JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, הפרוטוקול מציג את הכנת הפתרון naringenin עבור ניהול intraperitoneal in vivo. נרינגנין מומס במלואו בתערובת של דימתיל-סולפוקסיד, טווין 80 ותמלחות. ההשפעות האוסטאופורוטיות האנטי-סוכרתיות של נרינגנין הוערכו על ידי בדיקות גלוקוז בדם, צביעת חומצה פוספטאז עמידה בפני טרטרט ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזימים.

Abstract

הכנת תמיסה תרכובת (פיטוכימית) היא שלב מתעלם אך קריטי לפני יישומה במחקרים כגון בדיקת תרופות. ההסתגרות המלאה של התרכובת נחוצה לשימושה הבטוח ולתוצאותיה היציבות יחסית. כאן, פרוטוקול להכנת תמיסת נרינגנין וניהול תוך-צפקית שלה בתזונה עתירת שומן ומודל סוכרתי המושרה על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ) מודגם כדוגמה. כמות קטנה של נרינגנין (3.52-6.69 מ"ג) שימשה לבדיקת המסיסות שלו בממסים, כולל אתנול, דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ו-DMSO בתוספת Tween 80 ששוחזר במי מלח פיזיולוגיים (PS), בהתאמה. סולוביזציה מלאה של התרכובת נקבעת על ידי התבוננות בצבע התמיסה, נוכחות של משקעים לאחר צנטריפוגה (2000 x g במשך 30 שניות), או מתן אפשרות לתמיסה לעמוד במשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT). לאחר קבלת תרכובת/תמיסה פיטוכימית יציבה, ניתן להכין את הריכוז/הכמות הסופיים של התרכובת הנדרשת למחקרי in vivo בתמיסת מלאי ממס בלבד (ללא PS), ולאחר מכן לדלל/לערבב עם PS לפי הצורך. ההשפעות האוסטיאופורוטיות האנטי-סוכרתיות של נרינגנין בעכברים (מתן תוך-צפק במינון 20 מ"ג/ק"ג b.w., 2 מ"ג/מ"ל) הוערכו על-ידי מדידת רמת הגלוקוז בדם, מסת העצם (מיקרו-CT) וקצב ספיגת העצם (מכתים TRAP ו-ELISA). חוקרים המחפשים תכשירים מפורטים לתמיסות אורגניות/פיטוכימיות יפיקו תועלת מטכניקה זו.

Introduction

עם מחקרים הולכים וגוברים הנוגעים לשימוש בתרכובות פיטוכימיות לבדיקת תרופות, כדאי לתת תשומת לב לגישות להכנת פתרונות פיטוכימיים להערכת ההשפעות האופטימליות שלהם. יש לקחת בחשבון היבטים רבים כגון מתודולוגיית הפירוק, המינון והריכוז בעת הכנת התרכובת1.

פירוק מבוסס ממס נמצא בשימוש נרחב להכנת תרכובת אורגנית1. הממסים הנפוצים כוללים מים, שמן, דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מתנול, אתנול, חומצה פורמית, טווין, גליצרין וכו'2. אף על פי שתרחיף עם חומרים לא פתורים מקובל כאשר התרכובת ניתנת על ידי gavage קיבה, מומס מומס לחלוטין הוא קריטי עבור מתן תוך ורידי. מאז תמיסת שמן, השעיה, ותחליב יכול לגרום תסחיפים נימיים, תמיסה מימית להכנת תרכובת מומלץ, במיוחד בעת מתן זריקות תוך ורידי, תוך שרירי, intraperitoneal3.

טווח המינון האפקטיבי משתנה בין תרכובות ואפילו בין מחלות שטופלו באותה תרכובת. קביעת המינון היעיל והבטוח והריכוז תלויים בספרות ובניסויים ראשוניים4. כאן, הכנת המתחם naringenin מודגם כדוגמה.

Naringenin (4,5,7-trihydroxy-flavanone), תרכובת פוליפנולית, נחקרה בטיפול במחלות עבור פעילויות hepatoprotective5, אנטי סוכרתי6, אנטי דלקתיות7, ונוגד חמצון8. עבור יישומי in vivo, מתן אוראלי של naringenin הוא נפוץ בשימוש. מחקרים קודמים דיווחו על הכנת תמיסת נרינגנין ב-0.5%-1% קרבוקסימתיל צלולוז, 0.5% מינון מתילצלולוז, 0.01% DMSO, ותמיסת מלח פיזיולוגית (PS) במינון 50-100 מ"ג/ק"ג, הניתנת על ידי גבאג'פומי 9,10,11,12. חוץ מזה, מחקרים אחרים דיווחו על נטילת תוסף נרינגנין עם צ'או ב-3% (wt/wt) לצריכה פומית במינון של 3.6 גרם/ק"ג/ד'13,14. מחקרים דיווחו גם על שימוש באתנול (0.5% v/v), PS ו-DMSO כדי להמיס נרינגנין להזרקה תוך-צפקית במינון 10-50 מ"ג/ק"ג15,16,17,18. במחקר על אפילפסיה של האונה הרקתית, עכברים קיבלו זריקה של נרינגנין שהושהתה ב-0.25% קרבוקסימתיל צלולוז מומס ב-PS19. אף על פי שמחקרים אלה מדווחים על שימוש בממסים שונים להכנת תמיסות נרינגנין, לא דווח על פרטים נוספים, כגון מצב המסה ותגובה של בעלי חיים.

פרוטוקול זה מציג הליך להכנת תמיסת נרינגנין ליישום in vivo באוסטאופורוזיס הנגרמת על ידי סוכרת. הכנת תמיסת ההזרקה כוללת הכנת ממסים ותרכובות, הערכת מינון, תהליך פירוק וסינון. המינון נקבע על סמך מחקרים ספרותיים וניסויים ראשוניים על ידי ניטור עכברים לאחר מתן זריקות מדי יום במשך 3 ימים ושינוי המינון בהתאם להתנהגויות העכברים. הריכוז הסופי שנבחר (20 מ"ג/ק"ג b.w.) ניתן תוך צפק 5 ימים בשבוע במשך 8 שבועות בתזונה עתירת שומן ועכברים סוכרתיים הנגרמים על ידי סטרפטוזוטוצין (STZ)20,21. ההשפעות של נרינגנין באוסטאופורוזיס סוכרתי הוערכו על ידי בדיקות גלוקוז בדם, מיקרו-CT, צביעת חומצה פוספטאז עמידה לטרטרט (TRAP) ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

באופן כללי, נצפה כי נרינגנין בטווח ריכוזים של 40-400 מ"ג/מ"ל לא התמוסס לחלוטין באתנול או ב-DMSO או ב-5% (אתנול או DMSO) בתוספת 95% PS (v/v). עם זאת, נרינגנין התמוסס לחלוטין בתערובת של 3.52% DMSO, 3.52% טווין 80 ו-92.96% PS. ההליך המפורט יסייע לחוקרים להכין את התרכובת כפתרון הזרקה ליישום in vivo .

Protocol

החקירות המתוארות תאמו את ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המועצה הלאומית למחקר ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית. בעת ביצוע הניסויים, מעילי מעבדה, כפפות ניטריל חד פעמיות ומשקפי מגן נדרשים למטרות בטיחות.

1. הכנת ממסים והערכת נרינגנין הנדרשים ליישום in vivo

  1. הכינו את הממסים הבאים: Tween-80 (טווח ריכוזים סופי: 0.5%-1%), DMSO, גליצרין (טווח ריכוז סופי: 15%-20%), אתנול (טווח ריכוז סופי: 12% להזרקה תוך שרירית)22, ו-0.9% PS.
  2. הערך את כמות הנרינגנין הנדרשת בהתבסס על המינון, מספר העכברים ותדירות ההזרקה.
    1. הזמינו 10 עכברים (C57BL/6, זכר, בן 5 שבועות, SPF) למתן נרינגנין 5 ימים בשבוע למשך 8 שבועות. שמור עכברים במצבים ספציפיים ללא פתוגנים (SPF).
      הערה: המינון הנדרש להזרקה תוך-צפקית הוא 20 מ"ג/ק"ג b.w.23.
    2. שקלו 160 מ"ג של נרינגנין על פי החישוב הבא: 20 מ"ג/ק"ג x 0.02 ק"ג/עכבר x 10 עכברים x 5 ימים בשבוע x 8 שבועות = 160 מ"ג.
  3. חשב את ריכוז הנרינגנין שיש להזריק ב- vivo.
    1. הכינו את הנפח המומלץ על סמך משקל הגוף של העכברים. הנפח המומלץ של נרינגנין המיושם על כל עכבר הוא 1% ממשקל הגוף (0.3 מ"ל). בניסוי זה נעשה שימוש ב-0.2 מ"ל לעכבר.
    2. חישוב הנפח הכולל: 0.2 מ"ל לעכבר x 10 עכברים x 5 ימים בשבוע x 8 שבועות = 80 מ"ל.
    3. חישוב ריכוז הנרינגנין במלאי: 160 מ"ג/80 מ"ל ממסים = 2 מ"ג/מ"ל.
    4. חשב את עוצמת הקול עבור כל יום: 0.2 מ"ל לעכבר x 10 עכברים = 2 מ"ל.

2. פירוק

  1. תמיסת אתנול
    1. כדי להכין תמיסת נרינגנין ב 2 מ"ג / מ"ל, לשקול 3.52 מ"ג של naringenin ולהוסיף אותו לתוך צינור 2.0 מ"ל.
      הערה: כדי להשיג ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל, הנפח הכולל הנדרש יהיה 1760 μL (חישוב: 3.52 מ"ג/1760 μL = 2 מ"ג/מ"ל).
    2. הסתובבו במהירות (2000 x גרם במשך 30 שניות) כדי לגרום לאבקת הנרינגנין לשקוע בתחתית הצינור (איור 1A).
    3. הוסף 8.8 μL של 100% אתנול לצינור כדי להכין תמיסה של 0.5% (v/v) ביחס לנפח הכולל הנדרש2. נרינגנין אינו מתמוסס לחלוטין (איור 1B).
    4. המשך להוסיף 79.2 μL של 100% אתנול לצינור כדי להכין תמיסה של 5% (v/v) ביחס לנפח הכולל הנדרש (חישוב: (79.2 μL + 8.8 μL) / 1760 μL x 100% = 5%). נרינגנין אינו מתמוסס לחלוטין (איור 1B).
    5. יש להוסיף 1672 μL של 0.9% PS לצינור המכיל 5% אתנול כמתואר בשלב 2.1.4. זה ייצור תחליב (איור 1D). צנטריפוגה (2000 x גרם במשך 30 שניות) הפתרון כדי לבדוק אם naringenin מומס לחלוטין בתמיסה. משקעים לבנים של נרינגנין לא מפוענח מופיעים בתמיסה (איור 1E).
  2. פתרון DMSO
    1. כדי להכין תמיסת נרינגנין ב 2 מ"ג / מ"ל, לשקול 3.95 מ"ג של naringenin ולהוסיף לתוך צינור 2.0 מ"ל.
      הערה: כדי להשיג ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל, הנפח הכולל הנדרש יהיה 1975 μL (חישוב: 3.95 מ"ג/1975 μL = 2 מ"ג/מ"ל).
    2. סובבו במהירות כלפי מטה (2000 x גרם במשך 30 שניות) כדי לגרום לאבקת הנרינגנין לשקוע בתחתית הצינור.
    3. הוסף 9.8 μL של DMSO לצינור כדי להכין תמיסה של 0.5% (v/v) (חישוב: 9.8 μL/1975 μL x 100% = 5%). נרינגנין מתמוסס לחלוטין (איור 2A).
    4. הוסף 88.2 μL של DMSO לצינור כדי להכין תמיסה של 5% (v/v) ביחס לנפח הכולל הנדרש (חישוב: (88.2 μL + 9.8 μL) /1975 μL x 100% = 5%). נרינגנין מתמוסס לחלוטין (איור 2B).
    5. הוסף 1877 μL של 0.9% PS (v/v אחוז של 95%) לתמיסה שהוכנה בשלב 2.2.4. נוצר תחליב (איור 1C). צנטריפוגה (2000 x גרם במשך 30 שניות) הפתרון כדי לבדוק אם naringenin מומס לחלוטין בתמיסה. משקעים לבנים של נרינגנין לא מפוענח מופיעים בתמיסה (איור 1D).
  3. פתרון Tween-80 ו-DMSO
    1. כדי להכין את תמיסת נרינגנין ב 2 מ"ג / מ"ל, לשקול 6.69 מ"ג של naringenin ולהוסיף לתוך צינור 5.0 מ"ל.
      הערה: כדי להשיג את הריכוז הסופי של 2 מ"ג/מ"ל, נפח התמיסה הכולל הנדרש יהיה 3345 μL (חישוב: 6.69 מ"ג/3345 μL = 2 מ"ג/מ"ל).
    2. סובבו במהירות כלפי מטה (2000 x גרם במשך 30 שניות) כדי לגרום לאבקת הנרינגנין לשקוע בתחתית הצינור.
    3. הוסף 117.7 μL של DMSO כדי להכין תמיסה של 3.5% (v/v) ביחס לנפח הכולל הנדרש (חישוב: 117.7 μL / 3345 μL x 100% = 3.5%). נרינגנין מתמוסס לחלוטין (איור 3A)
    4. הוסף 117.7 μL של Tween 80 לתמיסה שהוכנה בשלב 2.3.3 כדי להשיג 3.5% (v/v) Tween 80 ו-3.5% (v/v) DMSO. שימו לב לפירוק המלא של נרינגנין (איור 3B)
    5. הוסיפו באיטיות את התמיסה שהוכנה בשלב 2.3.4 לצינור של 5.0 מ"ל המכיל 3109.6 מיקרון ליטר של 0.9% PS (v/v אחוז של 93%) ונערו היטב כדי לקבל תמיסת נרינגנין לכאורה (איור 3C).
    6. תנו לתמיסה שהוכנה בשלב 2.3.5 להישאר בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעתיים. הפתרון עדיין נראה לעין ללא משקעים נראים לעין (איור 3D).
  4. הכנת פתרון נרינגנין לניהול in vivo
    1. על פי שלב 1.2.2, לשקול 160 מ"ג של naringenin (160 מ"ג / 2 מ"ג / מ"ל = 80 מ"ל).
    2. הוסף 2.8 מ"ל של DMSO כדי להשיג פתרון של 3.5% (v/v) (חישוב: 2.8 מ"ל / 80 מ"ל x 100% = 3.5%)
    3. לאחר מכן, הוסף 2.8 מ"ל של Tween 80 לתמיסה שהוכנה בשלב 2.4.2 כדי להשיג 3.5% (v/v) Tween 80 ו-3.5% (v/v) DMSO.
    4. Aliquot הפתרון מוכן בשלב 2.4.3 לתוך ארבעה צינורות, 1.4 מ"ל לכל צינור [(2.8 מ"ל + 2.8 מ"ל) / 4 = 1.4 מ"ל].
    5. Aliquot 18.6 מ"ל של 0.9% PS לחמישה צינורות 15 מ"ל.
    6. אחסן את הפתרון שהוכן בשלב 2.4.3 (פתרון מלאי) ו- 2.4.5 ב- 4 °C (2.8 מ"ל + 2.8 מ"ל + 18.6 מ"ל x 4 = 80 מ"ל).
    7. קח 140 μL של פתרון המלאי (שלב 2.4.3) וערבב אותו עם 1860 μL של 0.9% PS כדי להכין 2 מ"ל של תמיסת naringenin ליום אחד של ניהול.
    8. סנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.

3. ניהול פתרונות נרינגנין

  1. טיפול ואיפוק
    1. רססו את הכלוב והידיים ב-70-75% אלכוהול לפני פתיחת המכסה. הרם את העכבר ליד בסיס הזנב והנח אותו על משטח מוצק כדי למקם את זנבו בעדינות לאחור.
    2. תפסו את שפשוף הצוואר מאחורי האוזניים עם האגודל השמאלי והאצבע המורה והניחו את הזנב בין האצבע הקטנה לאצבע הטבעת. שמור את העכבר במצב שכיבה כשהקצה האחורי שלו מוגבה מעט.
  2. זריקה
    1. תפסו את העור האחורי של העכבר כך שעור הבטן יהיה מתוח.
    2. דחפו את המחט (מזרק האינסולין) פנימה בזווית של 10° בין המחט למשטח הבטן, ברביע הימני התחתון או השמאלי של הבטן כדי למנוע פגיעה בשלפוחית השתן, בכבד או באיברים פנימיים אחרים.
    3. הפעל את המחט תת עורית בכיוון גולגולתי עבור 3-5 מ"מ, ולאחר מכן להחדיר אותו בזווית 45° לתוך חלל הבטן.
    4. כאשר המחט עוברת דרך דופן הבטן וההתנגדות נעלמת, בצע שאיפה לאשר כי אין חומר ריפלוקס נסוג. לאחר מכן, לאט לאט לדחוף את הפתרון.
    5. לאחר ההזרקה, משכו באיטיות את המחט החוצה וסובבו אותה מעט כדי למנוע דליפה. הנפח המומלץ הוא 50-100 μL/10 גרם.
    6. השליכו את שאריות הנרינגנין במיכל ביו-האזרד.

4. בדיקת גלוקוז בדם

הערה: בדוק את רמת הגלוקוז בדם יום אחד לפני ההזרקה וחודש וחודשיים לאחר ההזרקה.

  1. הרץ את העכברים במשך 15 שעות לפני בדיקת הגלוקוז בדם. ניתן להמשיך לספק מים.
  2. פתחו את רצועות הבדיקה וסמנו את התאריך. לאחר הפתיחה, יש להשתמש ברצועות הבדיקה תוך 3 חודשים. אחסן את רצועות הבדיקה בטמפרטורה של 2-30 מעלות צלזיוס. סגרו היטב את המכסה לאחר הסרת הרצועה כדי למנוע היווצרות לחות.
  3. הכניסו את החיה לתא האינדוקציה. הפעילו את מכשיר האידוי ברמת אינדוקציה של 4% עבור איזופלוראן ו-4 ליטר לדקה עבור חמצן. לאחר שהחיה מורדמת במלואה, יש לשמור על חומר ההרדמה עם חרוט האף ועל אספקת חומר ההרדמה ברמה של 1.5% לאיזופלוראן ו-0.4 ליטר/דקה לחמצן.
  4. נגבו את הזנב עם כדורי צמר גפן/ספוגיות ספוגים ב-70%-75% אלכוהול.
  5. החל מהנקודה הנמוכה ביותר של הזנב, לעשות נקב קטן על וריד הזנב לרוחב עם דקירת מחט 25G ולסחוט טיפת דם.
  6. נגבו את טיפת הדם בנייר טישו.
  7. לסחוט עוד טיפת דם ולאסוף אותו על קצה רצועת בדיקה.
  8. קרא והקלט את התוצאה המוצגת על מד הסוכר.
  9. כדי לעצור את הדימום, לצבוט את הזנב של העכבר עם גזה סטרילית ולנגב את האזור עם 75% אלכוהול.
  10. ניתן לקבל דגימות נוספות בטכניקה דומה הנעה במעלה הזנב באופן גולגולתי.

5. מכתים מלכודת

  1. הכנת שקופיות
    1. בצע בדיקות גלוקוז בדם בצום על העכברים פעם בשבוע. כאשר רמות הגלוקוז בדם הן ≥ 11.1 mmol/L (מעיד על עכברי סוכרת מסוג II מוצלחים מודל 24), הרדימו את העכברים באמצעות CO2, ולאחר מכן דיסקציה צווארית, ואספו את המותני 4-6th (L4-L6) (לא מבוצעת המתת חסד בזמן בדיקת גלוקוז בדם בצום).
    2. תקן את דגימות L4-L6 עם 4% paraformaldehyde במשך 24 שעות (ודא כי נפח paraformaldehyde הוא >פי 20 נפח של הרקמה), ולאחר מכן לשטוף במשך 2 שעות בזרימה רציפה של מי ברז.
    3. כדי לטבול את הדגימות, יש לטבול אותן בתמיסת חומצה אתילנדיאמינטטראציטית (EDTA) של 10% למשך שבועיים ב-RT במצב סטטי עד שהדגימות מתרככות. ודא שנפח תמיסת ההסרה הוא פי 20-30 מנפח הרקמה/הדגימה. החלף את פתרון EDTA כל יומיים.
    4. ייבשו את הדגימה באמצעות מייבש כביסה.
      1. מניחים את הדגימות בקלטות הטמעה לעיבוד רקמות. מספר את הקלטת באמצעות עיפרון.
      2. הגדר את תוכנית מייבש הכביסה באופן הבא: 75% אלכוהול למשך שעתיים, 85% אלכוהול למשך שעה, 95% אלכוהול למשך שעה, 95% אלכוהול למשך שעתיים, אתנול נטול מים (I) למשך שעתיים, אתנול נטול מים (II) למשך 2 שעות, אתנול נטול מים (III) למשך 2 שעות, קסילן (I) למשך שעה אחת, קסילן (II) למשך שעה אחת, קסילן (III) למשך שעה אחת, שעוות פרפין (I) למשך שעתיים, ושעוות פרפין (II) למשך שעתיים, ב-RT.
    5. הטמע את הדגימות בשעוות פרפין.
      1. מוסיפים שעוות פרפין למגש הקלטת של תחנת הטמעת הפרפין ומחממים ל-60 מעלות צלזיוס. לטבול את הדגימות מיובשות במשך שעתיים לפחות.
      2. מניחים את קלטת הרקמות במגש הקלטת ומחממים מראש.
      3. מוסיפים שעוות פרפין למאגר הפרפין ומחממים ל-60 מעלות צלזיוס.
      4. לאחר 2 שעות, לקחת גם קלטת רקמות וגם דגימות לאזור העבודה. יוצקים את שעוות הפרפין שחוממה מראש ממאגר הפרפין לתוך קלטת הרקמה. הכנס את הדגימה לתוך שעוות פרפין, ודא כי שעווה פרפין מכסה לחלוטין את הרקמה, ולאחר מכן מיד להעביר את הקלטת על תחנת הדובדבן.
      5. השתמש במיקרוטום כדי לחתוך את הדגימות המוטבעות בפרפין למקטעים של 5-6 מיקרומטר. קפל את החלקים במים חמים של 40 מעלות צלזיוס במשך פחות מ -10 שניות. אסוף את החלקים על שקופיות זכוכית מצופות APS (אמינו סילן). מייבשים את השקופיות ב-RT למשך שעה אחת, ולאחר מכן מעבירים את המגלשות לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. הכנת ריאגנט TRAP
    1. הכינו תמיסת דגירה בסיסית: המיסו 9.2 גרם נתרן אצטט נטול מים, 11.4 גרם חומצה טרטרית L(+) ו-2.8 מ"ל של חומצה קרחונית ב-1,000 מ"ל של מים מזוקקים. התאם את ה-pH ל-4.7-5.0 ואחסן ב-RT למשך עד 6 חודשים.
    2. הכן תמיסת אתר נפטול: המסה 0.1 גרם של פוספט נפתול AS-BI ב-5 מ"ל של אתילן גליקול מונואתיל אתר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד 5 שבועות.
    3. הכינו תמיסת נתרן ניטריט: המיסו 1 גרם נתרן ניטריט ב-25 מ"ל מים מזוקקים. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. הכינו צבע פררוזאנילין: הוסיפו 1 גרם של בסיס פארארוסאנילין ל-20 מ"ל של 2N HCl (83 מ"ל של HCl ב-417 מ"ל מים). השתמשו בצלחת ערבוב כדי להמיס את הבסיס ולסנן אותו לפני השימוש.
  3. צביעת מלכודות
    1. ממלאים שתי צנצנות קופלין בתמיסת דגירה בסיסית של 50 מ"ל ומכניסים לתנור של 37 מעלות למשך שעתיים.
    2. קח צנצנת קופלין אחת והוסף 0.5 מ"ל של תמיסת נאפטול-אתר.
    3. מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
      הערה: הכן לפחות שלוש שקופיות עבור כל קבוצה.
    4. כמה דקות לפני זמן הדגירה הוא סיים, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת נתרן ניטריט ו 1 מ"ל של צבע pararosaniline. מערבבים בעדינות במשך 30 שניות ומשאירים למשך 2 דקות.
    5. הוסף את התמיסה שהוכנה בשלב 5.2.2 לצנצנת הקופלין האחרת שחוממה מראש המכילה את תמיסת המלאי הבסיסית. ערבבו היטב את התמיסה והכניסו את השקופיות מצנצנת הקופלין בשלב 5.3.3.
    6. דגירה במשך 15-20 דקות ב- RT.
    7. שוטפים את הפרוסות בצנצנת קופלין אחרת עם 200 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
    8. מכתימים את הפרוסות ב-100% המטוקסילין למשך 30 שניות בצנצנת קופלין.
    9. יש לייבש את הפרוסות ב-85%, 95% ו-100% אלכוהול (200 מ"ל) למשך 2 דקות כל אחת ולטפל בקסילן (200 מ"ל) למשך 2 דקות למשך 3x. השתמשו בצנצנות קופלין כדי לבצע כל שלב.
    10. אבטחו את החלק שעל זכוכית הכיסוי באמצעות כיסוי באמצעות שרף. הקפידו למנוע לכידה של בועות אוויר.

6. אליסה

  1. הכנת דוגמאות
    1. הסר את הרקמות הרכות מעצם הירך ואת השוקה של העכבר. נקה את העצמות עם גזה.
    2. הכנס את דגימות העצם לתוך צינור microcentrifuge 1 מ"ל ולאחסן את צינורות הדגימה ב -80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן את הדגימות גם במיכל חנקן נוזלי למשך לא יותר מ-6 חודשים.
    3. שקלו את דגימת העצם. יש לדלל עם 0.9% PS ביחס של 1:10. לדוגמה, לדלל 0.1 גרם של עצם עם 1 מ"ל של PS.
    4. הוסיפו חרוזי זירקוניה בקוטר 3 מ"מ לתוך הצינור וטחנו את הדגימות 3x ב-70 הרץ למשך 30 שניות עם מנוחה של 20 שניות בין לבין.
    5. צנטריפוגה את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס ו 12,000 x גרם במשך 5 דקות. לאסוף את הסופר-נטנט.
  2. ערכת בדיקה ELISA
    הערה: בצע ELISA בהתאם לפרוטוקול הבדיקה שצוין על ידי היצרן.
    1. הוסף 100 μL מכל דילול של תקן, ריק, ודגימה לתוך הבארות המתאימות. דגירה במשך 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. יש לרוקן את הנוזל מכל באר ולהוסיף 100 μL של תמיסת נוגדנים לזיהוי ביוטינילציה. דגירה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
    3. דקנט את התמיסה, להוסיף 350 μL של מאגר לשטוף לכל באר. משרים למשך דקה אחת, חוזרים על הפעולה 3x.
    4. הוסף 100 μL של פתרון עבודה מצומד HRP לכל באר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    5. דכא את הפתרון. חזור על תהליך הכביסה פי 5 כמתואר בשלב 6.2.3.
    6. הוסף 90 μL של מגיב המצע. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.
    7. הוסף 50 μL של פתרון העצירה.
  3. השתמש בקורא צלחות כדי לתעד את הספיגה של כל באר ב-450 ננומטר.
  4. יצירת עקומה סטנדרטית
    1. התווה את ערכי הספיגה הממוצעים המתאימים כנגד ריכוזי החלבון המדולל סדרתי.
    2. חברו את הנקודות כדי ליצור את עקומת ההתאמה הטובה ביותר. השתמש בכל יישום מחשב מתאים (גיליון אלקטרוני) כדי ליצור את משוואת העקומה הסטנדרטית.
  5. החלף את ערך הספיגה של כל דגימה במשוואת העקומה הסטנדרטית כדי לקבל את ריכוז הדגימה המתאימה.

תוצאות

נמצא כי משקל גופם של עכברים סוכרתיים שניזונו מתזונה עתירת שומן ו-STZ ירד בהשוואה לזה של קבוצות הביקורת בין 0-8 שבועות לאחר הטיפול ב-STZ. הירידה במשקל של עכברים שטופלו בנרינגנין הייתה משמעותית בהשוואה לעכברים שלא טופלו (קבוצת STZ) בשבוע 4. קבוצות הבקרה וה-STZ נוהלו באותו נפח של PS (טבלה 1). רמת...

Discussion

הכנת הפתרון הפיטוכימי היא הבסיס ליישומו in vivo. בפרוטוקול זה, הכנת תמיסת נרינגנין הודגמה על ידי שימוש בממיסים שונים, כגון אתנול, DMSO, Tween 80 ו- 0.9% PS. הפתרון במצב מומס לחלוטין צריך להיות מנוטר עוד יותר על ידי מתן אפשרות להישאר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות ממושכות, ולאחר מכן מסונן לפני השימוש

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81973607 ו-81573992).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

References

  1. Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
  2. Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
  5. Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
  6. Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
  7. Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
  8. Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
  9. Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
  10. Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
  11. Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
  12. Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
  13. Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
  14. Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
  15. Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
  16. Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
  17. Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
  18. Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
  19. Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
  20. Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
  21. Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
  22. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
  23. Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
  24. Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
  25. Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
  26. Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
  27. Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
  28. van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  29. Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
  30. Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
  31. Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
  32. Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
  33. Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

174DMSO80ELISAin vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved