A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית. MMC יכול לטפח ולטפח מיקרואורגניזמים באופן אוטומטי ורציף ולנטר באינטרנט את צמיחתם באופן מקוון עם תפוקה גבוהה יחסית והמקבילות טובות, מה שמפחית את צריכת העבודה והריאגנטים.

Abstract

שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות כוללות בדרך כלל פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. יתר על כן, לשיטות גידול בתפוקה גבוהה המבוססות על מיקרו-פלטות שפותחו בשנים האחרונות יש מצב גידול מיקרוביאלי ירוד והקבלה ניסיונית בגלל החמצן המומס הנמוך שלהן, תערובת לקויה, אידוי חמור והשפעה תרמית. בשל יתרונות רבים של מיקרו-טיפות, כגון נפח קטן, תפוקה גבוהה ויכולת שליטה חזקה, הטכנולוגיה המיקרופלואידית מבוססת הטיפות יכולה להתגבר על בעיות אלה, אשר שימשה בסוגים רבים של מחקר של טיפוח מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה, סינון ואבולוציה. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים נשארים בשלב של בנייה ויישום מעבדה. כמה סוגיות מרכזיות, כגון דרישות תפעוליות גבוהות, קשיי בנייה גבוהים והיעדר טכנולוגיית אינטגרציה אוטומטית, מגבילים את היישום הרחב של טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות במחקר מיקרוביאלי. כאן, מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) פותחה בהצלחה על בסיס טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות, והשיגה שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור מקוון, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך גידול הטיפות המיקרוביאליות. בפרוטוקול זה, Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג פראי וזן E. coli חיוני למתנול (MeSV2.2) נלקחו כדוגמאות כדי להציג כיצד להשתמש ב- MMC כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ובעל תפוקה גבוהה יחסית ואבולוציה מסתגלת בפירוט. שיטה זו קלה לתפעול, צורכת פחות עבודה וריאגנטים, ויש לה תפוקה ניסיונית גבוהה ומקבילות נתונים טובות, שיש לה יתרונות גדולים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול ואמינה לתוצאה עבור חוקרים מדעיים לביצוע מחקר מיקרוביאלי קשור.

Introduction

גידול מיקרוביאלי הוא בסיס חשוב למחקר מדעי מיקרוביולוגי וליישומים תעשייתיים, הנמצא בשימוש נרחב בבידוד, זיהוי, שחזור, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים 1,2,3. שיטות גידול מיקרוביאליות קונבנציונליות משתמשות בעיקר במבחנות, צלוחיות שייק ולוחות מוצקים כמיכלי גידול, בשילוב עם אינקובטורים רועדים, ספקטרופוטומטרים, קוראי מיקרו-פלטות וציוד אחר לטיפוח, גילוי וסינון מיקרוביאליים. עם זאת, לשיטות אלה יש בעיות רבות, כגון פעולות מסורבלות, תפוקה נמוכה, יעילות נמוכה וצריכה גדולה של עבודה וריאגנטים. שיטות הטיפוח בתפוקה גבוהה שפותחו בשנים האחרונות מבוססות בעיקר על המיקרו-לוחית. אבל למיקרו-פלטה יש רמה נמוכה של חמצן מומס, תכונת ערבוב ירודה, והתאדות חמורה והשפעה תרמית, שלעתים קרובות מובילים למצב צמיחה ירוד ולהקבלה ניסיונית של מיקרואורגניזמים 4,5,6,7; מצד שני, הוא צריך להיות מצויד בציוד יקר, כגון תחנות עבודה לטיפול בנוזל וקוראי מיקרו-פלטות, כדי להשיג טיפוח אוטומטי וזיהוי תהליכים 8,9.

כענף חשוב של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, מיקרופלואידיקה של טיפות פותחה בשנים האחרונות על בסיס מערכות מיקרופלואידיות מסורתיות של זרימה רציפה. זוהי טכנולוגיה מיקרופלואידית של זרימה בדידה המשתמשת בשני פאזות נוזליות בלתי חדירות (בדרך כלל מי שמן) כדי ליצור מיקרו-טיפות מפוזרות ולפעול עליהן10. מכיוון שלמיקרו-טיפות יש את המאפיינים של נפח קטן, שטח פנים ספציפי גדול, קצב העברת מסה פנימי גבוה, וללא זיהום צולב הנגרם על ידי מידור, והיתרונות של שליטה חזקה ותפוקה גבוהה של טיפות, היו סוגים רבים של מחקרים המיישמים טכנולוגיה מיקרופלואידית של טיפות בטיפוח, סינון ואבולוציה של מיקרואורגניזמים בתפוקה גבוהה11 . עם זאת, יש עדיין סדרה של בעיות מפתח כדי להפוך את הטכנולוגיה microfluidic טיפות פופולרי ויישם באופן נרחב. ראשית, פעולת המיקרופלואידיקה של טיפות היא מסורבלת ומורכבת, וכתוצאה מכך דרישות טכניות גבוהות למפעילים. שנית, טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות משלבת רכיבים אופטיים, מכניים וחשמליים וצריכה להיות קשורה לתרחישי יישום ביוטכנולוגיה. קשה למעבדה או לצוות יחיד לבנות מערכות בקרה מיקרופלואידיות טיפות יעילות אם אין שיתוף פעולה רב-תחומי. שלישית, בגלל הנפח הקטן של מיקרו-טיפות (מפיקוליטר (pL) למיקרוליטר (μL)), נדרש קושי רב כדי להבין את הבקרה האוטומטית המדויקת ואת הזיהוי המקוון בזמן אמת של טיפות עבור כמה פעולות מיקרוביאליות בסיסיות כגון תת-גידול, מיון ודגימה, וקשה גם לבנות מערכת ציוד משולבת12.

על מנת להתמודד עם הבעיות הנ"ל, פותחה בהצלחה מערכת תרבית מיקרו-טיפות מיקרוביאלית אוטומטית (MMC) המבוססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית טיפות13. ה- MMC מורכב מארבעה מודולים פונקציונליים: מודול זיהוי טיפות, מודול זיהוי ספקטרום טיפות, מודול שבב מיקרופלואידי ומודול דגימה. באמצעות אינטגרציה ובקרה של המערכת של כל המודולים, מערכת הפעלה אוטומטית כולל ייצור, טיפוח, מדידה (צפיפות אופטית (OD) ופלואורסצנציה), פיצול, היתוך, מיון של טיפות נקבע במדויק, השגת שילוב של פונקציות כגון חיסון, טיפוח, ניטור, תת-טיפוח, מיון ודגימה הנדרשים על ידי תהליך של טיפוח טיפות מיקרוביאליות. MMC יכול להכיל עד 200 יחידות גידול טיפות משוכפלות של נפח 2-3 μL, אשר שווה ערך ל -200 יחידות גידול של בקבוק שייק. מערכת גידול המיקרו-טיפות יכולה לספק את הדרישות של אי-זיהום, חמצן מומס, ערבוב והחלפת אנרגיה-מסה במהלך צמיחתם של מיקרואורגניזמים, ולענות על הצרכים השונים של מחקר מיקרוביאלי באמצעות פונקציות משולבות מרובות, למשל, מדידת עקומת גדילה, אבולוציה אדפטיבית, ניתוח רב-שכבתי של גורם יחיד, ומחקר וניתוח מטבוליטים (המבוססים על זיהוי פלואורסצנציה)13,14.

כאן, הפרוטוקול מציג כיצד להשתמש ב-MMC כדי לבצע טיפוח אוטומטי ומיקרוביאלי ואבולוציה אדפטיבית בפירוט (איור 1). לקחנו את Escherichia coli (E. coli) MG1655 מסוג בר כדוגמה כדי להדגים את מדידת עקומת הגדילה ואת זן E. coli החיוני למתנול MeSV2.215 כדי להדגים את האבולוציה ההסתגלותית ב-MMC. פותחה תוכנת הפעלה עבור MMC, מה שהופך את הפעולה לפשוטה וברורה מאוד. בכל התהליך, המשתמש צריך להכין את פתרון החיידקים הראשוני, להגדיר את התנאים של MMC, ולאחר מכן להזריק את תמיסת החיידקים ואת הריאגנטים הקשורים לתוך MMC. לאחר מכן, ה-MMC יבצע באופן אוטומטי פעולות כגון יצירת טיפות, זיהוי ומספור, טיפוח ואבולוציה אדפטיבית. הוא גם יבצע זיהוי מקוון (OD ופלואורסצנציה) של הטיפות ברזולוציית זמן גבוהה ויציג את הנתונים הקשורים (אותם ניתן לייצא) בתוכנה. המפעיל יכול לעצור את תהליך הטיפוח בכל עת על פי התוצאות ולחלץ את טיפות המטרה לניסויים הבאים. ה- MMC קל לתפעול, צורך פחות עבודה וריאגנטים, ויש לו תפוקה ניסיונית גבוהה יחסית ומקבילות נתונים טובות, שיש להן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות טיפוח קונבנציונליות. הוא מספק פלטפורמה ניסיונית זולה, ידידותית לתפעול וחזקה לחוקרים לביצוע מחקרים מיקרוביאליים קשורים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. התקנת מכשירים ותוכנה

  1. בחרו בסביבה נקייה וסטרילית (כגון ספסל נקי) כחלל קבוע ייעודי ל-MMC. התקן את ה- MMC בהתמדה בחלל.
    הערה: הרחיקו את ה-MMC מהפרעה של שדות חשמליים חזקים, שדות מגנטיים ומקורות קרינת חום חזקים. הימנע מרטט חמור מלהשפיע על רכיבי הגילוי האופטיים. ספק את ספק הכוח של AC220 V, 50 HZ ל- MMC. לפרטים על MMC עיין בטבלת החומרים ובאתר האינטרנט של MMC16.
  2. התקן את תוכנת הפעולה מקובץ MMC.zip
    הערה: צור קשר עם המחברים עבור הקובץ .zip MMC.
    1. צור תיקיה ייעודית ושמור בה את קובץ ה- zip.
    2. צור תיקיה ייעודית נוספת כ"ספריית ההתקנה ". פתח את ה- MMC.zip ושמור את הקבצים בתיקיה החדשה.
      הערה: תצורת המחשב היא הטובה ביותר לעמידה: (1) מערכת ההפעלה Windows 7 64 סיביות ומעלה; (2) מעבד: i5 ומעלה; (3) זיכרון: 4 ג'יגה-בתים ומעלה; (4) דיסק קשיח: 300 ג'יגה-בתים ומעלה (מהירות סיבוב העולה על 7,200 סל"ד או דיסק במצב מוצק).

2. הכנות

  1. חברו את מחט המזרק (הקוטר הפנימי הוא 0.41 מ"מ והקוטר החיצוני הוא 0.71 מ"מ), מחבר מהיר A ובקבוק ריאגנט (איור 2C), והצמידו אותם אוטומטית ל-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    הערה: פתח מעט את הפקק של בקבוק המגיבים במהלך העיקור. ניתן להכין עוד כמה בקבוקי ריאגנטים בכל פעם לשימוש.
  2. השתמש במסנן 0.22 מיקרומטר פוליווינילידן פלואוריד (PVDF) כדי לסנן שמן MMC. מכניסים מראש את השבב המיקרופלואידי (איור 2B) ואת שמן ה-MMC לספסל הנקי ומעקרים אותם על ידי הקרנה אולטרה סגולה למשך 30 דקות לפני השימוש.
    הערה: לפרטים של מחבר מהיר A, בקבוק מגיב, שמן MMC ושבב מיקרופלואידי מתייחסים לטבלת החומרים.
  3. התקנת השבב המיקרופלואידי
    1. פתחו את דלת תא הפעולה (איור 2A) והרימו את בדיקת הסיבים האופטיים.
    2. יישרו את חורי השדה החשמלי עם מחטי השדה החשמלי והניחו בעדינות את השבב על מעמד השבב. לאחר מכן הכנס את שתי עמודות המיקום לתוך חורי המיקום והניח את בדיקת הסיבים האופטיים (איור 2D).
    3. חבר את המחבר המהיר A על השבב ליציאה המתאימה של MMC בהתאם למספר המיקום (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  4. יש לחדש את שמן ה-MMC (לכ-80 מ"ל) בבקבוק השמן ולרוקן את נוזל הפסולת בבקבוק הפסולת לפני השימוש.
    הערה: נוזל הפסולת הוא בדרך כלל פסולת אורגנית. יש לעיין בחוקים וברגולציה האזוריים בעת הסילוק, בכפוף לשינויים המבוססים על מערך ניסיוני.

3. מדידת עקומת גדילה ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות להכנת לוריא-ברטאני (LB) בינוני ואוטוקלב בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: רכיבים של מדיום LB: NaCl (10 גרם/ליטר), תמצית שמרים (5 גרם/ל') וטריפטון (10 גרם/ל' ).
    2. מוציאים את זן E. coli MG1655 ממלאי הגליצרול ומטפחים אותו בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל בינוני של LB באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5-8 שעות.
      הערה: זמן הטיפוח תלוי בזנים הספציפיים. זה אופטימלי לטפח את הזן לתקופה / שלב לוגריתמי.
    3. דיללו את תמיסת E. coli MG1655 בתרבית עם מדיום טרי ל-OD600 של 0.05-0.1 כדי לקבל תמיסת חיידקים ראשונית (הכינו כ-10 מ"ל).
  2. לחץ על אתחול כדי לאתחל את MMC. לאחר הופעת ממשק האתחול, הגדר את טמפרטורת הטיפוח כ- 37 °C ואת ערך האות הפוטואלקטרי כ- 0.6 (איור 3A). האתחול ייקח כ-20 דקות.
  3. הפעל את מנורת ה- UV (אורך גל 254 ננומטר) במהלך האתחול.
  4. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית ושמן MMC לבקבוק הריאגנטים.
    1. מוציאים בקבוק ריאגנט מעוקר על הספסל הנקי ומהדקים את הפקק.
    2. השתמש במזרק סטרילי 10 מ"ל כדי להזריק 3-5 מ"ל של שמן MMC ממחט המזרק של הצינור הצדדי. הטו וסובבו את בקבוק הריאגנטים באיטיות כדי לגרום לשמן לחדור באופן מלא לדופן הפנימית.
    3. להזריק כ 5 מ"ל של תמיסת חיידקים ראשונית, ולאחר מכן למלא את בקבוק המגיב על ידי הזרקת 5-7 מ"ל של השמן שוב.
    4. שלפו את המחבר המהיר העצמאי A, והכניסו את המחבר המהיר A של בקבוק המגיב למחבר המהיר B כדי להשלים את פעולת הזרקת הדגימה (איור 4A).
  5. המתן עד שהאתחול יסתיים ולאחר מכן כבה את מנורת ה- UV (אורך גל של 254 ננומטר).
  6. פתח את דלת תא הניתוח, והכניס את בקבוק המגיבים לאמבטיית המתכת.
  7. שלף את מחבר C2 של השבב ואת המחבר המהיר A של בקבוק המגיב. חבר את מחבר הצינור הצדדי של בקבוק המגיב למחבר C2 ואת מחבר הצינור העליון למחבר O2. לאחר מכן סגרו את דלת תא הניתוח.
  8. לחץ על עקומת גדילה כדי לבחור את הפונקציה של מדידת עקומת גדילה (איור 3A). בממשק הגדרת הפרמטרים, הזן את המספר כ- 15, הפעל את מתג זיהוי ה- OD והגדר את אורך הגל כ- 600 ננומטר. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 10 דקות.
    הערה: כאן, מספר מתייחס למספר הטיפות שיש ליצור. אורך גל מתייחס לאורך הגל של ה-OD שיש לזהותו. הגדר את המספר (מקסימום 200) ואת אורך הגל (350-800 ננומטר) בהתאם לדרישות הניסוי.
  9. כאשר חלון קופץ מופיע בממשק הראשי המבקש "הסר את בקבוק המגיבים בין C2 ל- O2, לחץ על לחצן אישור לאחר השלמתו", פתח את דלת תא הפעולה כדי להוציא את בקבוק המגיב ולחבר את מחברי C2 ו- O2.
  10. סגור את הדלת ולחץ על הלחצן אישור בחלון הקופץ כדי לטפח באופן אוטומטי את הטיפות ולזהות את ערכי ה- OD.
    הערה: ה- MMC מזהה את ערך ה- OD כאשר הטיפה עוברת את בדיקת הסיבים האופטיים. לכן, תקופת הגילוי תלויה במספר הטיפות שנוצרו.
  11. כאשר עקומת הגדילה מגיעה לשלב הנייח, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD. בחר את נתיב שמירת הנתונים וייצא את ערך ה- OD שנרשם במהלך תקופת הטיפוח בתבנית .csv, אשר ניתן לפתוח על-ידי תוכנה מתאימה (לדוגמה, Microsoft Excel). לאחר מכן השתמש בתוכנת מיפוי (לדוגמה, EXCEL ו- Origin 9.0) כדי להתוות את עקומת הגדילה.
    הערה: במהלך תהליך הטיפוח, ניתן ללחוץ על ייצוא הנתונים בכל עת כדי לייצא את נתוני OD של כל הטיפות הנוכחיות.

4. אבולוציה אדפטיבית ב-MMC

  1. הכנה לתמיסת חיידקים ראשונית
    1. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי להכין את התווך הנוזלי המיוחד ואת הלוחות המוצקים עבור MeSV2.2 ואת autoclave ב 121 °C (74 °F) למשך 15 דקות.
      הערה: עבור הרכיבים של המדיום המיוחד עיין בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
    2. טפחו את MeSV2.2 באמצעות הלוח המוצק (קוטר = 90 מ"מ) באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר מכן בחרו מושבה עצמאית וטפחו אותה בבקבוקון שייק של 50 מ"ל עם 10 מ"ל של המדיום הנוזלי המיוחד באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.
    3. דיללו את תמיסת MeSV2.2 המתורבתת עם המדיום ל-OD600 של 0.1-0.2 (ודא שהנפח הכולל אינו פחות מ-10 מ"ל) והמשיכו לטפח אותה בבקבוק השייק במשך 5 שעות כדי להשיג את תמיסת החיידקים הראשונית.
      הערה: MeSV2.2 הוא זן E. coli חיוני למתנול. המדיום הנוזלי המיוחד מכיל 500 מילימול/ל' מתנול, המהווה עקה חזקה עבור MeSV2.2, וכתוצאה מכך צמיחה איטית מאוד. שימו לב שהשגת תמיסת החיידקים הראשונית כאן שונה מזו המתוארת בשלב 3.1.
  2. אתחל את ה-MMC כמוסבר בשלבים 3.2, 3.3 ו-3.5.
  3. מוציאים שני בקבוקי ריאגנט מעוקרים, שאחד מהם מיועד לתמיסת החיידקים הראשונית והשני מיועד למדיום הטרי. הזריקו את תמיסת החיידקים הראשונית (5 מ"ל), מדיום טרי (12-15 מ"ל) ושמן MMC לבקבוקי הריאגנטים כפי שהוסבר בשלב 3.4.
    הערה: מכיוון שאבולוציה אדפטיבית היא תהליך ארוך טווח הכולל תת-גידולים מרובים, אחסן כמה שיותר מדיום טרי ב-MMC. לא ניתן לחדש את המדיום במהלך ריצת הניסוי.
  4. התקינו את שני בקבוקי הריאגנטים ב-MMC כפי שהוסבר בשלב 3.6. התקן את האחד עבור תמיסת החיידקים הראשונית בין מחבר C2 ו- O2 והשני עבור המדיום הטרי בין מחבר C4 ל- O4.
  5. לחצו על ALE כדי לבחור את הפונקציה של אבולוציה אדפטיבית (איור 3B). בממשק הגדרת הפרמטרים, הפעל את המתג זיהוי OD .
  6. הגדר את המספר כ- 50, אורך גל כ- 600 ננומטר, ריכוז כ - 0%, סוג כזמן, פרמטר כ- 30 שעות וחזרות כ- 99. לחץ על התחל כדי להתחיל יצירת טיפות. זה ייקח בערך 25 דקות.
    הערה: כאן, "ריכוז" מתייחס לריכוז המרבי של גורמים כימיים לאבולוציה אדפטיבית. עבור טיפות שונות, ניתן לממש ב- MMC להציג ריכוזים שונים של גורמים כימיים כדי לספק תנאי גדילה שונים. חשב את הריכוזים המוצגים באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-8342
    כאן "C" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים שהוכנסו לטיפות; "a" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C4 ל- O4; "b" מתייחס לריכוז הגורמים הכימיים בבקבוקי המגיבים בין מחבר C6 ל- O6; ו-"i" מתייחס לריכוז הזמין. ישנם שמונה ריכוזים זמינים ב- MMC. מכיוון שלגורם הכימי כאן יש ריכוז יחיד (500 mmol/L מתנול) והוא אחד המרכיבים של המדיום, רק בקבוק מגיב אחד המכיל את הגורם הכימי מותקן כאן, והריכוז מוגדר כ-0%. כתב מתייחס למצב של תת-טיפוח, המחולק לשלושה סוגים: מצב זמן, מצב ערך OD ומצב פלואורסצנציה. הראשון פירושו לטפח את הטיפות למשך זמן קבוע ולאחר מכן תת-טיפוח, בעוד ששני האחרונים האמצעים לטפח את הטיפות לערך OD מוגדר מראש / עוצמת פלואורסצנציה ולאחר מכן תת-טיפוח. פרמטר מתייחס לפרמטר הקשור הנדרש בעת בחירת מצב של תת-טיפוח. חזרות מתייחסות למספר תת-הטיפוחים.
  7. הסר את בקבוק המגיבים הממוקם בין מחבר C2 ל- O2 כפי שמוסבר בשלב 3.8.
  8. שימו לב אם ערכי ה-OD המרביים של הטיפות במהלך כל תקופת טיפוח עלו באופן משמעותי. אם העלייה מתרחשת ועומדת בדרישות הניסוי, לחץ על לחצן ייצוא נתונים כדי לייצא את נתוני ה- OD כפי שמוסבר בשלב 3.9.
    הערה: כאן, תקופת הטיפוח המשני תלויה בפרמטר. לדוגמה, בעת הגדרת סוג כזמן ופרמטר כ- 30 שעות, תקופת הטיפוח המשני היא 30 שעות. במהלך כל תקופת תת-טיפוח, ישנם ערכי ה- OD המרביים של הטיפות. להעריך אם האבולוציה ההסתגלותית עונה על דרישות הניסוי על ידי עלייה של ערכי OD מקסימליים (העלייה תלויה בתהליך הטיפוח בפועל של הזן, למשל, גדל ביותר מ -20%).
    אזהרה: שימו לב אם המדיום הטרי המאוחסן מותש. אם העלייה המשמעותית לא התרחשה גם לאחר שהמדיום מותש, הוציאו את הטיפות הגדלות טוב יותר ובצעו סבב חדש של אבולוציה מסתגלת.
  9. חלץ את טיפות המטרה מה- MMC.
    1. לחצו על כפתור הסינון כדי לבחור את הפונקציה של חילוץ טיפות (איור 3C). בחר באפשרות איסוף , לחץ על מספרי טיפות היעד ולאחר מכן לחץ על אישור.
      הערה: סינון טיפות כולל "לאסוף", "להשליך" ו "לחלץ תמיסת זרעים". "תמיסת זרעים לחלץ" פירושה לאסוף את הטיפות הנותרות13 לאחר פעולת הטיפוח התת-קרקעית.
    2. המתן עד שהחלון הקופץ יבקש, "אנא שלף את המחבר המהיר של CF והכנס אותו לצינור ה- EP". הכניסו את המחבר המהיר של CF לצינור ה-microcentrifuge לאיסוף בהתאם להנחיות התוכנה ולאחר מכן לחצו על אישור (איור 4D).
    3. לאחר 1-2 דקות, ממשק התוכנה יצוץ חלון חדש המבקש, "אנא הכנס את המחבר בחזרה ולחץ על אישור אם סיים". לאחר מכן, הכנס את המחבר המהיר של CF בחזרה ולחץ על אישור כדי לגרום ל- MMC להמשיך לפעול (איור 4D). כאשר טיפת היעד הבאה מגיעה לאתר זיהוי הטיפות, חזור על 4.9.2-4.9.3 כדי לאסוף אותה.
      הערה: לאחר שכל טיפות המטרה נאספו, ה- MMC ימשיך לטפח את הטיפות הנותרות. אם הטיפוח אינו נחוץ, לחץ על עצור כדי לסיים ישירות את הפעולה.
    4. מחלצים את הטיפה באמצעות פיפטה של 2.5 μL, מפילים אותה על צלחת האגרוס בקוטר 90 מ"מ ומפזרים אותה באופן שווה עם מוט התפשטות זכוכית משולש באורך צדדי של 3 ס"מ. לאחר מכן לטפח אותו באינקובטור טמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
    5. בחרו 3-5 מושבות עצמאיות וטפחו אותן בנפרד בצלוחיות שייק 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום טרי באינקובטור רועד (200 סל"ד) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות. עקוב אחר התקנות הסטנדרטיות הקשורות כדי לאחסן את תמיסת החיידקים בתרבית בצינור הגליצרול לניסויים הבאים.

5. נקי מה-MMC

  1. לאחר השלמת הניסוי, לחץ על עצור כדי להפסיק את כל הפעולות. לאחר מכן לחץ על נקה כדי לנקות את השבב והצינורות. זה ייקח בערך 15 דקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

פרוטוקול זה משתמש ב-E. coli MG1655 ובזן MeSV2.2 כדוגמאות להדגמת הטיפוח המיקרוביאלי והאבולוציה האדפטיבית החיונית למתנול עם תפוקה אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה יחסית ב-MMC. מדידת עקומת הגדילה שימשה בעיקר לאפיון גידול מיקרוביאלי. האבולוציה ההסתגלותית נערכה על ידי תת-גידול רציף אוטומטי והוספת ריכוז ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מציג כיצד להשתמש במערכת תרבית המיקרו-טיפות המיקרוביאלית (MMC) כדי לבצע טיפוח מיקרוביאלי אוטומטי ואבולוציה אדפטיבית ארוכת טווח. MMC היא מערכת גידול מיקרוביאלית ממוזערת, אוטומטית ובעלת תפוקה גבוהה. בהשוואה לשיטות ומכשירים קונבנציונליים לטיפוח בתפוקה גבוהה של מיקרוביאל בתפוקה גב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית המרכזית של סין (2018YFA0901500), הפרויקט הלאומי של מכשירים וציוד מדעיים מרכזיים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21627812), ותוכנית המחקר המדעי של יוזמת אוניברסיטת צינגהואה (20161080108). אנו מודים גם לפרופ' ג'וליה א. וורהולט (המכון למיקרוביולוגיה, המחלקה לביולוגיה, ETH ציריך, ציריך 8093, שוויץ) על אספקת זן E. coli החיוני למתנול גרסה 2.2 (MeSV2.2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PVDF filter membraneMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBSterilize the MMC oil
4 °C refrigeratorHaierBCD-289BSWFor reagent storage
AgarBecton, Dickinson and Company214010For solid plate preparation
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean benchBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIFor aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Component of the special medium for MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Software installation and MMC control
Constant temperature incubatorShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balanceOHAUSAR 3130For reagent weighing
EP tubeThermo Fisher1.5 mLFor droplet collection
FeCl3·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing TubeThermo Fisher2.0 mLFor strain preservation
GluconateSigma-AldrichS2054Component of the special medium for MeSV2.2.
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AFor strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization PotSANYO ElectricMLS3020For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotopped420322Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Component of the special medium for MeSV2.2.
MethanolMACKLINM813895Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-IPerforming growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODFor various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODThe oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Component of the special medium for MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponent of the LB medium
Na2HPO4·12H2OGENERAL-REAGENTG10267BComponent of the special medium for MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dishCorning Incorporated90 mmFor the preparation of solid medium
Pipetteeppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLFor liquid handling
Quick connector ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottleLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBSampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flaskUnion-Biotech50 mLFor microbial cultivation
Shaking incubatorShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BFor the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfateSolarbioS8290Component of the special medium for MeSV2.2.
SyringeJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLDraw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needleOUBEL Hardware Store22GInner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigeratorSANYO Ultra-lowMDF-U4086SFor strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometerGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proFor the measurement of OD values
Vitamin B1SolarbioSV8080Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extractOxoid Ltd.LP0021Component of the LB medium
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Component of the special medium for MeSV2.2.

References

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381(2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570(2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508(2018).
  16. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. The introduction of MMC. Wuxi Tmaxtree Biotechnology Co, Ltd. , Available from: http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 (2021).
  17. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  18. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  19. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  20. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  21. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  22. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998(2020).
  23. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  24. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  25. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon