מודל פרה-אקליני של מכת חום מאמץ בעכברים

Summary

הפרוטוקול מתאר התפתחות של מודל סטנדרטי, חוזר, פרה-אקליני של מכת חום מאמץ (EHS) בעכברים ללא גירויים חיצוניים שליליים כגון הלם חשמלי. המודל מהווה פלטפורמה ללימודים מכאניסטיים, מונעים וטיפוליים.

Abstract

מכת חום היא הביטוי החמור ביותר של מחלות הקשורות לחום. מכת חום קלאסית (CHS), הידועה גם בשם שבץ חום פסיבי, מתרחשת במנוחה, ואילו מכת חום מאמץ (EHS) מתרחשת במהלך פעילות גופנית. EHS שונה CHS באטיולוגיה, מצגת קלינית, והמשך של תפקוד רב איברים. עד לאחרונה, רק דגמים של CHS הוקמו היטב. פרוטוקול זה נועד לספק קווים מנחים למודל עכבר פרה-אקליני מעודן של EHS, הנאווה בגורמים מגבילים מרכזיים כגון שימוש בהרדמה, איפוק, בדיקות רקטליות או הלם חשמלי. גברים ונקבות C57Bl/6 עכברים, מכשירים עם טמפרטורת הליבה (Tc) בדיקות טלמטריות נוצלו במודל זה. לצורך היכרות עם מצב הריצה, עכברים עוברים 3 שבועות של הכשרה באמצעות גלגלי ריצה מרצון וכפויים כאחד. לאחר מכן, עכברים רצים על גלגל כפוי בתוך תא אקלים להגדיר ב 37 °C (5 °F) ו 40%-50% לחות יחסית (RH) עד הצגת מגבלת סימפטום (למשל, אובדן הכרה) ב Tc של 42.1-42 °C (5 °F), אם כי תוצאות מתאימות ניתן להשיג בטמפרטורות החדר בין 34.5-39.5 °C (למשל, אובדן הכרה) ב Tc של 42.1-42 °C (5 °F), אם כי תוצאות מתאימות ניתן להשיג בטמפרטורות החדר בין 34.5-39.5 °C (30%-90%. בהתאם לחומרה הרצויה, עכברים מוסרים מהתא באופן מיידי להתאוששות בטמפרטורת הסביבה או נשארים בתא המחומם למשך זמן רב יותר, מה גרימת חשיפה חמורה יותר ושכיחות גבוהה יותר של תמותה. התוצאות מושוות לבקרות פעילות גופנית תואמות מזויפות (EXC) ו/או פקדים נאיביים (NC). המודל משקף רבות מהתוצאות הפתופיזיולוגיות שנצפו ב- EHS האנושי, כולל אובדן הכרה, היפרתרמיה חמורה, נזק רב-איברי כמו גם שחרור ציטוקינים דלקתיים, ותגובות פאזה חריפות של המערכת החיסונית. מודל זה אידיאלי למחקר מונחה השערות כדי לבחון אסטרטגיות מניעה וטיפולית שעלולות לעכב את הופעת EHS או להפחית את הנזק הרב-איברי המאפיין ביטוי זה.

Introduction

שבץ חום מאופיין בתפקוד מערכת העצבים המרכזית ונזק לאיברים הבאים בנבדקים היפרתרמיים¹. ישנם שני ביטויים של מכת חום. מכת חום קלאסית (CHS) משפיעה בעיקר על אוכלוסיות קשישים במהלך גלי חום או ילדים שנותרו בכלי רכב חשופי שמש במהלך ימי הקיץ החמים¹. מכת חום מאמץ (EHS) מתרחשת כאשר יש חוסר יכולת thermoregulate כראוי במהלך מאמץ פיזי, בדרך כלל, אבל לא תמיד, תחת טמפרטורות סביבה גבוהות וכתוצאה מכך תסמינים נוירולוגיים, היפרתרמיה, ולאחר מכן תפקוד רב איברים ונזק². EHS מתרחשת ספורטאי פנאי ואליטה, כמו גם אנשי צבא ובפועלים עם ובלי התייבשות במקביל^3,4. ואכן, EHS הוא הגורם המוביל השלישי לתמותה אצל ספורטאים במהלך פעילות גופנית⁵. זה מאוד מאתגר ללמוד EHS בבני אדם כמו הפרק יכול להיות קטלני או להוביל לתוצאות בריאותיות שליליות לטווח ארוך^6,7. לכן, מודל פרה קליני אמין של EHS יכול לשמש ככלי רב ערך כדי להתגבר על המגבלות של תצפיות קליניות רטרוספקטיביות אסוציאטיביות בקורבנות EHS אנושיים. דגמים פרה-קליניים של CHS במכרסמים וחזירים אופיינו היטב^8,9,10. עם זאת, מודלים פרה-אקליניים של CHS אינם מתורגמים ישירות לפתופיזיולוגיה EHS בשל ההשפעות הייחודיות של פעילות גופנית על הפרופיל התרמו-ריאלטורי ותגובה חיסונית^{מולדת 11}. בנוסף, ניסיונות קודמים לפתח מודלים פרה-אקליניים של EHS במכרסמים הציבו הגבלות משמעותיות, כולל גירויי לחץ מובחרים הנגרמים על ידי הלם חשמלי, החדרת בדיקה רקטלית וטמפרטורות גוף בסיסיות מוגדרות מראש עם שיעורי תמותה גבוהים^{12,13,14,15,16} שאינם תואמים את הנתונים האפידמיולוגיים הנוכחיים. אלה מייצגים מגבלות משמעותיות שעלולות לבלבל את פרשנות הנתונים ולספק מדדי סמנים ביולוגיים לא אמינים. לכן, הפרוטוקול נועד לאפיין ולתאר את הצעדים של מודל פרה-קליני מתוקנן, חוזר על עצמו וניתן לתרגום של EHS בעכברים, שהוא ברובו חופשי מהמגבלות שהוזכרו לעיל. התאמות למודל שיכולות לגרום לתוצאות פיזיולוגיות מדורגות ממכת חום בינונית עד קטלנית מתוארות. למיטב ידיעת המחברים, זהו המודל הקדם-אקליני היחיד של EHS עם מאפיינים כאלה, מה שמאפשר להמשיך במחקר EHS רלוונטי באופן מונחה השערה^11,17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים נבדקו ואושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת פלורידה. עכברים זכרים או נקבות C57BL/6J, ~ 4 חודשים, במשקל בטווח של 27-34 גרם ו 20-25 גרם, בהתאמה, משמשים למחקר.

1. השתלה כירורגית של מערכת ניטור הטמפרטורה הטלמטרית

1. עם ההגעה מהמוכר, אפשר לבעלי החיים לנוח בויבריום לפחות שבוע לפני הניתוח כדי למזער את הלחץ של התחבורה.
2. קבוצה בית העכברים (מקסימום של 5 לכלוב על פי הנחיות IACUC מקומיות) עד יום הניתוח להשתלת מכשיר טלמטרי טמפרטורה. שלם אותם בכלובים סטנדרטיים 7.25" (W) x 11.75" (L) x 5" (H) המכילים מצעים של קלח תירס. לשמור על מחזור האור על מחזור אור 12 x 12 (על: 7 בבוקר; כבוי: 7 בערב). לשמור על טמפרטורת הדיור ב 20-22 °C (50 °F) ולחות יחסית (RH) ב 30%-60%. ספק את דיאטת הצ'או הסטנדרטית ואת ליביטום אדי המים עד לפרוטוקול EHS.
   הערה: הרציונל לדיור יחיד הוא להימנע מפגיעה תכופה בלחימה בעכברים זכר C57bl/6J ולספק הזדמנות בשפע לריצה ספונטנית של גלגל לכל עכבר.
3. למיקום התקני הטלמטריה, יש להרדים את העכבר עם איזופלוריין (4%, 0.4-0.6 ליטר/דקה של זרימת O₂₎ בתא אינדוקציה. לאחר מכן, מניחים את העכבר תחת הרדמה רציפה באמצעות חרוט באף (1.5%, 0.6 ליטר / דקה).
4. יש להשתמש חומר סיכה לעיניים, כגון משחת וטרינר, כדי להגן על עיני החיה מפני נזק או פציעה במהלך הניתוח.
5. כדי להכין את האתר הכירורגי, לגלח את הבטן התחתונה עם קוצץ שיער בעלי חיים קטן או להשתמש מסיר שיער זמין מסחרית. לנהל את המנה הראשונה של buprenorphine תת עורי (0.1 מ"ג/ק"ג) במהלך תקופה זו.
6. לשפשף את האזור עם שלוש שטיפות של povidone-יוד (או קרצוף חיידקים דומה) ואחריו 70% שטיפת אלכוהול איזופרופיל (או מלוחים סטריליים בהתאם לדרישות וטרינריות מקומיות). לאחר מכן, העבר את העכבר לאזור הניתוח.
7. השתמש בוילונות דבק כדי לבודד את האתר הכירורגי על העכבר. באמצעות מכשירים סטריליים וטכניקה אספטית, לבצע חתכה ~ 1 ס"מ בקו האמצע לאורך אלבה לינאה, כ 0.5 ס"מ מן השוליים היקרים. לאחר מכן, להפריד את העור משכיית השריר ולעשות ירידה קטנה מעט יותר על אלבה לינאה, זהיר לא לפגוע במעיים או איברים פנימיים.
8. לאחר ששכבת השריר פתוחה, הניחו את הטלמטר הסטרילי (מכשיר רדיו-מדידת מטרדיה זעיר רב פעמי ללא סוללה; 16.5 x 6.5 מ"מ) לתוך חלל התוך-פריתוניאלי מול העורקים והוורידים הססנים וגב לאיברים העיכול כדי לאפשר לו לצוף בחופשיות.
   הערה: כל הטלמטרים מנוקים עם מים וסבון, שטופים ביסודיות וגז מעוקר עם תחמוצת אתילן בין השימושים. אם עיקור הגז אינו זמין, טבילה בפתרונות עיקור (בעקבות המלצת היצרן לזמן דילול וטבילה) מתקבלת לחיטוי וחיטוי הטלמטרים.
9. סגור את פתח הבטן עם תפר סטרילי 5-0 נספג, ולסגור את העור באמצעות תפר פשוט מופרע עם תפר פרולין 5-0.
   הערה: מתן אפשרות לטלמטר לצוף בתא הבטן מבלי לקשר אותו לקיר הבטן (שיטה המומלצת על ידי היצרן) הוכח כמוצלח ומועדף על ידי המחברים כדי למנוע מתח עודף בדופן הבטן במהלך הריפוי. יתר על כן, אין לכך כל השפעה על יכולתו של המקלט להשיג את האות מהמפלט.
10. מניחים את העכבר בכלוב הנקי שלו עם כרית חימום ניידת מתחת לכלוב. לפקח על העכבר כל 15 דקות במהלך השעה הראשונה של התאוששות מהרדמה, ולאחר מכן לחזור למתקן דיור בעלי חיים.
11. לספק עכברים עם זריקות buprenorphine תת עורי כל 12 שעות עבור 48 שעות במהלך ההתאוששות ולהמשיך לעקוב אחר סימני מצוקה. אם זמין, לתת בופרנורפין שחרור איטי תת עורית כל 24 שעות (1 מ"ג/ק"ג) עבור 48 שעות. אפשר לעכברים להתאושש במשך ~ 2 שבועות לאחר הניתוח לפני הצגת גלגל מרצון פועל.

2. היכרות: ריצת גלגל מרצון וכפויה

1. לאחר החלמה מניתוח, הניחו את גלגלי הריצה מרצון בכלוב לגישה חופשית לגלגל. בחירות אחרות של גלגלי ריצה עשויות להיות יעילות באותה מידה, אך להבטיח שהן מתאימות לגדלי הכלוב המוגבלים הזמינים.
   הערה: גלגלי הריצה היו צריכים להיות מופחתים מעט בממד כדי להתאים לכלוב סטנדרטי.
2. התאקלם בעכבר לגלגל ההתנדבותי בכלוב במשך שבועיים. לאחר התאקלמותו, העכבר מוכן לאימון עם הליכי היכרות עם גלגלי הריצה הכפויים.
3. בצע את ארבעת האימונים (יום/יום) בתא הסביבתי בטמפרטורת החדר (כ-25 מעלות צלזיוס, 30% לחות יחסית).
   הערה: למרות שזה אידיאלי, עכברים הוכשרו בהצלחה גם גלגלי ריצה מאולצים זהים מחוץ לתא. לאחר מכן ניתן לאמן מספר עכברים בו זמנית מבלי להפריע לשימוש בתא.
4. כדי להתחיל את האימון הראשון, אפשר לעכבר גלגל חופשי בגלגל הריצה שהשתנה למשך 15 דקות על ידי הסרה או התרופפות של חגורת הכונן המנוע כדי לאפשר לעכבר לקבוע את מהירות הגלגל ולהתאקלם אליו בצורה לא מלחיצה.
   הערה: פרוטוקולים יכולים להיות מופעלים עם תוכנה וחומרה המסופקים על ידי יצרן גלגל הריצה או עשויים להיות מוחלפים על ידי ספק כוח חיצוני לתכנות כי הוא קווית ישירות למנוע גלגל, המאפשר אוטומציה של פרוטוקול התרגיל המצטבר.
5. כייל את המערכת עבור כל גלגל ריצה כדי לקבוע את הקשר בין מתח ספק הכוח לבין מטרים/דקה (מ'/דקה) של כל גלגל.
   הערה: גלגלי הריצה הכפויים שונו גם כדי להעלות את המנוע 15 ס"מ, הפוך ולהזיז את הגלגלת המניעה את הגלגל עד 5 ס"מ מעל פלטפורמת מקלט הטלמטריה. זה הבטיח כי פלטפורמת המקלט השיגה נתוני טלמטריה מדויקים במהלך פרוטוקול הריצה ללא הפרעה מהמנוע.
6. לאחר תקופת מנוחה קצרה (<5 דקות), הפעל את פרוטוקול גלגל הריצה הכפוי. התחל את הגלגל ב 2.5 מ '/דקה ולהגדיל 0.3 מ '/דקה כל 10 דקות בסך הכל 1 שעה כדי לחקות את השעה הראשונה של משפט EHS בפועל, אבל בטמפרטורת החדר. החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו ואפשר התאוששות של 24 שעות. נהל את שלושת מפגשי הריצה הכפויים הבאים באותו אופן בימים רצופים. אחרי היום הראשון, החלק של התאקלות גלגל חופשי הוא מיותר.
7. אפשר לעכבר 2-3 ימים של שטיפה או התאוששות מהלחץ של תרגול גלגל הריצה הכפוי, אך אפשר לעכבר גישה חופשית לגלגל ההתנדבותי של הכלוב הביתי. העכבר מוכן כעת לעבור את פרוטוקול EHS.

3. פרוטוקול EHS

1. בלילה שלפני פרוטוקול EHS, הנח את העכבר בתא הסביבתי בטמפרטורת החדר (~ 25 °C (~ 25 °C (25 °F, ≈30% לחות יחסית) כדי להתאקלם לתא.
2. השתמש במערכת רכישת נתונים כדי לאסוף Tc רציף, בממוצע מעל 30-s מרווחים בן לילה.
3. בבוקר פרוטוקול EHS, ודא שהעכבר נמצא בטווח רגיל של טמפרטורת יומיים או מתחתיו לפני העלאת טמפרטורת החדר (כלומר, 36-37 °C (37°F). זה מבטיח שלעכבר אין חום ולא חווה מתח מופרז בתקופה זו.
4. ברגע שהעכבר יציב ובטווח טמפרטורת הליבה הרגילה של מנוחה, הסר את המזון והמים ושקל את החיה. סגרו את דלת החדר והגדילו את טמפרטורת התא ליעד של 37 °C (5 °F) ו-40%-50% לחות יחסית, או את הטמפרטורה והלחות הסביבתית הרצויה¹⁹. אמת את טמפרטורת החדר והלחות באמצעות צג טמפרטורה ולחות מכויל.
5. הקיפו את החדר עם וילון האפלה כדי לשמור על אור והפרעות מינימליות במהלך הפרוטוקול. נטר את העכבר ברציפות במהלך הפרוטוקול באמצעות מצלמות IR מוארות מרחוק. מקד מצלמה שנייה על צג הטמפרטורה והלחות, ממוקם קרוב לגלגל הריצה. בצע את כל ההתאמות לבקר עבור הגדרת התא הסביבתי כדי להבטיח קריאות טמפרטורה מדויקות ליד החיה.
6. לאחר שהתא הגיע לטמפרטורת היעד שלו כפי שנמדד על ידי המצלמה השנייה על צג הטמפרטורה (זה יכול לקחת ~ 30 דקות), פתח במהירות את דלת החדר והנח את העכבר בגלגל הריצה הכפוי.
7. ליזום את פרוטוקול גלגל ריצה כפוי במהירות של 2.5 מ '/דקה ולהגדיל את המהירות 0.3 מ '/דקה כל 10 דקות עד העכבר מגיע Tc של 41 °C (5 °F). לאחר שהעכבר הגיע לטמפרטורת הליבה הזו, אפשר למהירות להישאר קבועה עד להגבלת סימפטום, המאופיינת באובדן הכרה לכאורה, נפילה לאחור או התעלפות, וחוסר היכולת להמשיך לרוץ או להיאחז בגלגל. אשר נקודת זמן זו כאשר לעכבר יש שלושה סיבובים לאחור על ההגה ללא סימנים של תגובה פיזית. לחלופין, זהה נקודת קצה הומאנית בהתאם לכללי IACUC המקומיים כדי לקבוע מתי להפסיק את הפרוטוקול (למשל, כאשר Tc ~ 43 °C ). נקודת קצה זו היא מעט מעל מגבלת סימפטום בעצם כל העכברים.
8. כדי לבצע את פרוטוקול הקירור המהיר (R), ברגע שהעכבר מגיע למגבלת התסמינים, עצור את הגלגל והסר אותו מיד מגלגל הריצה הכפוי. שקול את העכבר והחזיר אותו לכלוב הביתי שלו כדי להתאושש בטמפרטורת החדר. במהלך תקופה זו, להשאיר את דלת החדר פתוח ולהחזיר את האינקובטור להגדיר נקודה לטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתא להתקרר במהירות. הליך זה גורם להישרדות ארוכת טווח של >99%.
9. כדי לבצע חשיפה חמורה יותר (S) EHS, שמור על הכלוב הביתי של החיה בתוך תא 37 °C (37°C) במהלך פרוטוקול EHS. כאשר החיה מגיעה למגבלת התסמינים, אפשר להם להישאר בגלגל הריצה עד שהם חוזרים לתודעה כפי שנצפה על ידי המצלמה המרוחקת (~ 5-9 דקות).
10. לאחר מכן הסירו במהירות את העכבר מגלגל הריצה והחזירו אותו ישירות לכלוב שהתחמם מראש כדי לגרום לפרופיל קירור איטיבהרבה (איור 1A,קו מקווקו אדום), ולמעשה מבטלים את השלב ההיפותרמי EHS. הסר את החלק העליון של המסנן מהכלוב במהלך תקופה זו כדי לשפר את שיווי משקל עם התא.
11. השתמש בכלוב התאוששות מראש לטמפרטורת החדר כדי לבצע הליך חלופי פחות חמור כדי לגרום לשלב היפותרמי מדוכא אבל עם שיעור הישרדות של 100%²⁰.
12. עבור פרוטוקול S, נטר בקפידה את העכבר במהלך השחזור ובדוק ברציפות אם קיימות נקודות קצה הומאנות. למרות שקשה לבדוק מרחוק נקודות קצה הומאנות נפוצות (למשל, רפלקס ימין), התבונן בעכברים מרחוק לתנועות רגילות במהלך ההתאוששות כגון טיפוח, נשימה רגילה, ליקוק וכו '. לפקח על TC במהלך תקופה זו.
13. עכברים לא סביר להתאושש אם טמפרטורת הליבה שלהם הופכת כיוון במהלך שלב ההתאוששות, בסופו של דבר עולה על 40 °C (50 °F); בשלב זה, לסיים את הניסוי ולהעריך את העכבר עבור נקודות קצה אנושיות סטנדרטיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרופילים התרמו-גולטוריים הטיפוסיים במהלך כל פרוטוקול EHS ושחזור מוקדם של עכבר מודגמים באיור 1A. פרופיל זה כולל ארבעה שלבים נפרדים שניתן להגדיר כשלב חימום התא, שלב פעילות גופנית מצטברת, שלב פעילות גופנית במצב יציב, ושלב התאוששות על ידי שיטת קירור מהירה (R) או חמורה (S)^...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

סקירה טכנית זו שואפת לספק קווים מנחים לביצועים של מודל פרה-אקליני של EHS בעכברים. שלבים וחומרים מפורטים הנדרשים לביצוע פרק EHS לשחזור של חומרות משתנות מסופקים. חשוב לציין, המודל מחקה במידה רבה את הסימנים, הסימפטומים, ותפקוד לקוי מרובה איברים שנצפו בקורבנות EHS^{אנושיים 11,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1080P HD 4 Security Cameras 4CH Home Video Security Camera System w/ 1TB HDD 2MP Night View Cameras CCTV Surveillance Kit	LaView
5-0 Coated Vicryl Violet Braided	Ethicon
5-0 Ethilon Nylon suture Black Monofilament	Ethicon
Adhesive Surgical Drape with Povidone 12x18	Jorgensen Labset al.
BK Precision Multi-Range Programmable DC Power Supplies Model 9201	BK Precision
DR Instruments Medical Student Comprehensive Anatomy Dissection Kit	DR Instruments
Energizer Power Supply	Starr Life Sciences
G2 Emitteret al.	Starr Life Sciences
Layfayette Motorized Wheel Model #80840B	Layfayette
Patterson Veterinary Isoflurane	Patterson Veterinary
Platform receiveret al.	Starr Life Sciences
Scientific Environmental Chamber Model 3911	ThermoForma
Training Wheels	Columbus Inst.