאחר דגירה עם IsoLG-MSA, אנגיוטנסין II (E) ואבי העורקים של עכבר שאם (F) מוכתמים ב-D11-AP לאחר דגירה עם MSA לא מנוכה (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7445
איור 5: אבי העורקים של העכבר מוכתמים ב-D11 ו-scFv לא רלוונטי, D20. רקמת עכבר הוכתמה ב-D11-AP והושוותה לנוגדן בקרה לא רלוונטי, D20, שהוא ספציפי לגליקופרוטאין A2. צביעת רקמה עם D11-AP (ירוק) וכתם נגדי גרעיני (מגנטה) (A) גרמה לאימונופלואורסנציה אינטנסיבית בהשוואה ל-D20 (ירוק) וכתם נגד גרעיני (מגנטה) (B) המציין ספציפיות של D11-AP ל-IsoLGs (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

D11 נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים המובלים ב-IsoLG בתאים או ברקמות כסמן לדלקת או לעקה חמצונית במחלות 8,9,20. בעבר, D11 הכיל תג E ופיתוח IHC דרש שימוש בנוגדן משני נגד תג E מצומד עם HRP10,20,21. כאן, פיתחנו וביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול לזיהוי חלבונים המודבקים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E, אשר מבטל את הצורך בדגירה משנית של נוגדנים.

כדי לקבוע את הספציפיות של D11-AP, בוצעו ארבעה ניסויי בקרה שליליים. ביצענו את הפרוטוקול ללא נוכחות של D11 והיה לנו פיתוח מינימלי. לתוצאות אלה יש אינדיקציה כפולה: פוספטאז אלקליין אנדוגני אינו תורם לפיתוח, והכתמים שנצפו נובעים מ- D11 ולא מגורם תורם אחר. לאחר מכן, צבענו שקופיות עם מקשר AP ללא D11. ניסוי זה הביא לכתמים מועטים, מה שמצביע על כך ש-AP חופשי או גורמים אחרים בתמצית הפריפלסמית אינם גורמים לכתם שאנו רואים בנוכחות D11. כדי להבטיח את הספציפיות של D11 ל-IsoLG, דגרנו מראש על D11-AP עם IsoLG מטוהר לפני צביעת שקופיות. ראינו ירידה בפיתוח אשר מצביעה על כך ש-D11-AP היה קשור לחלבון IsoLG, ובכך מיצה את כמות D11-AP החופשי להיקשר ל-IsoLG הקיים ברקמה. לבסוף, כדי להבטיח ש-D11-AP נקשר ל-IsoLG ולא לחלבון MSA ש-IsoLG היה קשור אליו, דגרנו מראש על D11-AP עם MSA בלבד. לא היו שינויים בפיתוח, מה שמצביע על כך ש-D11-AP לא נקשר ל-MSA אלא לחלבון IsoLG. לבסוף, חוקרים שפיתחו את פרוטוקול הצביעה היו עיוורים למצב יתר לחץ דם של רקמת מעיים אנושית. ההבדלים בכתמים שנצפו בין חולים עם יתר לחץ דם לחולים עם נורמיתר לחץ דם לא נבעו מהטיה ותוארו בעבר22,23.

למרות שהפרוטוקול שלנו לזיהוי חלבונים המובלים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E הוא קפדני וחזק ומבטל את הצורך בדגירה משנית של נוגדנים, יש לו כמה מגבלות. מגבלה אחת היא שהשתמשנו ב-D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין בתמצית הפריפלסמית, וייתכן שיש צביעה כוזבת של פוספטאז אלקליין אנדוגני בתמצית הפריפלסמית או ברקמות מסוימות, כגון מעי24. עם זאת, הצעד הראשון לפיתוח פרוטוקול זה כלל השבתת phosphatase אלקליין אנדוגני שעשוי להיות נוכח ברקמות25. בתחילה, חומצה אצטית קרה, BME, ו Levamisole26 נבדקו עבור יעילות. אף אחד מאלה לא הפחית לחלוטין את נוכחותו של פוספטאז אלקליין אנדוגני פעיל. חום שימש כדי להשבית phosphatase אלקליין27, ולכן בדקנו נטרול חום של phosphatase אלקליין במאגרים שונים. מצאנו שמגלשות חימום ולחות בחיץ ציטראט ביטלו את רוב הפופטאז אלקליין אנדוגני. שקופיות פותחו בתחילה באמצעות מצע כימילומינסנט/פלואורסצנטי, אך כאשר צולמו ללא מצע זה, הייתה כמות גבוהה של אוטופלואורסצנטיות. VectorRed הוא מצע אשר מתפתח בנוכחות phosphatase אלקליין לייצר כרומוגן, אשר ניתן לדמיין בטווח ערוצי טקסס אדום / TRITC. באמצעות מצע זה, הצלחנו לצפות בקלות רבה יותר באות מעל אוטופלואורסצנטיות ברקע. יש להקפיד במהלך תהליך הצביעה כדי למזער כתמים מלאכותיים. ייבוש רקמות בשקופיות לאחר הידרציה עד להדמיה הביא להתפתחות מוגברת. D11-AP צריך להיות aliquoted ומאוחסן ב -20 ° C. יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים בעת עבודה עם D11-AP. תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) יכולה גם להשפיע על הפעילות האנזימטית של פוספטאז אלקליין ואין להשתמש בה כחיץ שטיפה28. כמו בכל גישה מבוססת נוגדנים, יש לבצע בדיקות יסודיות ואופטימיזציה כדי להבטיח שהכתמים הם ספציפיים, וכי האות אינו מוגבר או מוגבר.

לסיכום, פיתחנו פרוטוקול ממוטב חזק, קפדני וחזק לזיהוי חלבונים המובלים ב-IsoLG באמצעות נוגדן D11 מצומד עם פוספטאז אלקליין במקום תג E. פרוטוקול זה מציג מספר יתרונות: ראשית, השימוש ב- D11 כחלבון היתוך אלקליין פוספטאז זול יותר. D11 נגזר במקור מספריית נוגדני פאגים שלא ניתן היה למסחר והיה יקר לטיהור. למרות D11 בתמצית E. coli periplasmic יכול לספק חלופה זולה, זה לא היה יעיל ברוב הבדיקות. שנית, גישת היתוך phosphatase אלקליין מאפשרת D11 scfv יש כתב שימושי15 (phosphatase אלקליין) מאוחה אליו ולא יהיה צורך לטהר אותו לשימוש immunoassays כמו מצעים זמינים מסחרית. שלישית, E. coli אלקליין phosphatase יוצר דימרים29. אז D11, כאשר מאוחה לפוספטאז אלקליין היה יוצר גם דימרים וזה מגביר את ההתלהבות של הנוגדן ואת פעילות הקישור30. לבסוף, D11 מצומד עם phosphatase אלקליין בתמצית periplasmic ניתן לנקות בקלות באמצעות Cibacron Blue Sepharose. D11 יש נקודה איזואלקטרית גבוהה (~ 9.2 pH). ככזה, הוא טעון חיובי ויכול להיקשר לכחול Cibacron באמצעות אינטראקציות pi-cation. רוב הזיהומים בתמצית E. coli periplasmic ניתן לדלל את השרף. לאחר מכן ניתן לדלל את D11 המצומד עם פוספטאז אלקליין באמצעות מלח גבוה (~1.5M NaCl) במים. D11 מדולל מצומד עם phosphatase אלקליין הוא יציב למדי ב 4-8 ° C בתמיסת מלח גבוהה. לכן, פיתחנו פרוטוקול שלא רק הופך את נוגדן D11 לזמין בעלות נמוכה, אלא גם מבטל את השלבים הנוספים ואת הצורך בדגירה השניונית של הנוגדנים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה ניתנת לשחזור של IsoLGs, המצטברים ברקמות במחלות מרובות שבהן לחץ חמצוני מוגבר משחק תפקיד.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 ו- R03HL155041 ל- A.K. אנו מודים למשאב המשותף להיסטולוגיה דיגיטלית - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 על תצוגה חזותית וסריקת שקופיות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA)Cytiva28953766
200 Proof EthanolPharmco111000200
2xYT powderMP Biomedicals3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplatesThermoFisher (NUNC)242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP)CarbosynthEN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP)CarbosynthEB09335
Ampicillin, sodium saltResearch Products International (RPI)A40040
Bovine Serum AlbuminRPIA30075
Chemically competent TG1 E. coliAmid BiosciencesTG1-201
Diethanolamine, >98%Sigma-AldrichD8885
EDTASigma-AldrichED
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01Mouting medium
GlucoseResearch Products International (RPI)G32045
GlycerolSigma-AldrichG7893
HistoclearNational DiagnosticsHS-200Xylene alternative
Hoechst 33342ThermoFisherH3570stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine ChemicalsThermoFisherMK-2624-212
ImidazoleResearch Products International (RPI)I52000
MgCl2 (anhydrous)Sigma-AldrichM8266
Mouse Serum Albumin (MSA)Sigma-Aldrich/Calbiochem126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT)CarbosynthEN13587
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Pressure CookerCuisinartCPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 mlThermoFisher66380
Sodium chloride (NaCl)Research Products International (RPI)S23020
Sodium CitrateSigma-Aldrich1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4)Research Products International (RPI)S23100
SucroseResearch Products International (RPI)S24065
Tris baseResearch Products International (RPI)T60040
Tris-buffered SalineBoston Bio-Products25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HClResearch Products International (RPI)T60050
Tween20Sigma-AldrichP9416
Vector RedVector LabsSK-5105

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. . Handbook for a short course in bacterial genetics. , (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. . Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 4/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173ScFv D11

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved