חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.

Abstract

גרורות, המהוות כ-90% מהתמותה הקשורה לסרטן, כוללת התפשטות מערכתית של תאים סרטניים מגידולים ראשוניים לאתרים משניים כגון העצם, המוח והריאה. למרות שנחקר בהרחבה, הפרטים המכניסטיים של תהליך זה נשארים מובנים היטב. בעוד שמודליות הדמיה נפוצות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI), מציעות דרגות שונות של הדמיה גסה, כל אחת מהן חסרה את הרזולוציה הזמנית והמרחבית הדרושה כדי לזהות את הדינמיקה של תאי גידול בודדים. כדי לטפל בכך, טכניקות רבות תוארו עבור הדמיה תוך-וינטלית של אתרים גרורתיים נפוצים. מתוך אתרים אלה, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד לגישה להדמיה תוך-ויאלית בשל עדינותה ותפקידה הקריטי בשמירה על החיים. למרות מספר גישות תוארו בעבר עבור הדמיה תוך-וינטלית של תא יחיד של הריאה שלם, כל כרוך מאוד פולשני הליכים סופני, הגבלת משך ההדמיה המרבי האפשרי ל 6-12 שעות. מתואר כאן טכניקה משופרת להשתלה קבועה של חלון אופטי בית החזה זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL). בשילוב עם גישה מותאמת למיקרוקרטוגרפיה, החלון האופטי החדשני מאפשר הדמיה תוך-וינטלית סדרתית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני מפגשי הדמיה מרובים ומשתרע על פני מספר שבועות. בהתחשב במשך הזמן חסר התקדים שבו ניתן לאסוף נתוני הדמיה, WHRIL יכול להקל על גילוי מואץ של המנגנונים הדינמיים שבבסיס ההתקדמות גרורתית ותהליכים ביולוגיים רבים נוספים בתוך הריאה.

Introduction

אחראי ~ 90% ממקרי המוות, גרורות הוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן¹. בין האתרים העיקריים של גרורות שנצפו קלינית (עצם, כבד, ריאות, מוח)², הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד עבור הדמיה in vivo באמצעות מיקרוסקופיה תוך ויאלית. הסיבה לכך היא שהריאה היא איבר עדין בתנועה מתמדת. התנועה המתמשכת של הריאות, המורכבת עוד יותר על ידי תנועת לב תוך-גזעית, מהווה מחסום משמעותי להדמיה מדויקת. לכן, בשל חוסר נגישותה היחסית לאופנה להדמיה אופטית תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה, צמיחת הסרטן בתוך הריאה נחשבה לעתים קרובות לתהליך נסתר³.

בסביבה הקלינית, טכנולוגיות הדמיה כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI) מאפשרות הדמיה עמוק בתוך איברים חיוניים שלמים כגון הריאה⁴. עם זאת, בעוד שיטות אלה מספקות תצוגות מצוינות של האיבר ברוטו (לעתים קרובות אפילו חושף פתולוגיה לפני הופעת הסימפטומים הקליניים), הם ברזולוציה לקויה כדי לזהות תאים סרטניים מופצים בודדים כפי שהם מתקדמים דרך השלבים המוקדמים של גרורות. כתוצאה מכך, עד שהמודל הנ"ל מספק כל אינדיקציה לגרורות לריאה, מוקדים גרורתיים כבר מבוססים ומתרבים היטב. מאז microenvironment הגידול ממלא תפקיד מרכזי בהתקדמות הסרטן היווצרות גרורות^5,6, יש עניין רב לחקור את השלבים המוקדמים ביותר של זריעה גרורתית ב vivo. עניין זה מתודלק עוד יותר על ידי ההערכה המוגברת שתאים סרטניים מופצים עוד לפני שהגידול העיקרי מזוהה^7,8 והראיות הגוברות לכך שהם שורדים כתאים בודדים ובמצב רדום במשך שנים עד עשרות שנים לפני שנשרים לתוך מאקרו-גרורות⁹.

בעבר, הדמיה של הריאה ברזולוציה של תא אחד כללה בהכרח תכשירים ex vivo או explant^10,11,12,13, הגבלת ניתוחים לנקודות זמן בודדות. בעוד שתכשירים אלה מספקים מידע שימושי, הם אינם מספקים כל תובנה על הדינמיקה של תאים סרטניים בתוך האיבר המחובר למערכת מחזור שלמה.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בהדמיה אפשרה הדמיה תוך-וינטלית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני תקופות של עד 12 שעות^14,15,16. זה נעשה במודל מורין באמצעות פרוטוקול שכלל אוורור מכני, כריתה של בית החזה, ושתקת ריאות בסיוע ואקום. עם זאת, למרות המציע את התמונות הראשונות ברזולוציה של תא בודד של הריאה השלם מבחינה פיזיולוגית, הטכניקה היא פולשנית מאוד סופני, ובכך מונע מפגשי הדמיה נוספים מעבר להליך האינדקס. מגבלה זו, אם כן, מונעת את יישומה לחקר צעדים גרורתיים הנגזרים מ- 12 שעות, כגון רדומים וייזום מחדש של צמיחה^14,15,16. יתר על כן, דפוסים של התנהגות תאית שנצפו באמצעות גישה הדמיה זו חייבים להתפרש בזהירות, בהתחשב בכך הפרשי לחץ הנגרמים על ידי ואקום עלולים לגרום הסחות בזרימת הדם.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותח לאחרונה חלון זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL), המקלה על הדמיה סדרתית על פני תקופה ממושכת של ימים עד שבועות, ללא צורך באוורור מכני¹⁷. הטכניקה כרוכה ביצירת 'בית החזה שקוף' עם חלל בית החזה אטום לשימור תפקוד תקין של הריאות. ההליך נסבל היטב, ומאפשר לעכבר להתאושש ללא שינוי משמעותי בפעילות הבסיסית ובתפקוד. כדי אמין לוקליזציה בדיוק באותו אזור ריאות בכל מפגש הדמיה בהתאמה, טכניקה המכונה microcartography הוחל על חלון זה¹⁸. דרך חלון זה, ניתן היה ללכוד תמונות של תאים כשהם מגיעים למיטת כלי הדם של הריאה, חוצים את האנדהותל, עוברים חלוקת תאים וגדלים למיקרו גרורות.

כאן, המחקר מציג תיאור מפורט של פרוטוקול כירורגי משופר להשתלה של WHRIL, אשר מפשט את הניתוח ובו זמנית להגדיל את יכולת הרבייה והאיכות שלה. בעוד פרוטוקול זה נועד לאפשר חקירה של התהליכים הדינמיים שבבסיס גרורות, הטכניקה עשויה להיות מיושמת לחילופין על חקירות של תהליכים רבים של ביולוגיה ריאות ופתולוגיה.

Protocol

כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לשימוש בבעלי חיים.

1. פסיבציה של חלונות

1. שטפו את מסגרות החלונות האופטיות (איור משלים 2) עם פתרון של 1% (w/v) של חומר ניקוי פעיל אנזימטית.
2. בתוך צנצנת זכוכית, להטביע את מסגרות החלון האופטי 5% (w / v) פתרון נתרן הידרוקסיד במשך 30 דקות ב 70 °C (70 °F).
3. הסר ושטוף את מסגרות החלון במים דה-יוניים.
4. בתוך צנצנת זכוכית חדשה, להטביע את מסגרות החלון האופטי 7% (w / v) פתרון חומצת לימון במשך 10 דקות ב 55 °C (55 °F).
5. שוב, להסיר ולשטוף את מסגרות החלון עם מים deionized.
6. חזור על שלב 1.2; לאחר מכן, להסיר ולשטוף מסגרות חלון עם מים deionized.

2. הכנה לניתוח

1. לבצע את הניתוח במכסה המנוע או בארון זרימה למינאר. כדי למנוע זיהום של השדה האופרטיבי, להבטיח אזורים נפרדים ומופרדים להכנה, ניתוח, והתאוששות, בהתאמה.
2. לקראת הניתוח, לעקר את כל המכשירים הכירורגיים ב autoclave. אם ההליכים הבאים מתוכננים, לעקר מחדש מכשירים באמצעות מחטא חרוזים חם. עבור הליך כירורגי זה, טכניקה טיפים בלבד משמש.
3. כוח על חרוז כירורגי מחומם וחיטוי חרוזים.
4. להנשים את העכבר עם 5% איזופלוראן בתא ההרדמה.
5. כדי להסיר את השיער, יש למרוח בנדיבות קרם דפילטורי על אתר ההסתה של החזה השמאלי העליון. לאחר לא יותר מ 20 s, לנגב בחוזקה את השיער ואת קרם depilatory באמצעות נייר טישו לח. יש לחזור על הפעולה לפי הצורך כדי להסיר את כל השיער מאתר הניתוח.
6. בעזרת תפר משי 2-0, קשרו קשר בבסיס צנתר 22 גרם, והותירו זנבות באורך 2 אינץ' (ראו איור 1A).

3. ניתוח חלון ריאות

1. יש לשטוף ידיים באמצעות סבון חיטוי.
2. לפני כל ניתוח חדש, דון כפפות סטריליות חדשות.
3. כדי למנוע ייבוש קרנית ונזק לעיני העכבר, יש למרוח משחה עיניים על שתי העיניים.
4. לדלל 10 μL (0.1 מ"ג/ק"ג) של buprenorphine ב 90 μL של PBS סטרילי, ולאחר מכן להזריק תת עורית כדי להבטיח מנטל לפני הניתוח.
5. צנררו את העכבר עם צנתר 22 גרם קשור לתבל משי¹⁵. באמצעות נורת אינפלציה, לאשר צנרור מוצלח על ידי ציין עליית חזה דו צדדית על לחיצת נורה.
6. אבטחו את צנתר הצנרור על ידי קשירת תבר המשי 2-0 סביב חוטמו של העכבר (ראו איור 1B).
7. מניחים את העכבר על הדוכן הכירורגי המחומם וממקמים אותו בדקוביטוס לרוחב ימין כדי לחשוף את בית החזה השמאלי.
8. חבר את מכונת ההנשמה לקטטר הצנרור.
9. ודא אוורור מבוקר ויציב על מכונת ההנשמה ולאחר מכן להוריד את isofluorane ל 3%. בתחילת ההליך ומדי פעם לאורך כל ההליך, להעריך את ההתאמה של הרדמה על ידי ביצוע בדיקת צביטת הבוהן.
10. באמצעות סרט נייר, מאובטחים באופן קרני ובאופן גס את הגפיים הקדמיות והי האחוריות, בהתאמה, לשלב הניתוח המחומם. מקם פיסת סרט נוספת לאורך גב העכבר כדי למקסם את החשיפה לשדה הניתוחי (ראו איור 1C).
11. פתח את כל המכשירים הכירורגיים מתחת למכסה המנוע לשימור סטריליות.
12. לחטא את האתר הכירורגי על ידי יישום נדיב של חיטוי לעור של העכבר.
13. באמצעות מלקחיים, הרימו את העור ובצעו חתך מעגלי ~ 10 מ"מ, ~ 7 מ"מ משמאל לחזה החזה ו ~ 7 מ"מ מעולה על השוליים התת-ציליים (איור 1D).
14. זהה בזהירות כל כלי שיט עיקרי. אם חלוקת כלי הדם נחוצה, לצרוב בשני קצות עם עט electrocautery כדי לשמור על hemostasis.
15. לחתוך את הרקמה הרכה מעל הצלעות.
16. הגבה את הצלע^השישית או^{השביעית} באמצעות מלקחיים. באמצעות להב יחיד של המספריים המיקרו-ניתוח קהים, הצד המעוגל לכיוון הריאה, חודר בזהירות את השריר הבין-צלעי בין^{הצלעות 6} ו-7 כדי להיכנס לחלל התוך-אתורי(איור 1E).
17. פריקה עדינה של מיכל אוויר דחוס בפגם כדי למוטט את הריאה ולהפריד אותה מקיר החזה. תדליקו את האוויר הדחוס בהתפרצויות קצרות כדי למנוע פגיעה ריאות יטרוגנית.
18. הניחו את אגרוף הביופסיה מעל כלי החיתוך(איור 1 משלים)ותמרנו בזהירות את בסיס כלי החיתוך באמצעות החתך הבין-צלעי (איור 1F).
19. כוון את הבסיס של כלי החיתוך כך שהוא מקביל לקיר החזה. נקבו חור עגול בקורס 5 מ"מ דרך כלוב הצלעות(איור 1G).
    הערה: ודא כי רקמת הריאה החשופה היא ורודה, ללא סימני נזק.
20. בעזרת תפר משי 5-0, צור תפר חוט ארנק ~ 1 מ"מ מהחור, בהיקף, שזור עם הצלעות(איור 1H).
21. מקם את מסגרת החלון כך שקצוות הפגם המעגלי יתיישרו בתוך החריץ של החלון (ראו איור 1I).
22. נעלו היטב את החלון המושתל על ידי תיוץ הדוק של תיל המשי 5-0.
23. טען 100 μL של דבק ג'ל ציאנואקרילט לתוך מזרק 1 מ"ל.
24. יבש את הריאה על ידי החלת זרם עדין יציב של אוויר דחוס עבור ~ 10-20 s(איור 1J).
25. באמצעות מלקחיים כדי לאחוז במסגרת החלון בקצה החיצוני שלה, הרם בעדינות כדי להבטיח הפרדה של הריאה מהפנים התחתיות של מסגרת החלון.
26. יש לפזר שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט לאורך הפנים התחתיות של מסגרת החלון האופטית(איור 1K).
27. להגביר את הלחץ הסופי-תפוגה החיובי (PEEP) על מכונת ההנשמה כדי לנפח את הריאה.
28. מחזיקים במשך 10-20 שניות, מפעילים לחץ עדין אך מוצק כדי לחבר את מסגרת החלון האופטית לרקמת הריאה(איור 1L).
29. יש לפזר טיפה של 5 מ"מ של דבק ג'ל הציאנואקרילט הנותר על כיסוי מלבני.
30. הרימו את כיסוי ה-5 מ"מ באמצעות טנדרים ואקום. טובלים את הפנים התחתונות של כיסוי הדבק לתוך הדבק, ולאחר מכן לגרד את דבק עודף שלוש פעמים על הצד של כיסוי מלבני, כך שרק שכבה דקה מאוד נשארה (איור 1M).
31. מקם בזהירות את כיסוי כדי להתאים בתוך ההפסקה במרכז מסגרת החלון האופטי והוא מוחזק מעל רקמת הריאה בזווית. לחץ בקצרה על מכונת ההנשמה כדי ליצור לחץ חיובי, מנפח את הריאה. באמצעות תנועה מסתובבת, כוון את כיסוי מקביל לרקמת הריאה כדי ליצור פריסה ישירה בין פני הריאה לבין הפנים התחתיות של כיסוי. שמור על לחץ עדין, ומאפשר דבק cyanoacrylate להגדיר (~ 25 s).
32. השתמשו במלקחיים כדי להפריד את הכיסויים מאיסוף הוואקום(איור 1N).
33. באמצעות תפר משי 5-0, שוב ליצור תפר ארנק מחרוזת, הפעם <1 מ"מ בהיקף מן הקצה לחתוך של חתך העור. יש לתחוב עור עודף מתחת לשפה החיצונית של מסגרת החלון לפני קשירתו בחוזקה עם קשרים נעילה.
34. כדי להבטיח אטם הדוק אוויר בין כיסוי למסגרת החלון, יש לחלק כמות קטנה של ציאנואקרילט נוזלי בממשק הזכוכית המתכתית (ראו איור 1O).
35. חבר מחט סטרילית למזרק אינסולין 1 מ"ל. הכנס את המחט מתחת לתהליך xiphoid, מתקדם לכיוון הכתף השמאלית, נכנס לחלל בית החזה דרך הסרעפת. יש לסגת בעדינות מהמזרק כדי להסיר כל שאריות אוויר מחלל בית החזה (ראו איור 1P).
36. הסר את הקלטת מהעכבר.
37. כבה איזופלוראן.
38. המשך אוורור עם 100% חמצן עד שהעכבר נראה מוכן להתעורר.
39. חותכים בזהירות את תפר המשי 2-0 סביב חוטם העכבר ומסלקים את העכבר.
40. העבר את העכבר לכלוב נקי ולפקח עד להתאוששות מלאה. המתת חסד את העכבר אם קיימים סימנים של קושי בנשימה.
41. ספק שך מזיק לאחר הניתוח על ידי הזרקה תת עורית 10 μL (0.1 מ"ג/ קילוגרם) של buprenorphine מדולל ב 90 μL של פתרון חוצץ פוספט סטרילי (PBS).

תוצאות

שלבי ההליך הכירורגי המתואר בפרוטוקול זה מסוכמים ומאוירים באיור 1. לזמן קצר, לפני הניתוח, עכברים הם מרדים ואת השיער מעל בית החזה השמאלי מוסר. עכברים מצנררים ומאווררים מכנית כדי לאפשר הישרדות עם פריצת חלל בית החזה. רקמות רכות מעל הצלעות נקטעות, ונוצר פגם מעגלי קטן, המשתרע על צ...

Discussion

באתרים של גרורות רחוקות כגון הריאה, הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה מספקת תובנה על הדינמיקה המשוכללת של גרורות תאים סרטניים. על ידי הפעלת הדמיה של תאים סרטניים בודדים והאינטראקציות שלהם עם הרקמה המארחת, הדמיה תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה הוכיחה את עצמה כמכשיר להבנת המנגנונים הבסיסיים ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Brass window tool holder	N/A	N/A	Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112